Summary
Este protocolo tiene por objeto describir un método para examinar la capacidad de retención de Ca2 + y Ca2 +- activa hinchazón de mitocondrias aisladas de SH-SY5Y mitocondrial de células paso a paso.
Abstract
La producción de ATP por fosforilación oxidativa es la función principal de las mitocondrias. Las mitocondrias en los eucariotas superiores también participarán en citosólica Ca2 + buffering, y la producción de ATP en mitocondrial puede estar mediada por intramitochondrial gratis Ca2 + concentración. Capacidad de retención de CA2 + puede considerarse como la capacidad de las mitocondrias para retener el calcio en la matriz mitocondrial. Acumulación intracelular Ca2 + lleva a la permeabilidad de la membrana mitocondrial interna, como la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP), que conduce a la salida de moléculas con un molecular peso menos de 1.5 kDa. CA2 +-activa las mitocondrias hinchazón se utiliza para indicar la apertura del mPTP. Aquí, Describimos dos ensayos para examinar la capacidad de retención de Ca2 + y Ca2 +-activa hinchazón mitocondrial en las mitocondrias aisladas. Después de ciertas cantidades de Ca2 + se ha añadido, todos los pasos pueden ser completados en un día y registrados por un lector de microplacas. Por lo tanto, pueden adoptarse estos dos análisis simples y eficaces para evaluar el Ca2 +-relacionadas con las funciones mitocondriales.
Introduction
Las mitocondrias son los principales órganos celulares que producen casi el 95% de la ATP que se utiliza en las células de mamífero por fosforilación oxidativa. Se informó que el secuestrado concentración micromolar de Ca2 + por las mitocondrias, la presencia de ADP y fosfato inorgánico puede utilizarse para fosforilan ADP síntesis ATP1. Cuando la concentración citosólica Ca2 + por encima de un umbral, las mitocondrias pueden absorción de Ca2 + rápidamente y eflujo poco a poco. Así pues, el funcionamiento de la mitocondria puede afluencia el aumento citosólico Ca2 +. Irrelevante para la participación en la fosforilación oxidativa, la mitocondrial Ca2 + también tomar parte en las señales de calcio citosólico y activar el mecanismo de apoptosis mitocondrial al inducir la apertura de la mPTP en el interior mitocondrial membrana2. Ha sido ampliamente reconocida que elevación anormal de Ca intracelular2 + puede inducir inflamación masiva mitocondrial por la apertura del mPTP3. Así, este protocolo tiene como objetivo evaluar la función mitocondrial mediante la cuantificación de la mitocondrial Ca2 + capacidad de la retención y Ca2 +-trigged hinchazón mitocondrial.
Capacidad de retención de CA2 + es la medida de la capacidad de las mitocondrias de calcio citosólico de absorción. Las mitocondrias pueden búfer el calcio libre citosólico y regulan procesos celulares dependientes de calcio por la absorción de calcio en forma de precipitados inactivos. Deterioro capacidad de Ca2 + retención ocurre en fenómenos de estrés asociados con limitación de energía e incluso neurodegenerativas enfermedades4,5. Permeabilized digitonin células o mitocondrias aisladas se pueden utilizar para identificar la capacidad retención de Ca2 + , y la elevada capacidad para acumular Ca2 + por mitocondrias aisladas con el glutamato adicional y malato no es afectada por la Aislamiento mitocondrial procedimiento6. Debe utilizarse una cantidad pretitulada de digitonin a permeabilizar las membranas del plasma de diferentes tipos de células. La sal de hexapotassium de Ca2 +-enlace colorante fluorescente verde, un Ca2 +-indicador excitable luz visible célula impermeant sensible, ha sido ampliamente utilizado7. CA2 +-encuadernación verde colorante fluorescente es un indicador de baja afinidad y se utiliza para mostrar que intracelular libre Ca2 + las concentraciones siguen aumentando durante prolongado (5 min) estímulos8. Este método fue menos sensible que la técnica de filtros radiactivos pero fue simplificado grandemente. El adicional Ca2 + eleva la fluorescencia verde de calcio y la absorción de Ca2 + por mitocondrias devuelve la fluorescencia a línea de fondo. Se hicieron adiciones secuenciales de Ca2 + hasta que la mitocondria no absorción extramitochondrial Ca2 + 9. Un lector de microplacas de fluorescencia puede utilizarse para informar continuamente la fluorescencia verde de calcio.
