Mitochondriale Ca^{2 +} retentie capaciteit Assay en Ca^{2 +}-mitochondriale zwelling Assay geactiveerd

Summary

Dit protocol is gericht op het beschrijven van een methode om te onderzoeken of het Ca^{2 +} retentie capaciteit en Ca^{2 +}- geactiveerd mitochondriale zwelling van geïsoleerde mitochondria van SH-SY5Y cellen stapsgewijze.

Abstract

De productie van ATP door oxidatieve fosforylatie is de primaire functie van de mitochondriën. Mitochondriën in hogere eukaryoten ook deelnemen aan cytosolische Ca^{2 +} bufferen en de ATP productie in mitochondriale kan worden bemiddeld door intramitochondrial gratis Ca^{2 +} concentratie. CA^{2 +} retentie capaciteit kan worden beschouwd als het vermogen van de mitochondriën te behouden van calcium in de mitochondriale matrix. Geaccumuleerde intracellulaire Ca^{2 +} leidt tot de doorlaatbaarheid van de innerlijke mitochondriale membraan, genoemd de opening van mitochondriale permeabiliteit overgang porie (mPTP), die leidt tot het weglekken van moleculen met een moleculair gewicht van minder dan 1,5 kDa. CA^{2 +}-mitochondriën zwelling wordt gebruikt om aan te geven van de opening van de mPTP geactiveerd. Hier beschrijven we twee testen om te controleren de Ca^{2 +} retentie capaciteit en Ca^{2 +}-mitochondriale zwelling in geïsoleerde mitochondriën geactiveerd. Na bepaalde hoeveelheden van Ca^{2 +} worden toegevoegd, kunnen alle stappen worden voltooid in één dag en geregistreerd door een microplate-lezer. Dus, deze twee eenvoudige en effectieve testen kunnen worden vastgesteld om te beoordelen de Ca^{2 +}-mitochondriale functies.

Introduction

Mitochondriën zijn de belangrijkste cellulaire organen te produceren bijna 95% van de ATP in de cellen van zoogdieren gebruikt door oxidatieve fosforylering. Het is gemeld dat de afgezonderd micromolar concentratie van Ca^{2 +} door de mitochondriën, de aanwezigheid van ADP en anorganisch fosfaat kan worden gebruikt om phosphorylate ADP op¹ATP synthese. Wanneer de concentratie van cytosolische Ca^{2 +} boven een drempel gaat, mitochondriën kunnen opname Ca^{2 +} snel en efflux het langzaam. Zo kunnen de functionerende mitochondriën toestroom de verhoogde cytosolische Ca^{2 +}. Irrelevant voor de deelname aan de oxidatieve fosforylatie, de mitochondriale Ca^{2 +} ook deelnemen aan de cytosolische calcium-signalen en het mechanisme van de mitochondriale apoptotic activeren door de opening van de mPTP in de binnenste mitochondriale inducerende membraan². Het is algemeen erkend dat een abnormale verhoging van de intracellulaire Ca^{2 +} mitochondriale enorme zwelling veroorzaken kan door het openen van de mPTP-³. Dus, dit protocol heeft tot doel te beoordelen van de mitochondriale functie door het kwantificeren van de mitochondriale Ca^{2 +} retentie capaciteit en Ca^{2 +}-trigged mitochondriale zwelling.

