Summary
Denne protokol har til formål at beskrive en metode til at undersøge Ca2 + fastholdelse kapacitet og Ca2 +- udløst mitokondrier hævelse af isolerede mitochondrier af SH-SY5Y celler trin for trin.
Abstract
Produktionen af ATP ved oxidativ fosforylering er den primære funktion af mitokondrier. Mitokondrier i højere eukaryoter også deltage i cytosole Ca2 + buffer, og ATP produktion i mitokondrie kan være medieret af intramitochondrial gratis Ca2 + koncentration. Ca2 + fastholdelse kapacitet kan betragtes som mitokondrier evne til at bevare calcium i mitokondriets matrix. Akkumulerede intracellulære Ca2 + fører til permeabilitet af den indre mitokondrielle membran kaldes åbningen af mitokondrie permeabilitet overgangen pore (mPTP), hvilket fører til lækage af molekyler med en Molekylær vægt mindre end 1,5 kDa. Ca2 +-udløst mitokondrier hævelse bruges til at angive mPTP åbning. Her beskriver vi to assays for at undersøge Ca2 + fastholdelse kapacitet og Ca2 +-udløst mitokondrier hævelse i isolerede mitochondrier. Efter visse mængder af Ca2 + er tilføjet, kan alle trin udfyldes på én dag og indspillet af en mikrotiterplade læser. Således, disse to enkle og effektive assays kan vedtages for at vurdere Ca2 +-relaterede mitokondriets funktioner.
Introduction
Mitokondrier er de vigtigste cellulære organer til at producere næsten 95% af ATP anvendes i de pattedyrceller ved oxidativ fosforylering. Det forlyder, at den afsondret micromolar koncentration af Ca2 + af mitokondrier, tilstedeværelse af ADP og uorganisk fosfat kan bruges til at phosphorylate ADP at syntese ATP1. Når koncentrationen af cytosole Ca2 + går over en tærskel, mitokondrier kan optagelsen Ca2 + hurtigt og efflux det langsomt. Således, de fungerende mitokondrier kan tilstrømning af øget cytosole Ca2 +. Irrelevant for deltagelse i oxidativ fosforylering, den mitokondrielle Ca2 + også tage del i de cytosole calciumsignaler og aktivere mitokondriets apoptotiske mekanisme ved at inducere åbningen af mPTP i den indre mitokondrielle membran2. Det har været almindeligt anerkendt, at unormale udvidelse af intracellulære Ca2 + kan fremkalde mitokondrie massive hævelse ved at åbne mPTP3. Således, denne protokol har til formål at vurdere den mitokondrielle funktion af kvantificere mitokondrie Ca2 + fastholdelse kapacitet og Ca2 +-trigget mitokondrier hævelse.
Ca2 + fastholdelse kapacitet er måling af mitokondrier evne til optagelse cytosole calcium. Mitokondrier kan buffer cytosole gratis calcium og regulere calcium-afhængige cellulære processer af calcium optagelse i form af inaktive bundfald. Nedsat Ca2 + fastholdelse kapacitet opstår i stress fænomener forbundet med energi begrænsning og endda neurodegenerative sygdomme4,5. Isolerede mitochondrier eller digitonin-permeabilized celler kan bruges til at identificere Ca2 + fastholdelse kapacitet, og den forhøjede evne til at akkumulere Ca2 + af isolerede mitochondrier med yderligere glutamat og malat ikke er foretaget af den mitokondrie isolation procedure6. En titreret mængden af digitonin bør anvendes til at permeabilize plasma membraner i forskellige celletyper. Hexapotassium salt af Ca2 +-bindende grøn fluorescerende farvestof, en Ca2 +-følsomme celle-impermeant synligt lys-overgearet indikator, har været udbredte7. Ca2 +-bindende grøn fluorescerende farvestof er en indikator for lav-affinitet og bruges til at vise, at intracellulære gratis Ca2 + koncentrationer fortsætter med at stige i løbet af langvarig (5 min) stimulering8. Denne metode var mindre følsomme end radioaktive filter teknik, men var stærkt forenklet. Den yderligere Ca2 + hæver calcium grønne fluorescens og Ca2 + optagelse af mitokondrier returnerer fluorescens grundlinjen. Sekventiel tilføjelser af Ca2 + blev foretaget indtil mitokondrier undladt at optagelsen extramitochondrial Ca2 + 9. En fluorescens mikrotiterplade læser kan bruges til løbende rapportere calcium grønne fluorescens.
