Summary
इस प्रोटोकॉल के लिए एक विधि का वर्णन करने के लिए ca की जांच करने के लिए2 + प्रतिधारण क्षमता और ca2 +-ट्रिगर mitochondrial के अलग mitochondria के सूजन-SY5Y कोशिकाओं कदम दर कदम ।
Abstract
ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण द्वारा एटीपी का उत्पादन mitochondria का प्राथमिक कार्य है. उच्च eukaryotes में Mitochondria भी cytosolic ca2 + buffering में भाग लेते हैं, और mitochondrial में एटीपी उत्पादन intramitochondrial मुक्त Ca2 + एकाग्रता द्वारा मध्यस्थता कर सकते हैं । Ca2 + प्रतिधारण क्षमता mitochondrial मैट्रिक्स में कैल्शियम बनाए रखने के लिए mitochondria की क्षमता के रूप में माना जा सकता है । संचित intracellular Ca2 + भीतरी mitochondrial झिल्ली की पारगम्यता की ओर जाता है, mitochondrial पारगम्यता संक्रमण ताकना (mPTP) के उद्घाटन, जो एक आणविक वजन से कम १.५ केडीए के साथ अणुओं के रिसाव की ओर जाता है. सीए2 +-ट्रिगर mitochondria सूजन mPTP खोलने का संकेत करने के लिए प्रयोग किया जाता है । यहां, हम दो परख का वर्णन करने के लिए ca की जांच2 + प्रतिधारण क्षमता और ca2 +-ट्रिगर mitochondrial अलग mitochondria में सूजन । कुछ मात्रा के बाद Ca2 + जोड़े जाते हैं, सभी चरणों एक दिन में पूरा किया जा सकता है और एक microplate रीडर द्वारा दर्ज की गई । इस प्रकार, इन दो सरल और प्रभावी परख के लिए सीए2 +-संबंधित mitochondrial कार्यों का आकलन अपनाया जा सकता है ।
Introduction
Mitochondria मुख्य सेलुलर अंगों ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं में इस्तेमाल एटीपी के लगभग ९५% उत्पादन कर रहे हैं । यह सूचना दी है कि तनहा micromolar की एकाग्रता2 + द्वारा mitochondria, adp की उपस्थिति, और अकार्बनिक फॉस्फेट phosphorylate करने के लिए adp एटीपी1करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जब cytosolic ca की एकाग्रता2 + एक दहलीज के ऊपर चला जाता है, mitochondria सीए2 + तेजी से तेज और समाप्ति इसे धीरे से कर सकते हैं । इस प्रकार, कामकाजी mitochondria बढ़ cytosolic Ca2 +आमद कर सकते हैं । ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण में भागीदारी के लिए अप्रासंगिक, mitochondrial Ca2 + भी cytosolic कैल्शियम संकेतों में भाग लेने के लिए और mitochondrial अपोप्तोटिक तंत्र को सक्रिय mPTP के भीतर mitochondrial के उद्घाटन के लिए प्रेरित करके झिल्ली2. यह व्यापक रूप से मांयता प्राप्त है कि intracellular Ca के असामांय उंनयन2 + mPTP3खोलने के द्वारा mitochondrial बड़े पैमाने पर सूजन पैदा कर सकता है । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल को mitochondrial ca2 + प्रतिधारण क्षमता और ca2 +-trigged mitochondrial सूजन को बढ़ाता द्वारा mitochondrial समारोह का आकलन करना है ।