CA^{2 +} retentie capaciteit is de meting van het vermogen van de mitochondriën om opname cytosolische calcium. Mitochondriën kunnen buffer het cytosolische vrij calcium en calcium-afhankelijke cellulaire processen regelen door opname van de calcium in de vorm van inactieve precipitaten. Verminderde Ca^{2 +} retentie capaciteit treedt op in stress verschijnselen die is gekoppeld aan de beperking van de energie en zelfs neurodegeneratieve ziekten^4,5. Geïsoleerde mitochondriën of digitonin-permeabel cellen kunnen worden gebruikt voor identificatie van de Ca^{2 +} retentie capaciteit, en de verhoogde capaciteit om te accumuleren Ca^{2 +} door geïsoleerde mitochondriën met de additonal glutamaat en malate wordt niet verricht door de mitochondriale isolatie procedure⁶. Een bepaalde hoeveelheid digitonin moet worden gebruikt om de permeabilize van de plasma-membranen van verschillende celtypes. Het hexapotassium zout van Ca^{2 +}-bindende groen fluorescente kleurstof, een Ca^{2 +}-gevoelige cel-impermeant zichtbaar licht-prikkelbaar indicator, gebruikte⁷is geweest. CA^{2 +}-bindende groen fluorescente kleurstof is een indicator van de lage-affiniteit en gebruikt om te tonen dat intracellulaire gratis Ca^{2 +} concentraties stijgen blijven tijdens langdurige (5 min) stimulaties⁸. Deze methode is minder gevoelig dan de radioactieve filter techniek maar werd sterk vereenvoudigd. De extra Ca^{2 +} calcium groene fluorescentie verheft en de Ca^{2 +} ICT door mitochondriën retourneert de fluorescentie op basislijn. Opeenvolgende toevoegingen van Ca^{2 +} aangebracht totdat de mitochondriën niet opname extramitochondrial Ca^{2 + 9}. Een fluorescentie microplate lezer kan worden gebruikt om voortdurend verslag de calcium groene fluorescentie.

Na Ca^{2 +} accumulatie, mitochondriën depolarized, vrijgegeven Ca^{2 +} in het medium, en begon te zwellen. CA^{2 +}-mitochondriën zwelling wordt gebruikt om aan te geven van de opening van de mPTP geactiveerd. Elektronenmicroscopie en de daling lichtabsorptie bij 540 nm kan worden gebruikt voor het meten van de Ca^{2 +}-geactiveerd mitochondriale zwelling^10,11. Volume van de mitochondriën kan rechtstreeks worden bepaald door de voorwaartse hoek lichtverstrooiing¹², waar de dalingen van de extinctie passieve zwelling van de mitochondriale matrix reflecteren.

Hier, we illustreren de methodologie te onderzoeken van de mitochondriale Ca^{2 +} retentie capaciteit en Ca^{2 +}-mitochondriale zwelling in geïsoleerde mitochondriën van de cellen van de SH-SY5Y geactiveerd.

Protocol

1. isolatie van Mitochondria

Opmerking: Alle oplossingen en apparatuur moeten worden precooled op 0 - 4 ° C en op ijs.

1. Zaad ongeveer 3 x 10⁶ SH-SY5Y cellen per 10 cm cel cultuur schotel. Cultuur cellen in hoge-glucose Dulbecco gewijzigd van Eagle medium met 10% foetale runderserum, penicilline (100 U/mL)-streptomycine (100 µg/mL). Handhaven bij 37 ° C in een broedstoof met 5% CO₂ 's nachts.
   Opmerking: ten minste 1-2 x 10⁷ SH-SY5Y cellen zijn nodig voor elke isolatie assay.
2. Verwijder het medium en de cellen met ongeveer 1 mL ijs koud PBS in een 10 cm schotel voor de cultuur van de cel 3 keer wassen.
3. Voeg nieuwe 1 mL ijs koud PBS in 10 cm cel cultuur schotel en schraap de Adherente cellen in een nieuwe 1,5 mL-buis. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
4. Tijdens het centrifugeren, bereiden 5 mL mitochondriale isolatie buffer (250 mM sacharose, 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic zuur), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA) aangevuld met 50 μl van protease remmers voorraad oplossing (100 x concentratie; 1 EDTA-gratis tablet opgelost in 500 µL van ddH₂O).
5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met 1 mL van mitochondriale isolatie buffer. Incubeer de 1,5 mL-buis op ijs gedurende 30 minuten.
6. Lyse de zwevende cellen met een glas homogenizer (15-25 strokes) op en neer handmatig op ijs.
   Opmerking: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen cellen worden gehomogeniseerd. Tellen de onbeschadigde cellen en bared kernen Microscoop visueel en bevestigen dat > 90% cel breuk is opgetreden.
7. Breng het homogenaat in een tube 1,5 mL en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C tot het verwijderen van het puin (kernen en resterende intact cellen).
8. Breng de bovendrijvende substantie in een nieuwe 1,5 mL-buis en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min 4 ° C.
9. Het supernatant overbrengen in een nieuwe buis en centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 15 min 4 ° C.
10. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met mitochondriën met 1 mL van mitochondriale isolatie buffer.
11. Centrifugeer de oplossing gedurende 15 minuten staan bij 14.000 x g 4 ° C om het neerslaan van de mitochondriën.
12. De resulterende mitochondriën pellet moet worden bewaard op ijs en geresuspendeerde in 50-100 μl KCl media (125 mM KCl, 2 mM K₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 20 mM HEPES, 5 mM glutamaat, 5 mM malate, en 2 μM rotenon, pH 7.4) volgens het volume van het pellet vóór elke kont ay.
13. Gebruik 5 μL van mitochondriale oplossing om te meten de mitochondriale eiwitconcentratie door standaard BCA assay, OD562 meten met behulp van een plaat lezer¹³.