Efter Ca2 + akkumulering, mitokondrier depolariseret, udgivet Ca2 + til mediet, og begyndte at svulme. Ca2 +-udløst mitokondrier hævelse bruges til at angive mPTP åbning. Elektronmikroskopi og faldet i lys absorbans ved 540 nm kan bruges til at måle Ca2 +-udløst mitokondrier hævelse10,11. Mitokondrier volumen kan bestemmes direkte ved fremadrettet vinkel lysspredning12, hvor falder i absorbansen afspejler passiv hævelse af den mitokondriets matrix.
Her viser vi metoden for at undersøge den mitokondrielle Ca2 + fastholdelse kapacitet og Ca2 +-udløst mitokondrier hævelse i isolerede mitochondrier fra SH-SY5Y celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. isolering af mitochondrier
Bemærk: Alle løsninger og udstyr bør være forkølede til 0 - 4 ° C og opbevares på is.
- Frø omkring 3 x 106 SH-SY5Y celler pr. 10 cm celle kultur parabol. Kultur celler i høj-glucose Dulbecco ændrede Eagle medium med 10% føtal bovint serum, penicillin (100 U/mL)-streptomycin (100 µg/mL). Vedligeholde ved 37 ° C i en inkubator indeholdende 5% CO2 natten over.
Bemærk: mindst 1-2 x 107 SH-SY5Y celler er nødvendige for hver isolation assay. - Fjern mediet og cellerne vaskes med ca. 1 mL is kold PBS i en 10 cm celle kultur parabol 3 gange.
- Tilføje nye 1 mL af is kold PBS i 10 cm celle kultur skål og skrabe de vedhængende celler ind i en ny 1,5 mL rør. Der centrifugeres ved 800 x g i 10 min. ved 4 ° C.
- Under centrifugering, forberede 5 mL mitokondrie isolation buffer (250 mM saccharose, 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazin ethanesulfonic syre), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA) suppleret med 50 μL af protease-hæmmere lager løsning (100 x koncentration; 1 EDTA-gratis tablet opløses i 500 µL af Hedeselskabet2O).
- Fjern supernatanten og resuspenderes med 1 mL af mitokondrie isolation buffer. Inkuber 1,5 mL tube på is i 30 min.
- Lyse de suspenderede celler med et glas homogeniseringsapparat (15-25 slagtilfælde) op og ned manuelt på is.
Bemærk: Sørg for der er ingen bobler, når cellerne er homogeniseret. Tælle intakt celler og nøgne kerner af mikroskop visuelt og bekræfte, at > 90% celle brud er opstået. - Overførsel af homogenatet til en 1,5 mL rør og centrifugeres ved 1.000 x g i 5 min. ved 4 ° C til at fjerne snavs (kerner og resterende intakt celler).
- Overføre supernatanten ind i en ny 1,5 mL rør og centrifugeres ved 1.000 x g i 5 min. 4 ° C.
- Overføre supernatanten til en ny tube og centrifugeres ved 14.000 x g i 15 min. 4 ° C.
- Fjern supernatanten og resuspenderes indeholdende mitokondrier med 1 mL af mitokondrie isolation buffer.
- Der centrifugeres løsning for 15 min på 14.000 x g 4 ° C for at faelde mitokondrier.
