Summary
Este protocolo destina-se a descrever um método para examinar a capacidade de retenção do Ca2 + e Ca2 +- desencadeada mitocondrial inchaço das mitocôndrias isoladas de SH-SY5Y células passo a passo.
Abstract
A produção de ATP por fosforilação oxidativa é a principal função das mitocôndrias. Mitocôndrias em eucariontes superiores também participam citosólico Ca2 + buffer, e a produção de ATP em mitocondrial pode ser mediada por intramitocondrial grátis Ca2 + concentração. Capacidade de retenção do CA2 + pode ser considerada como a capacidade das mitocôndrias de reter cálcio na matriz mitocondrial. Ca2 + pistas intracelulares acumuladas para a permeabilidade da membrana mitocondrial interna, denominado a abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP), menos de 1,5 kDa de peso que leva para o escapamento de moléculas com um molecular. CA2 +-desencadeada mitocôndrias inchaço é usado para indicar a abertura do mPTP. Aqui, descrevemos dois ensaios para examinar a capacidade de retenção do Ca2 + e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial em mitocôndrias isoladas. Depois de certas quantidades de Ca2 + são adicionados, todos os passos podem ser concluídos em um dia e gravados por um leitor de microplacas. Assim, estes dois ensaios simples e eficazes podem ser adoptados para avaliar a Ca2 +-relacionado funções mitocondriais.
Introduction
As mitocôndrias são os principais órgãos celulares para produzir cerca de 95% do ATP usado nas células de mamíferos por fosforilação oxidativa. É relatado que o sequestrado micromolar concentração de Ca2 + pela mitocôndria, a presença de ADP e fosfato inorgânico pode ser usado para fosforilar ADP a síntese de ATP1. Quando a concentração de citosólico Ca2 + vai acima de um limite, a mitocôndria pode absorção Ca2 + rapidamente e efluxo isso lentamente. Assim, as mitocôndrias funcionamento podem influxo o aumento citosólico Ca2 +. Irrelevante para a participação na fosforilação oxidativa, o mitocondrial Ca2 + também participar os sinais de cálcio citosólico e ativar o mecanismo de apoptose mitocondrial induzindo a abertura do mPTP no interno mitocondrial membrana2. Foi amplamente reconhecido que elevação anormal de intracelular Ca2 + pode induzir edema maciça mitocondrial abrindo o mPTP3. Assim, o presente protocolo tem por objetivo avaliar a função mitocondrial através da quantificação da capacidade mitocondrial Ca2 + de retenção e Ca2 +-trigged inchaço mitocondrial.
CA2 + capacidade de retenção é a medição da capacidade das mitocôndrias de cálcio citosólico de captação. As mitocôndrias podem buffer o cálcio citosólico livre e regulam processos celulares de cálcio-dependente pela absorção de cálcio na forma de precipitados inativos. Capacidade prejudicada Ca2 + retenção ocorre em fenômenos de estresse associados com limitação de energia e de4,de doenças neurodegenerativas até5. Mitocôndrias isoladas ou células digitonin-permeabilizado podem ser usadas para identificar a capacidade de Ca2 + de retenção, e a elevada capacidade de acumular Ca2 + por mitocôndrias isoladas com o glutamato additonal e malato não é efectuada pelo procedimento de isolamento mitocondrial6. Uma quantia titulada de digitonin deve ser usada para permeabilize as membranas de plasma de diferentes tipos de células. O sal de hexapotassium de Ca2 +-ligação corante fluorescente verde, uma Ca2 +-impermeant-célula visível luz-excitável indicador sensível, tem sido amplamente utilizado7. CA2 +-ligação verde tintura fluorescente é um indicador de baixa afinidade e usado para mostrar que intracelular livre Ca2 + concentrações continuarem a subir durante a prolongada de estímulos (5 min)8. Este método era menos sensível do que a técnica de filtro radioativo mas foi bastante simplificado. O adicional Ca2 + eleva a fluorescência verde do cálcio e da Ca2 + adopção pelas mitocôndrias retorna a fluorescência de base. Adições sequenciais de Ca2 + foram feitas até as mitocôndrias não conseguiram captação extramitochondrial Ca2 + 9. Um leitor de microplacas de fluorescência pode ser usado para relatar continuamente a fluorescência verde de cálcio.
Após o acúmulo de Ca2 + , mitocôndrias despolarizada, liberado Ca2 + para o meio e começaram a inchar. CA2 +-desencadeada mitocôndrias inchaço é usado para indicar a abertura do mPTP. Microscopia eletrônica e a diminuição da luz absorbância em 540 nm pode ser usado para medir o Ca2 +-desencadeada mitocondrial inchaço10,11. Volume de mitocôndrias pode ser diretamente determinada pelo ângulo frente espalhamento de luz12, onde diminui em absorvância reflete passivo inchaço da matriz mitocondrial.