2. bepaling van mitochondriale Ca^{2 +} retentie capaciteit

1. Voorbereiden van de KCl-media en voeg de Ca^{2 +}-groen fluorescente kleurstof binden aan een eindconcentratie van 0,5 μM voordat het experiment.
2. 1 ml van geïsoleerde mitochondriën (0,4 mg/mL) in KCl media met 0,5 μM Ca^{2 +}-bindende groen fluorescente kleurstof in elke plaat 6-well goed.
3. Incubeer de mitochondriën en het Ca^{2 +}-bindende groen fluorescente kleurstof in de 6-well plaat bij kamertemperatuur beschermd tegen omgevingslicht voor 1 min. 4 toevoegen μL aliquots van een 20 mM CaCl₂ oplossing (20 mM CaCl₂, 127 mM KCl, 1 mM MgCl₂ 20 mM HEPES, 5 mM glutamaat, 5 mM-malaat, pH 7.4) aan elke plaat 6-well goed met behulp van de automatische instelling om 200 nmol Ca^{2 +}/mg-mitochondriale eiwit afzien.
4. Gebruik een fluorescentie spectrometer om te controleren de fluorescentie wijzigingen elke 3 s gedurende 2 minuten met een golflengte van excitatie van 506 nm en een golflengte van de emissie van 531 nm. De plaat is voorzien van schudden bij 600 omwentelingen per minuut voor 3 s tussen lezingen gecontroleerd door software (Figuur 1).
5. Toevoegen van een extra 4 μL hoeveelheid 20 mM CaCl₂ oplossing aan elk putje en controleren van de fluorescentie wijzigingen elke 3 s voor 2 min. Herhaal deze stap totdat de fluorescentie toeneemt met de tijd.
   Opmerking: De mitochondriën worden uitgedaagd met de toegevoegde Ca^{2 +} aangegeven door de verhoogde opname fluorescentie. Wanneer de mPTP wordt geopend, wordt de fluorescentie met tijd verhoogt.
6. Het interpreteren van het totale bedrag van Ca^{2 +} toegevoegd totdat de mPTP wordt geopend als de Ca^{2 +} retentie capaciteit.

3. bepaling van Ca ^{2 +}-geïnduceerde mitochondriale zwelling

1. Bereiden de KCl media voordat het experiment.
   1. Breng 1 mL van geïsoleerde mitochondriën (0,4 mg/mL) in KCl media in elke plaat 6-well goed.
2. Voeg 10 μL van 20 mM CaCl₂ waterige oplossing (500 nmol/mg mitochondriale eiwit) in mitochondriale eiwitten mitochondriaal zwelling activeren.
3. Opnemen van de afname van de absorptie bij 540 nm elke 3 s op een microplate-lezer gecontroleerd door software voor 10 min (Figuur 2). De fluorescentie veranderingen worden veroorzaakt door een toestroom van opgeloste stoffen over het mitochondriaal binnenste membraan.
   Opmerking: De verminderde absorptie bij 540 nm komt overeen met de gezwollen mitochondriën. Als de lezer niet dat een afname van de absorptie ziet doet, kan een langer interval lezen of lezen van tijd worden aangenomen.