Después de la acumulación de Ca2 + , mitocondrias despolarizado, liberan Ca2 + en el medio y comenzaron a hincharse. CA2 +-activa las mitocondrias hinchazón se utiliza para indicar la apertura del mPTP. La microscopia electrónica y la disminución ligera absorbancia a 540 nm puede usarse para medir la Ca2 +-activa de10,hinchazón mitocondrial11. Volumen de las mitocondrias puede determinarse directamente adelante ángulo dispersión ligera12, donde disminuye la absorbancia refleja inflamación pasiva de la matriz mitocondrial.
Aquí ilustramos la metodología para examinar la mitocondrial Ca2 + capacidad de la retención y Ca2 +-activa hinchazón mitocondrial en las mitocondrias aisladas de células SH-SY5Y.
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Protocol
1. aislamiento de mitocondrias
Nota: Todas las soluciones y equipos deben preenfriados a 0 - 4 ° C y mantener en hielo.
- Semillas aproximadamente 3 x 106 SH-SY5Y células por placa de cultivo celular de 10 cm. Células en cultivo en alta glucosa Dulbecco de modificado medio de Eagle con 10% suero fetal bovino, penicilina (100 U/mL)-estreptomicina (100 μg/mL). Mantener a 37 ° C en una incubadora con 5% CO2 durante la noche.
Nota: al menos 1-2 x 107 SH-SY5Y células se necesitan para cada ensayo de aislamiento. - Quite el medio y lavar las células con aproximadamente 1 mL de PBS frío de hielo en una placa de cultivo celular de 10 cm 3 veces.
- Agregar nuevo 1 mL de PBS frío de hielo en la placa de cultivo celular de 10 cm y raspar las células adherentes en un nuevo tubo de 1,5 mL. Centrifugar a 800 x g por 10 min a 4 ° C.
- Durante la centrifugación, preparar 5 mL de tampón de aislamiento mitocondrial (250 mM sacarosa, 10 mM HEPES (ácido 4 (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido-(2-hydroxyethyl)-1-piperazina), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA) suplementado con 50 μL de la acción de los inhibidores de la proteasa solución (concentración x 100; 1 tableta libre de EDTA disuelto en 500 μl de ddH2O).
- Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado con 1 mL de tampón de aislamiento mitocondrial. Incubar el tubo de 1,5 mL en hielo durante 30 minutos.
- Lyse las células suspendidas con un homogeneizador de vidrio (15-25 golpes) hacia arriba y hacia abajo manualmente en el hielo.
Nota: Asegúrese de que no hay burbujas cuando las células están homogeneizadas. Contar las células intactas y núcleos desnudos por microscopio visualmente y confirmar que > se ha producido rotura de la célula de 90%. - Transferir el homogeneizado en un tubo de 1.5 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a 4 ° C para eliminar los desechos (núcleos y células intactas restantes).
- Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1.5 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 5 min 4 ° C.
- Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo y centrifugar a 14.000 g x 15 min 4 ° C.
- Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado que contiene mitocondrias con 1 mL de tampón de aislamiento mitocondrial.
- Centrifugue la solución durante 15 min a 14.000 x g 4 ° C para precipitar las mitocondrias.
- El sedimento resultante de las mitocondrias debe mantenerse en hielo y resuspendió en 50-100 μL KCl media (125 mM KCl, 2 mM K2HPO4, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 5 mM de glutamato, malato de 5 mM y la rotenona μM 2, pH 7.4) según el volumen de pellets antes de cualquier culo Ay.
- Utilice 5 μL de solución mitocondrial para medir la concentración de proteína mitocondrial por análisis estándar de BCA, OD562 de medición usando un lector de placa13.
2. determinación de la capacidad de retención de mitocondrial Ca2 +
- Preparar los medios de comunicación de KCl y añadir el Ca2 +-atar el tinte verde fluorescente a una concentración final de 0,5 μM antes del experimento.
- Transferir 1 mL de mitocondrias aisladas (0,4 mg/mL) en medio de KCl que contiene 0,5 μM Ca2 +-atar bien el tinte fluorescente verde en cada placa de 6 pozos.
- Incubar las mitocondrias y el Ca2 +-enlace colorante fluorescente verde en la placa de la pozo 6 a temperatura ambiente protegido de la luz ambiental para 1 minuto 4 Añadir alícuotas μL de una solución de CaCl2 (20 mM CaCl2, 127 mM KCl, 1 mM MgCl2 de 20 mM 20 mM HEPES, 5 mM glutamato, malato de 5 mM, pH 7,4) a cada placa de 6 pozos bien con el automático dispense ajuste para introducir la proteína mitocondrial de Ca2 +/mg de 200 nmol.
- Usar un espectrómetro de fluorescencia para supervisar los cambios de fluorescencia cada 3 s durante 2 min con una longitud de onda de excitación de 506 nm y una longitud de onda de emisión de 531 nm. La placa está equipada con agitación a 600 rpm durante 3 s entre lecturas controlado por software (figura 1).