- Den resulterende mitokondrier pellet opbevares på is og genopslemmes i 50-100 μL KCl medier (125 mM KCl, 2 mM K2HPO4, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 5 mM glutamat, 5 mM malate, og 2 μM rotenon, pH 7,4) Ifølge pellet volumen inden nogen røv Ay.
- Brug 5 μl af mitokondrie løsning til at måle den mitokondrielle proteinkoncentration af standard BCA assay, måling af OD562 ved hjælp af en plade læser13.
2. bestemmelse af mitokondrie Ca2 + fastholdelse kapacitet
- Forberede KCl medier og tilsæt Ca2 +-binding grøn fluorescerende farvestof til en endelig koncentration på 0,5 μM før forsøget.
- Der overføres 1 mL af isolerede mitochondrier (0,4 mg/mL) i KCl medier indeholdende 0,5 μM Ca2 +-bindende grøn fluorescerende farvestof i hver 6-godt plade godt.
- Inkuber mitokondrier og Ca2 +-bindende grøn fluorescerende farvestof i 6-godt pladen ved stuetemperatur beskyttet fra omgivende lys for 1 min. tilføje 4 μL delprøver af en 20 mM CaCl2 løsning (20 mM CaCl2, 127 mM KCl, 1 mM MgCl2 20 mM HEPES, 5 mM glutamat, 5 mM malate, pH 7,4) til hver 6-godt plade godt ved hjælp af automatiske dispensere indstilling at indføre 200 nmol Ca2 +/mg mitokondrie protein.
- Brug et fluorescens spektrometer til at overvåge fluorescens ændringer hver 3 s i 2 min. med en excitation bølgelængde af 506 nm og en emission boelgelaengden 531 nm. Pladen er udstyret med rysten på 600 rpm i 3 s mellem aflæsninger kontrolleres af software (figur 1).
- Tilføje en ekstra 4 μL alikvot af 20 mM CaCl2 løsning til hver brønd og overvåge fluorescens ændringer hver 3 s for 2 min. Gentag dette trin, indtil fluorescens stiger med tiden.
Bemærk: Mitokondrier er udfordret med den ekstra Ca2 + angivet ved øget optagelse fluorescens. Når mPTP åbner, stiger fluorescens med tiden. - Fortolke det samlede beløb af Ca2 + tilføjet indtil mPTP åbner som Ca2 + fastholdelse kapacitet.
3. bestemmelse af Ca 2 +-induceret mitokondrier hævelse
- Forberede KCl medierne før forsøget.
- Overføres 1 mL af isolerede mitochondrier (0,4 mg/mL) i KCl medier ind hver 6-godt plade godt.
- Tilføje 10 μL af 20 mM CaCl2 vandig opløsning (500 nmol/mg mitokondrie protein) til mitokondrie protein til at udløse mitokondrier hævelse.
- Optage faldet i absorbans ved 540 nm hver 3 s på en mikrotiterplade læser kontrolleres af software til 10 min (figur 2). Fluorescens ændringer er forårsaget af en tilstrømning af opløste stoffer over mitokondriets indre membran.
Bemærk: Nedsat absorbansen ved 540 nm svarer til hævede mitokondrier. Hvis læseren ikke observere et fald i absorbans, kan en længere læsning interval eller læsning tid vedtages.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative resultater af Ca2 + fastholdelse kapacitet:
Resultaterne blev udtrykt som fluorescens værdier. Med de ekstra pulser af Ca2 + (200 nmols/mg mitokondrie protein), fluorescens steg med dobbelt over baseline med mPTP åbning. 5 μM Bongkrekate (BKA), en hæmmer af Ca2 +-induceret mPTP åbning eller 1 μM atractyloside (ATR), en aktivator af Ca2 +-induceret mPTP åbning, blev tilføjet i isolerede mitochondrier. Mængden af samlede tilsat Ca2 + indtil mPTP åbning angivet af en dobbelt stigning over baseline fluorescens blev tolket som Ca2 + fastholdelse kapacitet. Vores data viste, at den mitokondrielle Ca2 + fastholdelse kapacitet i BKA behandling var meget højere end i ATR gruppe. Disse data bekræftes passende måling af mitokondrie Ca2 + fastholdelse kapacitet (figur 3).