Representative Results

De resultaten van de vertegenwoordiger van Ca^{2 +} retentie capaciteit:
Resultaten werden uitgedrukt als fluorescentie waarden. Met de extra pulsen van Ca^{2 +} (200 nmols/mg mitochondriale eiwit), de fluorescentie stegen met dubbele boven basislijn met de opening van de mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), een inhibitor van de omwenteling van Ca^{2 +}-geïnduceerde mPTP opening, of 1 μM atractyloside (ATR), een activator van Ca^{2 +}-geïnduceerde mPTP opening, werden toegevoegd in geïsoleerde mitochondriën. Het bedrag van de totale toegevoegde Ca^{2 +} totdat mPTP opening door een dubbele verhoging boven de basislijn fluorescentie aangegeven werd geïnterpreteerd als Ca^{2 +} retentie capaciteit. Onze gegevens bleek dat de mitochondriale Ca^{2 +} retentie capaciteit in BKA behandeling veel hoger dan die in ATR groep. Deze gegevens bevestigd de geschikte meting van mitochondriale Ca^{2 +} retentie capaciteit (Figuur 3).

Vertegenwoordiger resultaten van Ca^{2 +}-geïnduceerde mitochondriale zwelling:
Resultaten werden uitgedrukt als percentage veranderingen in absorptie bij 540 nm versus eerste extinctie gedurende een periode van 10 min na toevoeging van CaCl₂. Geactiveerd door toevoeging van Ca^{2 +} (500 nmol/mg mitochondriale eiwit), de verminderde absorptie gecontroleerd bij 540 nm aangegeven de mitochondriale zwellingen. Met de behandeling van BKA of ATR toonde de kalibratiekromme een lichte of scherpe daling ten opzichte van eerste absorptie, die aangeeft dat BKA mPTP openen terwijl ATR kan vergemakkelijken de mPTP openen (Figuur 4) kan remmen.

Figuur 1: de software-instellingen voor mitochondriale Ca^{2 +} retentie capaciteit assay. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: de software-instellingen voor mitochondriale Ca^{2 +}-geactiveerd mitochondriale zwelling assay. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: Het meten van Ca^{2 +} retentie capaciteit. Extra-mitochondriale Ca^{2 +} in geïsoleerde mitochondriën werd gemeten fluorometrically met de Ca^{2 +}-bindende groen fluorescente kleurstof in aanwezigheid van 5 μM bongkrekate (BKA), 1 μM atractyloside (ATR) of blanco-controle (CON). Sporen van Ca^{2 +} retentie door geïsoleerde mitochondriën met BKA, ATR en CON werden gemeten op 506 nm (Ex) en 531 nm (Em) op een microplate-lezer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: Het meten van Ca^{2 +}-geïnduceerde mitochondriale zwelling. CA^{2 +}-geïnduceerde mitochondriale zwelling van de SH-SY5Y in aanwezigheid van 5 μM bongkrekate (BKA), 1 μM atractyloside (ATR) of blanco-controle (CON) werd uitgedrukt als een percentage verminderde ijkkromme van de initiële absorptie bij 540 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Hier, beschreven we een eenvoudige en effectieve protocol voor de mitochondriale Ca^{2 +} retentie capaciteit assay en Ca^{2 +}-mitochondriale zwelling assay geactiveerd.