Aqui, podemos ilustrar a metodologia para examinar a capacidade mitocondrial Ca2 + de retenção e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial em mitocôndrias isoladas de SH-SY5Y de células.
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Protocol
1. isolamento de mitocôndrias
Nota: Todas as soluções e equipamentos devem ser pré-resfriado a 0 - 4 ° C e mantidos no gelo.
- Semente cerca de 3 x 106 SH-SY5Y células por placa de cultura de células de 10 cm. Células de cultura em alta-glicose Dulbecco modificada do meio de águia com 10% de soro bovino fetal, penicilina (100 U/mL)-estreptomicina (100 µ g/mL). Manter a 37 ° C numa incubadora contendo 5% CO2 durante a noite.
Nota: pelo menos 1-2 x 107 SH-SY5Y de células são necessárias para cada ensaio de isolamento. - Retire o meio e lave as células com cerca de 1 mL de PBS frio de gelo em um prato de cultura de célula de 10cm 3 vezes.
- Adicionar novo 1 mL de PBS frio gelo em placa de cultura de células de 10 cm e raspar as células aderentes em um novo tubo de 1,5 mL. Centrifugar 800 x g por 10 min a 4 ° C.
- Durante a centrifugação, prepare-se 5 mL de tampão de isolamento mitocondrial (250 mM sacarose, 10 mM HEPES (ácido de 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazina etanesulfónico), 10 mM KCl, 1,5 mM de MgCl2, 1 mM EDTA) suplementado com 50 μL de estoque de inibidores de protease solução (concentração de x 100; 1 comprimido de EDTA livre dissolvido em 500 µ l do ddH2O).
- Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado com 1 mL de tampão de isolamento mitocondrial. Incube o tubo de 1,5 mL no gelo por 30 min.
- Lise as células suspensas com um homogeneizador de vidro (traços de 15-25) acima e para baixo manualmente no gelo.
Nota: Certifique-se de que não há nenhuma bolha quando as células são homogeneizadas. Contar as células intactas e núcleos exposto pode por microscópio visualmente e confirmar que > 90% célula ruptura já ocorreu. - Transferi o homogeneizado em um tubo de 1,5 mL e centrifugar a 1.000 x g por 5 min a 4 ° C para remover os detritos (núcleos e células intactas remanescentes).
- Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL e centrifugar a 1.000 x g por 5 min 4 ° C.
- Transferir o sobrenadante para um novo tubo e centrifugar 14.000 x g por 15 min 4 ° C.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado que contém mitocôndrias com 1 mL de tampão de isolamento mitocondrial.
- Centrifugue a solução por 15 min a 14.000 x g 4 ° C para precipitar as mitocôndrias.
- A pelota de mitocôndrias resultante deve ser mantida no gelo e resuspended em 50-100 μL KCl media (125 mM KCl, 2 mM K2HPO4, 1 mM MgCl2, 20mm HEPES, glutamato de 5mm, malato de 5mm e 2 a rotenona μM, pH 7,4 de acordo com o volume de sedimento antes de qualquer rabo) Ay.
- Use 5 μL de solução mitocondrial para medir a concentração de proteína mitocondrial por padrão ensaio BCA, OD562 de medição usando um leitor de placa13.
2. determinação da mitocondrial Ca2 + capacidade de retenção
- Preparar a mídia de KCl e adicionar o Ca2 +-ligação corante fluorescente verde a uma concentração final de 0,5 μM antes do experimento.
- Transferir 1 mL de mitocôndrias isoladas (0,4 mg/mL) em mídia de KCl contendo 0,5 μM Ca2 +-ligação corante fluorescente verde em cada placa de 6 bem.
- Incubar as mitocôndrias e o Ca2 +-ligação corante fluorescente verde na placa 6-poços em temperatura ambiente protegida da luz ambiente para 1 min. Adicione 4 alíquotas μL de uma solução de CaCl2 (20 mM CaCl2, 127 mM KCl, 1 mM MgCl2 de 20 mM 20 mM HEPES, glutamato de 5mm, malato de 5 mM, pH 7,4) para cada placa de 6 bem usando o automático dispensa configuração apresentar 200 nmol Ca2 +/ mg proteína mitocondrial.
- Usar um espectrômetro de fluorescência para monitorar as alterações de fluorescência cada 3 s por 2 min, com um comprimento de onda de excitação de 506 nm e um comprimento de onda de emissão de 531 nm. A placa é equipada com tremendo a 600 rpm por 3 s entre leituras controlada por software (Figura 1).