Ca2 + प्रतिधारण क्षमता cytosolic कैल्शियम mitochondria की क्षमता का माप है । Mitochondria cytosolic मुक्त कैल्शियम बफर कर सकते हैं और निष्क्रिय हाला के रूप में कैल्शियम के साथ कैल्शियम पर निर्भर सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित. बिगड़ा Ca2 + प्रतिधारण क्षमता ऊर्जा सीमा और भी neurodegenerative रोगों4,5के साथ जुड़े तनाव घटना में होता है । पृथक mitochondria या digitonin-permeabilized कक्षों को ca2 + अवधारण क्षमता, और additonal ग्लूटामेट और malate के साथ पृथक mitochondria द्वारा ca2 + को संचित करने की उंनत क्षमता को पहचानने के लिए उपयोग किया जा सकता है mitochondrial आइसोलेशन प्रक्रिया6। digitonin का एक titrated मात्रा में विभिन्न कोशिका प्रकार के प्लाज्मा झिल्ली permeabilize करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । ca के hexapotassium नमक2 +-हरी फ्लोरोसेंट डाई बाध्यकारी, एक ca2 +-संवेदनशील कोशिका-impermeant दृश्य प्रकाश उत्तेजित सूचक, व्यापक रूप से किया गया है7। ca2 +-हरी फ्लोरोसेंट डाई बाध्यकारी एक कम आत्मीयता सूचक है और दिखाने के लिए कि intracellular नि: शुल्क Ca2 + सांद्रता को लंबे समय तक (5 मिनट) उत्तेजना8के दौरान वृद्धि जारी रखने के लिए इस्तेमाल किया । इस विधि रेडियोधर्मी फिल्टर तकनीक की तुलना में कम संवेदनशील था, लेकिन बहुत सरल था । अतिरिक्त ca2 + उंनयन कैल्शियम ग्रीन प्रतिदीप्ति और ca2 + mitochondria द्वारा ले आधारभूत करने के लिए प्रतिदीप्ति रिटर्न । ca2 + के अनुक्रमिक जोड़ दिया गया जब तक mitochondria extramitochondrial ca2 + 9के लिए असफल । कैल्शियम ग्रीन प्रतिदीप्ति को लगातार रिपोर्ट करने के लिए एक प्रतिदीप्ति microplate रीडर का इस्तेमाल किया जा सकता है ।
ca के बाद2 + संचय, mitochondria, विमोचन ca2 + माध्यम में जारी किया है, और प्रफुल्लित करने के लिए शुरू किया । सीए2 +-ट्रिगर mitochondria सूजन mPTP खोलने का संकेत करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और ५४० एनएम पर प्रकाश अवशोषक में कमी के लिए सीए2 +ट्रिगर mitochondrial सूजन10,11मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । Mitochondria मात्रा सीधे आगे कोण प्रकाश कैटरिंग12, जहां अवशोषण में कमी mitochondrial मैट्रिक्स की निष्क्रिय सूजन को प्रतिबिंबित द्वारा निर्धारित किया जा सकता है ।
यहां, हम mitochondrial ca की जांच करने के लिए पद्धति उदाहरण देकर स्पष्ट2 + प्रतिधारण क्षमता और ca2 +-ट्रिगर mitochondrial SY5Y कोशिकाओं से पृथक mitochondria में सूजन ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mitochondria का अलगाव
नोट: सभी समाधान और उपकरणों 0-4 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा किया जाना चाहिए और बर्फ पर रखा ।
- बीज के बारे में 3 x 106 श-SY5Y कोशिकाओं प्रति 10 सेमी सेल संस्कृति डिश । उच्च ग्लूकोज Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम में संस्कृति कोशिकाओं के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, पेनिसिलिन (१०० यू/एमएल)-streptomycin (१०० µ g/ एक मशीन में ३७ ° c पर बनाए रखें 5% कं2 रातोंरात युक्त ।
नोट: 1-2 x10 7 एसएच-SY5Y कोशिकाओं प्रत्येक अलगाव परख के लिए आवश्यक हैं । - मध्यम निकालें और एक 10 सेमी सेल संस्कृति डिश 3 बार में बर्फ ठंडा पंजाबियों के बारे में 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
- 10 सेमी सेल संस्कृति डिश में बर्फ ठंडा पंजाबियों के नए 1 मिलीलीटर जोड़ें और एक नया १.५ मिलीलीटर ट्यूब में अनुयाई कोशिकाओं परिमार्जन । 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ८०० x g पर केंद्रापसारक ।