- Añadir una alícuota adicional de 4 μL de solución de CaCl2 de 20 mM a cada pocillo y monitoreo de los cambios de fluorescencia cada 3 s durante 2 minutos Repita este paso hasta que la fluorescencia aumenta con el tiempo.
Nota: Las mitocondrias son desafiadas con la Ca agregado2 + indicada la grabación mayor fluorescencia. Cuando se abre el mPTP, la fluorescencia aumenta con el tiempo. - Interpretar la cantidad total de Ca2 + añadido hasta que el mPTP se abre como el Ca2 + capacidad de retención de.
3. determinación de Ca 2 +-inducida hinchazón mitocondrial
- Preparar los medios de comunicación de KCl antes del experimento.
- Transfiera 1 mL de mitocondrias aisladas (0,4 mg/mL) en medio de KCl en cada placa de 6 pozos bien.
- Añadir 10 μL de solución acuosa de CaCl2 (proteína mitocondrial de 500 nmol/mg) de 20 mM en proteína mitocondrial para desencadenar la hinchazón mitocondrial.
- Registrar la disminución de absorbancia a 540 nm cada 3 s en un lector de microplacas controlado por el software durante 10 minutos (figura 2). Los cambios de fluorescencia son causados por un flujo de solutos a través de la membrana interna mitocondrial.
Nota: La disminución absorbancia a 540 nm corresponde a las mitocondrias hinchadas. Si el lector no observa una disminución en la absorbancia, un mayor intervalo de lectura o tiempo de lectura puede ser adoptado.
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Representative Results
Representante resultados de capacidad de retención de Ca2 + :
Los resultados se expresaron como valores de fluorescencia. Con los pulsos adicionales de Ca2 + (200 nmols/mg proteína mitocondrial), la fluorescencia aumentada por el doble por encima de la línea de fondo con la apertura del mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), un inhibidor de la Ca2 +-inducida por mPTP apertura o 1 μM atractyloside (ATR), un activador de la Ca2 +-inducida por mPTP apertura, fueron agregados en mitocondrias aisladas. La cantidad de total agregado Ca2 + hasta apertura del mPTP indicada por un aumento del doble sobre la fluorescencia de la línea de fondo fue interpretada como la capacidad de retención de Ca2 + . Nuestros datos demostraron que el mitocondrial Ca2 + capacidad de retención en el tratamiento de la BKA fue mucho mayor que en el grupo ATR. Estos datos confirman la adecuada medición de mitocondrial Ca2 + capacidad de retención (figura 3).
Resultados de la representante de Ca2 +-inducida hinchazón mitocondrial:
Los resultados se expresaron como porcentaje de cambios en la absorbancia a 540 nm frente a absorbancia inicial durante un período de 10 minutos después de la adición de CaCl2. Provocada por la adición de Ca2 + (500 nmol/mg proteína mitocondrial), la disminución absorbancia a 540 nm indica el inflamiento mitocondrial. Con el tratamiento de la BKA o ATR, la curva de calibración mostró una disminución leve o aguda comparada con la absorbancia inicial, indicando que BKA puede inhibir la mPTP abertura mientras ATR puede facilitar la mPTP apertura (figura 4).
Figura 1: la configuración de software para mitocondrial Ca2 + retención capacidad análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: la configuración de software para mitocondrial Ca2 +-activa ensayo hinchazón mitocondrial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La medición de la capacidad de retención de Ca2 + . Extra mitocondrial Ca2 + en la mitocondria aislada se midió fluorometrically con la Ca2 +-enlace colorante fluorescente verde en presencia de 5 μM bongkrekate (BKA), 1 μM atractyloside (ATR) o el control en blanco (CON). Rastros de Ca2 + retención de mitocondrias aisladas con BKA, ATR y CON se midieron a 506 nm (Ex) y 531 nm (Em) en un lector de microplacas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La medición de Ca2 +-inducida hinchazón mitocondrial. CA2 +-hinchazón mitocondrial inducida de SH-SY5Y en presencia de 5 μM bongkrekate (BKA), 1 μM atractyloside (ATR) o el control en blanco (CON) se expresó como una curva de calibración de disminución de porcentaje de la inicial de absorbancia a 540 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, hemos descrito un protocolo sencillo y eficaz para el mitocondrial Ca2 + retención capacidad análisis y Ca2 +-activa ensayo hinchazón mitocondrial.