Repræsentative resultater af Ca2 +-induceret mitokondrier hævelse:
Resultaterne blev udtrykt som procentvise ændringer i absorbans ved 540 nm kontra indledende absorbans i en periode på 10 min. efter tilsætning af CaCl2. Udløses ved tilsætning af Ca2 + (500 nmol/mg mitokondrie protein), nedsat absorbansen overvåges ved 540 nm angivet de mitokondrielle hævelser. Med behandling af BKA eller ATR, kalibreringskurven viste en lille eller skarpe nedgang i forhold til indledende absorbans, der angiver, at BKA kan hæmme mPTP åbning mens ATR kan lette mPTP åbning (figur 4).
Figur 1: software-indstillinger til mitokondrie Ca2 + fastholdelse kapacitet assay. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: software-indstillinger til mitokondrie Ca2 +-udløst mitokondrier hævelse assay. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Måling af Ca2 + fastholdelse kapacitet. Ekstra-mitokondrie Ca2 + i isolerede mitochondrier blev målt fluorometrically med Ca2 +-bindende grøn fluorescerende farvestof 5 μM bongkrekate (BKA), 1 μM atractyloside (ATR) eller tom kontrol (CON). Spor af Ca2 + opbevaring af isolerede mitochondrier med BKA, ATR og CON blev målt ved 506 nm (Ex) og 531 nm (Em) på en mikrotiterplade læser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Måling af Ca2 +-induceret mitokondrier hævelse. Ca2 +-induceret mitokondrier hævelse af SH-SY5Y 5 μM bongkrekate (BKA), 1 μM atractyloside (ATR) eller tom kontrol (CON) blev udtrykt som en procentdel nedsat kalibreringskurven den indledende absorbans ved 540 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her, vi beskrevet en enkel og effektiv protokol til mitokondrie Ca2 + fastholdelse kapacitet analysen og Ca2 +-udløst mitokondrier hævelse assay.
Til mitokondrie isolering, Sørg for at alle materialer og rør er på isen, især når homogenisering cellerne. 0,25% trypsin-EDTA kan også bruges til at løsne celler fra fad i 5 min ved 37 ° C. Efter 15-25 slag er det nødvendigt at observere intakt cellemembranen under mikroskop og undgå brud af mitokondrier membran. Men de isolerede mitochondrier, at vi fået er rå mitokondrier og renset mitokondrier kan fås gennem 1,0 M / 1,5 diskontinuert saccharose gradient. De biologiske karakteristika af mitochondrier i levende celler er mere som disse i vivo end i isolerede mitochondrier på grund af koncentrationer af de mellemstore komponenter, der omgiver mitokondrier. Mitokondrie Ca2 + fastholdelse kapacitet eller Ca2 +-udløste mitokondrier hævelse assay blev fastsat Energitilfoerslen betingelser. Til bestemmelse af fungerende mitokondrier, kan 5 mM succinat tilføjes som respiratorisk substrater i stedet for glutamat og malat6.
Ca2 +-bindende grøn fluorescerende farvestof (binder Ca2 + med en affinitet for 4.29 ± 0,67 mM), er mere velegnet til at måle micromolar koncentrationer af Ca2 + end højere affinitet farvestoffer såsom fura-2 7. Efter tilsætning af Ca2 +-bindende grøn fluorescerende farvestof, inkubation skal være mindre end 240 s. hinanden følgende tilføjelser af Ca2 + (varierende fra 25-200 nmol) blev sprøjtet med 1-3 min. mellemrum. Kalibreringskurverne Vis koncentrationer af Ca2 + at mitokondrier er i stand til at udskille, der angiver den mitokondrielle optagelsen af pulser af Ca2 +. Ellers, Ca2 +-bindende grøn fluorescerende farvestof blev også brugt i calcium signalering undersøgelser, såsom intracellulære gratis Ca2 + koncentrationsmåling, følgende Ca2 + tilstrømning og frigivelse og multiphoton magnetisering Imaging af Ca2 + i levende væv.