- केंद्रापसारक के दौरान, तैयार 5 मिलीलीटर mitochondrial आइसोलेशन बफर (२५० mm सुक्रोज, 10 mm HEPES (4-(2-hydroxyethyl) -1-पिपेराजीन ethanesulfonic एसिड), 10 mm KCl, १.५ mm MgCl2, 1 mm EDTA) का सप्लीमेंट ५० μL के साथ समाधान (100x एकाग्रता; 1 EDTA-फ्री टैबलेट में भंग ५०० µ एल के ddH2O) ।
- supernatant निकालें और mitochondrial अलगाव बफर की 1 मिलीलीटर के साथ गोली reसस्पेंड । 30 मिनट के लिए बर्फ पर १.५ मिलीलीटर ट्यूब मशीन ।
- एक गिलास homogenizer (15-25 स्ट्रोक) के साथ निलंबित कोशिकाओं लाइसे ऊपर और नीचे बर्फ पर मैन्युअल रूप से ।
नोट: सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले जब कोशिकाओं homogenized रहे हैं । बरकरार कोशिकाओं की गणना और नेत्रहीन माइक्रोस्कोप द्वारा नाभिक नंगे और पुष्टि करते हैं कि > 90% सेल टूटना हुआ है. - एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में homogenate हस्तांतरण और 5 मिनट के लिए १,००० x g पर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए मलबे (नाभिक और शेष बरकरार कोशिकाओं) को दूर करने के लिए ।
- एक नया १.५ मिलीलीटर ट्यूब में supernatant स्थानांतरण और 5 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक ।
- एक नई ट्यूब के लिए supernatant स्थानांतरण और 15 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए १४,००० x g पर केंद्रापसारक ।
- supernatant निकालें और mitochondrial अलगाव बफर की 1 मिलीलीटर के साथ mitochondria युक्त गोली reसस्पेंड ।
- १४,००० x g 4 ° c पर 15 मिनट के लिए समाधान के लिए mitochondria को तेज करना ।
- परिणामस्वरूप mitochondria गोली बर्फ पर रखा जाना चाहिए और ५० में reसस्पैंड-१०० μL KCl मीडिया (१२५ mM KCl, 2 मिमी K2HPO4, 1 मिमी MgCl2, 20 मिमी HEPES, 5 मिमी ग्लूटामेट, 5 मिमी malate, और 2 माइक्रोन रोटेनोन, पीएच ७.४) गोली मात्रा के अनुसार किसी भी गधे से पहले प्र.
- मानक बीसीए परख द्वारा mitochondrial प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए mitochondrial समाधान के 5 μL का प्रयोग करें, एक प्लेट रीडर का उपयोग कर OD562 को मापने13.
2. Mitochondrial Ca के निर्धारण2 + प्रतिधारण क्षमता
- KCl मीडिया तैयार करें और प्रयोग से पहले ०.५ माइक्रोन की एक अंतिम एकाग्रता के लिए Ca2 +बाध्यकारी हरी फ्लोरोसेंट डाई जोड़ें ।
- KCl मीडिया में अलग mitochondria (०.४ मिलीग्राम/एमएल) के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण ०.५ माइक्रोन सीए2 +-प्रत्येक 6 अच्छी तरह से थाली में हरी फ्लोरोसेंट डाई बाध्यकारी ।
- mitochondria और सीए2 +-1 मिनट के लिए परिवेश प्रकाश से सुरक्षित कमरे के तापमान पर 6 अच्छी तरह से थाली में बाध्यकारी हरी फ्लोरोसेंट डाई । जोड़ें 4 μL aliquots एक 20 मिमी CaCl2 समाधान (20 मिमी CaCl2, १२७ मिमी KCl, 1 मिमी MgCl2 , 20 मिमी HEPES, 5 मिमी ग्लूटामेट, 5 मिमी malate, पीएच ७.४) प्रत्येक 6 अच्छी तरह से प्लेट अच्छी तरह से स्वचालित वितरण सेटिंग का उपयोग करने के लिए २०० nmol सीए2 +/mg mitochondrial प्रोटीन परिचय ।
- ५०६ एनएम के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और ५३१ एनएम के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ 2 मिनट के लिए हर 3 एस प्रतिदीप्ति परिवर्तन की निगरानी के लिए एक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर का प्रयोग करें । थाली सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित रीडिंग के बीच 3 एस के लिए ६०० rpm पर मिलाने के साथ सुसज्जित है (चित्रा 1) ।