Para el aislamiento mitocondrial, asegúrese de que todos los materiales y tubos son de hielo, especialmente cuando las células de homogeneización. 0.25% tripsina-EDTA puede utilizarse también para separar las células desde el plato durante 5 minutos a 37 ° C. Después de 15-25 golpes, es necesario observar la membrana celular intacta bajo el microscopio y evitar la rotura de la membrana de las mitocondrias. Sin embargo, las mitocondrias aisladas que obtuvimos son mitocondrias crudas y las mitocondrias purificadas pueden obtenerse a través de 1,0 M / 1.5M gradiente discontinuo de sacarosa. Las características biológicas de las mitocondrias en las células vivas son más como ésos en vivo que en mitocondrias aisladas debido a las concentraciones de los componentes del medio que rodean a la mitocondria. La mitocondrial Ca2 + capacidad de retención de o Ca2 +-disparada ensayo hinchazón mitocondrial determinó condiciones energizada. Para la determinación del funcionamiento de las mitocondrias, succinato de 5 mM puede añadirse como sustratos respiratorios en lugar de glutamato y malato de6.
CA2 +-enlace colorante fluorescente verde (ATA Ca2 + con una afinidad de 4.29 ± 0,67 mM), es más conveniente medir concentraciones micromolar de Ca2 + que mayor afinidad tintes como fura-2 7. Después de la adición de la Ca2 +-enlace colorante verde fluorescente, la incubación debe ser inferior a 240 s. adiciones sucesivas de Ca2 + (variando de 25-200 nmol) fueron inyectados a intervalos de 1-3 min. Las curvas de calibración muestran que las concentraciones de Ca2 + que las mitocondrias son capaces de secuestrar, que indica la captación mitocondrial de pulsos de Ca2 +. De lo contrario, el Ca2 +-encuadernación verde colorante fluorescente también fue utilizado en investigaciones como intracelular libre Ca2 + medición de la concentración, siguiente Ca2 + afluencia y liberación y excitación multifotón de señalización de calcio proyección de imagen de Ca2 + en los tejidos vivos.
Para la determinación de Ca2 + -inducida hinchazón mitocondrial, hinchazón también puede ser inducida con la adición de 200 mM ATR y CaCl2. Como control, las mitocondrias podrían incubarse con CsA de 1 mM durante 5 minutos antes de la medición, que inhibió el mPTP apertura. Investigaciones anteriores mostraron curvas de calibración de la absorbancia en función del porcentaje de mitocondrias hinchadas14. Se informó 1 mM CsA, rojo de rutenio de 0,1 mM, y un volumen igual de mitocondrias frescos (0,5 mg/mL) puede ser agregado en la reacción cuando la hinchazón era completa. Porque CsA y rutenio rojo pueden inhibir la mPTP en las mitocondrias recién añadidas, las curvas de calibración indican las mitocondrias hinchadas y mitocondrias hinchadas no15. El protocolo de la hinchazón mitocondrial con sobrecarga de Ca2 + es también una medida efectiva y directa de Ca2 +-inducida por la apertura del mPTP.
Desde el descubrimiento del transporte de Ca2 + por las mitocondrias de mamíferos y otros vertebrados superiores hace más de 50 años, ha habido mucha investigación sobre los mecanismos y funciones de flujo de salida de calcio mitocondrial y afluencia. El mitocondrial Ca2 + absorción mecanismos contienen el Ca2 + uniporter mitocondrial, el modo rápido o RaM y el ryanodine receptor (mRyR)16. El análisis que describimos anteriormente puede evaluación Ca2 +-relacionadas con la función mitocondrial, sencilla y eficaz.
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Disclosures
X. sol supervisó los experimentos. Li Wei realizó los experimentos. Chen Zhang y X. el sol escribió el libro.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por subvenciones de concesión del destacado científico de Shandong (JQ201421) y concesión de NSFC (81371226).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | ATCC (The Global Bioresource Center) | ATCC Number: CRL-2266 | |
| Calcium green-5N | Life Technologies | c-3737 | Ca2+-binding green fluorescent dye |
| complete protease inhibitors | Roche Molecular Biochemicals | 4693116001 | |
| glass homogenizer | Kimble Chase | 9885303002 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | RES5063G-A7 | |
| malate | Sigma-Aldrich | 46940-U | |
| rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 00457 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | V900050 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | V900266 | |
| Varioskan flash instruments | Thermo Scientific | IC100E | |
| Bongkrekate | Biovision | 1820-100 | |
| atractyloside | Sigma-Aldrich | C4992 | |
| high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium | Hyclone | SH30022 | 4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate |
| fetal bovine serum | Hyclone | SV30087 | |
| penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| streptomycin | Invitrogen | 11860-038 | |
| BCA assay kit | Thermo Scientific | NCI3225CH | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| 10 cm cell culture dish | NEST | 704001 |
References
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