- Adicionar a alíquota adicional 4 μL da solução de CaCl2 de 20 mM a cada poço e monitorar as mudanças de fluorescência cada 3 s por 2 min. Repita este passo até que a fluorescência aumenta com o tempo.
Nota: As mitocôndrias são desafiadas com o adicionado Ca2 + indicado por fluorescência o aumento de gravação. Quando o mPTP abre, a fluorescência aumenta com o tempo. - Interprete a quantidade total de Ca2 + adicionado até o mPTP abre como a capacidade de Ca2 + de retenção.
3. determinação de Ca 2 +-induzido por inchaço mitocondrial
- Prepare a mídia de KCl antes do experimento.
- Transferi 1 mL de mitocôndrias isoladas (0,4 mg/mL) em mídia de KCl para cada placa de 6 bem.
- Adicione 10 μL de solução aquosa de CaCl2 (500 nmol/mg de proteína mitocondrial) de 20 mM em proteína mitocondrial para acionar o inchaço mitocondrial.
- Gravar a diminuição da absorbância em 540 nm cada 3 s em um leitor de microplacas controlado por software para 10 min (Figura 2). As alterações de fluorescência são causadas por um afluxo de solutos através da membrana mitocondrial interna.
Nota: A diminuição da absorbância em 540 nm corresponde à mitocôndria inchadas. Se o leitor não observar uma diminuição na absorção, um longo intervalo de leitura ou tempo de leitura pode ser adotado.
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Representative Results
Resultados de representante de Ca2 + capacidade de retenção:
Os resultados foram expressos em valores de fluorescência. Com os pulsos adicionais de Ca2 + (proteína mitocondrial nmols/mg 200), a fluorescência aumentada o dobro acima da linha de base com a abertura do mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), um inibidor de Ca2 +-induzida mPTP abertura, ou 1 μM atractyloside (ATR), um ativador de Ca2 +-induzida mPTP abertura, foram adicionados em mitocôndrias isoladas. A quantidade de total adicionado Ca2 + até mPTP abertura indicada por um duplo aumento acima da fluorescência de base foi interpretada como capacidade de retenção do Ca2 + . Nossos dados mostraram que o mitocondrial Ca2 + capacidade de retenção no tratamento BKA era muito maior do que no grupo ATR. Estes dados confirmaram a medida adequada da mitocondrial Ca2 + capacidade de retenção (Figura 3).
Resultados de representante de Ca2 +-induzido por inchaço mitocondrial:
Os resultados foram expressos em variações percentuais em absorbância a 540 nm contra absorvância inicial durante um período de 10 min após a adição de CaCl2. Provocado pela adição de Ca2 + (proteína mitocondrial nmol/mg 500), a diminuição da absorvância monitorizada a 540 nm indicado os inchaços mitocondriais. Com o tratamento da BKA ou ATR, a curva de calibração mostrou uma diminuição de ligeira ou cortantes comparada a absorvância inicial, indicando que o BKA pode inibir mPTP abertura enquanto ATR pode facilitar o mPTP abertura (Figura 4).
Figura 1: as configurações de software para mitocondrial Ca2 + retenção capacidade ensaio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: as configurações de software para mitocondrial Ca2 +-disparado o ensaio de inchamento mitocondrial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A medição da capacidade de retenção do Ca2 + . Extramitocondrial Ca2 + em mitocôndrias isoladas foi medido fluorometrically com a Ca2 +-ligação verde tintura fluorescente na presença de 5 μM bongkrekate (BKA), 1 atractyloside μM (ATR) ou em branco controle (CON). Vestígios de Ca2 + retenção por mitocôndrias isoladas com BKA, ATR e CON foram medidos em 506 nm (Ex) e 531 nm (Em) em um leitor de microplacas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A medida de Ca2 +-induzido por inchaço mitocondrial. CA2 +-inchaço mitocondrial induzida de SH-SY5Y na presença de 5 μM bongkrekate (BKA), 1 atractyloside μM (ATR) ou em branco controle (CON) foi expressa como uma curva de calibração diminuição da percentagem da absorvância inicial a 540 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficaz para o mitocondrial Ca2 + retenção capacidade do ensaio e Ca2 +-disparado o ensaio de inchamento mitocondrial.