- एक अतिरिक्त 4 μL aliquot के 20 मिमी CaCl2 समाधान के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें और मॉनिटर प्रतिदीप्ति परिवर्तन हर 3 s 2 min. के लिए समय के साथ प्रतिदीप्ति बढ़ाता है जब तक इस चरण को दोहराएँ ।
नोट: Mitochondria जोड़ा Ca के साथ चुनौती दी है2 + बढ़ी हुई रिकॉर्डिंग प्रतिदीप्ति द्वारा संकेत दिया. जब mPTP खुलती है तो समय के साथ प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है । - mPTP ca2 + अवधारण क्षमता के रूप में खुलता है जब तक जोड़ा गया ca2 + की कुल राशि की व्याख्या ।
3. सीए के निर्धारण 2 +प्रेरित Mitochondrial सूजन
- प्रयोग से पहले KCl मीडिया तैयार करें ।
- KCl मीडिया में अलग mitochondria के 1 मिलीलीटर (०.४ मिलीग्राम/एमएल) प्रत्येक 6 अच्छी तरह से थाली में स्थानांतरण ।
- mitochondrial सूजन को ट्रिगर करने के लिए mitochondrial प्रोटीन में 20 मिमी CaCl2 जलीय घोल (५०० nmol/मिलीग्राम mitochondrial प्रोटीन) के 10 μL जोड़ें ।
- रिकॉर्ड ५४० एनएम में अवशोषक में कमी एक microplate 10 मिनट के लिए सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित रीडर पर हर 3 s (चित्रा 2) । प्रतिदीप्ति परिवर्तन mitochondrial भीतरी झिल्ली के पार solutes की एक आमद के कारण होते हैं ।
नोट: ५४० एनएम में कम अवशोषक सूजन mitochondria से मेल खाती है । यदि पाठक अवशोषण में कमी का पालन नहीं करता है, एक लंबा पढ़ने के अंतराल या पढ़ने के समय अपनाया जा सकता है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
सीए के प्रतिनिधि परिणाम2 + प्रतिधारण क्षमता:
परिणाम प्रतिदीप्ति मूल्यों के रूप में व्यक्त किए गए. सीए के अतिरिक्त दालों के साथ2 + (२०० nmols/मिलीग्राम mitochondrial प्रोटीन), प्रतिदीप्ति mPTP खोलने के साथ आधार रेखा से ऊपर डबल द्वारा वृद्धि हुई । 5 माइक्रोन Bongkrekate (BKA), ca के एक अवरोधक2 +प्रेरित mPTP खोलने, या 1 माइक्रोन atractyloside (एटीआर), ca के एक उत्प्रेरक2 +-प्रेरित mPTP खोलने, अलग mitochondria में जोड़ा गया. कुल जोड़ा गया ca2 + की मात्रा आधारभूत प्रतिदीप्ति के ऊपर एक डबल वृद्धि द्वारा इंगित किया गया mPTP खोलने तक ca2 + अवधारण क्षमता के रूप में समझा गया था । हमारे डेटा से पता चला कि mitochondrial Ca2 + BKA उपचार में प्रतिधारण क्षमता एटीआर समूह में है कि अधिक से अधिक था । इन आंकड़ों mitochondrial Ca2 + प्रतिधारण क्षमता (चित्रा 3) के उपयुक्त माप की पुष्टि की ।
सीए के प्रतिनिधि परिणाम2 +प्रेरित Mitochondrial सूजन:
परिणाम CaCl के अतिरिक्त के बाद 10 मिनट की अवधि के दौरान ५४० एनएम बनाम प्रारंभिक अवशोषण में अवशोषित में प्रतिशत परिवर्तन के रूप में व्यक्त किया गया2। सीए2 + (५०० nmol/मिलीग्राम mitochondrial प्रोटीन) के अलावा द्वारा ट्रिगर, कम ५४० एनएम पर नजर रखी अवशोषक mitochondrial सूजन संकेत दिया । BKA या एटीआर के उपचार के साथ, अंशांकन वक्र प्रारंभिक अवशोषण की तुलना में एक मामूली या तेज कमी दिखाई, यह दर्शाता है कि BKA mPTP खोलने को बाधित कर सकते हैं, जबकि एटीआर mPTP खोलने की सुविधा कर सकते हैं (चित्रा 4).