Voor de mitochondriale isolatie, door ervoor te zorgen dat alle materialen en buizen op ijs, zijn met name wanneer de cellen homogenisatie. 0,25% trypsine-EDTA kan ook worden gebruikt om het loskoppelen van de cellen van de schotel voor 5 minuten bij 37 ° C. Na 15 tot 25 lijnen is het noodzakelijk om te observeren de intact celmembraan onder de Microscoop en te voorkomen dat de breuk van het membraan van de mitochondriën. Echter, de geïsoleerde mitochondriën die we verkregen zijn ruwe mitochondriën en gezuiverde mitochondriën kunnen worden verkregen door middel van 1,0 M / 1.5M discontinue sacharose verloop. De biologische kenmerken van mitochondriën in levende cellen lijken meer op die in vivo dan in geïsoleerde mitochondriën vanwege de concentraties van de middellange componenten die de mitochondriën omringen. De mitochondriale Ca^{2 +} retentie capaciteit of Ca^{2 +}-geactiveerde mitochondriale zwelling assay werd bepaald onder omstandigheden die energiek. Voor bepaling van functionerende mitochondriën, kan 5 mM-succinaat worden toegevoegd als respiratoire substraten in plaats van glutamaat en malate⁶.

CA^{2 +}-bindende groen fluorescente kleurstof (bindt Ca^{2 +} met een affiniteit voor 4,29 ± 0,67 mM), is meer geschikt voor het meten van micromolar concentraties van Ca^{2 +} dan hogere affiniteit kleurstoffen zoals fura-2 ⁷. Na toevoeging van de Ca^{2 +}-bindende groen fluorescente kleurstof, de incubatie moet minder dan 240 s. opeenvolgende toevoegingen van Ca^{2 +} (variërend van 25-200 nmol) waren geïnjecteerd met 1-3 min. intervallen. De kalibratiekrommen Toon de concentraties van Ca^{2 +} die de mitochondriën niet in staat zijn te sekwestreren, met vermelding van de mitochondriale opname van pulsen van Ca^{2 +}. Anders, de Ca^{2 +}-bindende groen fluorescente kleurstof werd ook gebruikt in calcium signalering van onderzoeken, zoals intracellulaire gratis Ca^{2 +} meting van de concentratie, volgende Ca^{2 +} toestroom en release en multiphoton excitatie Imaging voor Ca^{2 +} in levende weefsels.

Voor bepaling van Ca^{2 +} -geïnduceerde mitochondriale zwelling, zwelling kan ook worden opgewekt met de toevoeging van 200 mM ATR en CaCl₂. Als een besturingselement, kunnen de mitochondriën worden geïncubeerd met 1 mM CsA gedurende 5 minuten vóór de meting, die de mPTP openen geremd. Eerder onderzoek toonde kalibratiekrommen van absorptie als een functie van het percentage van gezwollen mitochondriën¹⁴. Het werd gemeld dat 1 mM CsA, 0.1 mM ruthenium rood, en een gelijk volume verse mitochondriën (0,5 mg/mL) kan worden toegevoegd in de reactie wanneer zwelling compleet was. Omdat de CsA en ruthenium rode de mPTP openen in het vers toegevoegde mitochondriën remmen kunnen, geven de kalibratiekrommen zowel de gezwollen mitochondriën en niet-gezwollen mitochondriën¹⁵. Het protocol van mitochondriale zwelling op Ca^{2 +} overbelasting is ook een effectieve en directe meting van Ca^{2 +}-geïnduceerde mPTP openen.

Sinds de ontdekking van vervoer van Ca^{2 +} door mitochondria van zoogdieren en andere hogere gewervelde dieren van meer dan 50 jaar geleden, is er veel onderzoek naar de mechanismen en de functies van mitochondriale calcium efflux en toestroom. De mitochondriale Ca^{2 +} opname mechanismen bevatten de mitochondriale Ca^{2 +} uniporter, de snelle modus of RAM-geheugen en de ryanodine receptor (mRyR)¹⁶. De tests die we hierboven kan beschreven evalueren Ca^{2 +}-gerelateerde mitochondriale functie eenvoudig en effectief.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SH-SY5Y cell line	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum	Hyclone	SV30087
penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA assay kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm cell culture dish	NEST	704001