Para o isolamento mitocondrial, certifique-se de que todos os materiais e os tubos são no gelo, especialmente quando homogeneizando as células. 0,25% do trypsin-EDTA também pode ser usado para destacar células do prato por 5 min a 37 ° C. Depois de 15-25 cursos, é necessário observar a membrana celular intacta ao microscópio e evitar a ruptura da membrana mitocôndria. No entanto, as mitocôndrias isoladas que obtivemos são mitocôndrias brutas e mitocôndrias purificadas podem ser obtidas através de 1,0 M / 1.5 m gradiente descontínuo de sacarose. As características biológicas de mitocôndrias em células vivas são mais como aquelas na vivo do que em mitocôndrias isoladas devido as concentrações dos componentes do médios que cercam as mitocôndrias. A capacidade mitocondrial Ca2 + de retenção ou Ca2 +-desencadeado ensaio de inchamento mitocondrial foi determinado em condições energizadas. Para determinação do funcionamento mitocôndrias, succinato de 5 mM pode ser adicionado como substratos respiratórios em vez de glutamato e malato6.
CA2 +-ligação corante verde fluorescente (vincula Ca2 + com uma afinidade de 4,29 ± 0,67 mM), é mais adequado para medir concentrações micromolar de Ca2 + do que maior afinidade corantes, como o fura-2 7. Após a adição do Ca2 +-ligação corante verde fluorescente, a incubação deve ser menos de 240 s. adições sucessivas de Ca2 + (variando de 25-200 nmol) foram injetadas com intervalos de 1-3 min. As curvas de calibração mostram as concentrações de Ca2 + que as mitocôndrias são incapazes de sequestrar, indicando a absorção mitocondrial de pulsos de Ca2 +. Caso contrário, o Ca2 +-ligação verde tintura fluorescente também foi usada em investigações, como intracelular livre Ca2 + medição das concentrações, seguir Ca2 + influxo e liberação e excitação do multiphoton de sinalização de cálcio imagem de Ca2 + em tecidos vivos.
Para determinação de Ca2 + -induzido por inchaço mitocondrial, inchaço também pode ser induzido com a adição de 200 mM ATR e CaCl2. Como um controle, mitocôndrias poderiam ser incubadas com 1 mM CsA por 5 min antes da medição, que inibiu o mPTP abrindo. Pesquisas anteriores mostraram as curvas de calibração de absorvância em função da percentagem de mitocôndrias inchadas14. Foi relatado que 1 mM, CsA, vermelho de rutênio de 0,1 mM, e um volume igual de mitocôndrias frescos (0,5 mg/mL) pode ser adicionado na reação quando o inchaço estava completo. Porque CsA e rutênio vermelho podem inibir o mPTP abertura nas mitocôndrias recentemente adicionadas, as curvas de calibração indicam tanto a mitocôndria inchadas e mitocôndrias não-inchado15. O protocolo de inchaço mitocondrial após a sobrecarga de Ca2 + também é uma medida eficaz e directa de Ca2 +-induzido mPTP abertura.
Desde a descoberta do transporte de Ca2 + por mitocôndrias de mamíferos e outros vertebrados superiores, há mais de 50 anos, tem havido muita pesquisa sobre os mecanismos e funções de efluxo de cálcio mitocondrial e influxo. Mitocondrial Ca2 + absorção mecanismos de contem o Ca2 + uniporter mitocondrial, o modo rápido ou RaM e o ryanodine receptor (mRyR)16. Os ensaios que descrevemos acima pode avaliar Ca2 +-relacionado a função mitocondrial, simples e eficaz.
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Disclosures
X. sol supervisionou os experimentos. Li Wei realizados os experimentos. Zhang Chen e X. sol escreveu o jornal.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado por concessões do subsídio do cientista proeminente de Shandong (JQ201421) e bolsa da NSFC (81371226).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | ATCC (The Global Bioresource Center) | ATCC Number: CRL-2266 | |
| Calcium green-5N | Life Technologies | c-3737 | Ca2+-binding green fluorescent dye |
| complete protease inhibitors | Roche Molecular Biochemicals | 4693116001 | |
| glass homogenizer | Kimble Chase | 9885303002 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | RES5063G-A7 | |
| malate | Sigma-Aldrich | 46940-U | |
| rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 00457 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | V900050 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | V900266 | |
| Varioskan flash instruments | Thermo Scientific | IC100E | |
| Bongkrekate | Biovision | 1820-100 | |
| atractyloside | Sigma-Aldrich | C4992 | |
| high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium | Hyclone | SH30022 | 4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate |
| fetal bovine serum | Hyclone | SV30087 | |
| penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| streptomycin | Invitrogen | 11860-038 | |
| BCA assay kit | Thermo Scientific | NCI3225CH | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| 10 cm cell culture dish | NEST | 704001 |
References
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