Til bestemmelse af Ca2 + -induceret mitokondrier hævelse, hævelse kan også induceres med tilsætning af 200 mM ATR og CaCl2. Som kontrol, mitokondrier kunne sættes i varmeskab med 1 mM CsA i 5 min. før målingen, som hæmmede mPTP åbning. Tidligere forskning har vist kalibreringskurverne absorbans som funktion af procentdelen af hævede mitokondrier14. Det blev rapporteret, at 1 mM CsA, 0.1 mM ruthenium rød, og et lige saa stort volumen af friske mitokondrier (0,5 mg/mL) kan tilføjes i reaktionen, når hævelsen var komplet. Fordi CsA og ruthenium røde kan hæmme mPTP åbning i frisk tilføjet mitokondrier, angive kalibreringskurverne både hævede mitokondrier og ikke-hævede mitokondrier15. Protokollen af mitokondrier hævelse ved Ca2 + overbelastning er også en effektiv og direkte måling af Ca2 +-induceret mPTP åbning.
Siden opdagelsen af transport af Ca2 + af mitokondrier fra pattedyr og andre højere hvirveldyr mere end 50 år siden, har der været megen forskning i mekanismer og funktioner af mitokondrie calcium efflux og tilstrømning. Mitokondrie Ca2 + optagelse mekanismer indeholder den mitokondrielle Ca2 + uniporter, den hurtige tilstand eller RaM og ryanodine receptor (mRyR)16. Assays vi beskrevet ovenfor kan evaluere Ca2 +-relaterede mitokondrie funktion, enkelt og effektivt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
X. solen overvåget eksperimenter. Wei Li udført eksperimenter. Chen Zhang og X. solen skrev papiret.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra grant af fremragende videnskabsmand af Shandong (JQ201421) og tilskud fra NSFC (81371226).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | ATCC (The Global Bioresource Center) | ATCC Number: CRL-2266 | |
| Calcium green-5N | Life Technologies | c-3737 | Ca2+-binding green fluorescent dye |
| complete protease inhibitors | Roche Molecular Biochemicals | 4693116001 | |
| glass homogenizer | Kimble Chase | 9885303002 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | RES5063G-A7 | |
| malate | Sigma-Aldrich | 46940-U | |
| rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 00457 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | V900050 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | V900266 | |
| Varioskan flash instruments | Thermo Scientific | IC100E | |
| Bongkrekate | Biovision | 1820-100 | |
| atractyloside | Sigma-Aldrich | C4992 | |
| high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium | Hyclone | SH30022 | 4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate |
| fetal bovine serum | Hyclone | SV30087 | |
| penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| streptomycin | Invitrogen | 11860-038 | |
| BCA assay kit | Thermo Scientific | NCI3225CH | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| 10 cm cell culture dish | NEST | 704001 |
References
- Rossi, C. S., Lehninger, A. L. Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria. J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).
- Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions. Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).
- Crofts, A. R., Chappell, J. B. Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling. Biochem J. 95, 387-392 (1965).
- Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. Calcium ions in neuronal degeneration. IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).
- Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Rajdev, S., Reynolds, I. J. Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons. Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).
- Stout, A. K., Reynolds, I. J. High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations. Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).
- Bambrick, L. L., et al. Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons. J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).
- Zhao, K., et al. Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury. J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).
- Muriel, M. P., et al. Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death. J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).
- Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure. Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).
- Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).
- Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A. Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).
- Pastorino, J. G., et al. Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore. J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).
- Gunter, T. E., Sheu, S. S. Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).