चित्रा 1: mitochondrial Ca के लिए सॉफ्टवेयर सेटिंग्स2 + प्रतिधारण क्षमता परख. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: mitochondrial Ca के लिए सॉफ्टवेयर सेटिंग्स2 +ट्रिगर mitochondrial सूजन परख. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: सीए की माप2 + अवधारण क्षमता. अतिरिक्त mitochondrial ca2 + अलग mitochondria में ca के साथ fluorometrically मापा गया था2 +-5 माइक्रोन bongkrekate (BKA), 1 माइक्रोन atractyloside (एटीआर), या रिक्त नियंत्रण (कांग्रेस) की उपस्थिति में हरी फ्लोरोसेंट डाई बाध्यकारी । BKA, एटीआर, और कांग्रेस के साथ अलग mitochondria द्वारा2 + प्रतिधारण के निशान ५०६ एनएम (पूर्व) और ५३१ एनएम (Em) पर एक microplate रीडर पर मापा गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: सीए की माप2 +प्रेरित mitochondrial सूजन. Ca2 +-प्रेरित mitochondrial 5 माइक्रोन bongkrekate (BKA), 1 माइक्रोन atractyloside (एटीआर), या रिक्त नियंत्रण (कांग्रेस) की उपस्थिति में एसएच SY5Y की सूजन ५४० एनएम में प्रारंभिक अवशोषक की अंशांकन वक्र कम प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहां, हम mitochondrial ca2 + प्रतिधारण क्षमता परख और ca2 +ट्रिगर mitochondrial सूजन परख के लिए एक सरल और प्रभावी प्रोटोकॉल का वर्णन किया ।
mitochondrial अलगाव के लिए, सुनिश्चित करें कि सभी सामग्री और ट्यूबों बर्फ पर हैं, खासकर जब कोशिकाओं अनुमन्य । ०.२५% trypsin-EDTA भी ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए पकवान से कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । 15-25 स्ट्रोक के बाद, यह खुर्दबीन के नीचे बरकरार कोशिका झिल्ली का पालन करें और mitochondria झिल्ली के टूटना से बचने के लिए आवश्यक है । हालांकि, अलग mitochondria है कि हम प्राप्त कच्चे mitochondria और शुद्ध mitochondria १.० m/1.5 मीटर सतत सुक्रोज ढाल के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है । जीवित कोशिकाओं में mitochondria की जैविक विशेषताओं की तुलना में vivo में उन लोगों की तरह है और क्योंकि मध्यम घटकों की सांद्रता कि mitochondria चारों ओर के अलग mitochondria में । mitochondrial ca2 + प्रतिधारण क्षमता या सीए2 +-ट्रिगर mitochondrial सूजन परख energized शर्तों के तहत निर्धारित किया गया था । कार्य mitochondria के निर्धारण के लिए, 5 मिमी succinate ग्लूटामेट और malate6के बजाय श्वसन सब्सट्रेट के रूप में जोड़ा जा सकता है ।
ca2 +-बाइंडिंग ग्रीन फ्लोरोसेंट डाई (बाइंड कर देता है2 + ४.२९ ± ०.६७ mM के एक संबंध के साथ), सीए के micromolar सांद्रता को मापने के लिए अधिक उपयुक्त है2 + फ्रा के रूप में उच्च आत्मीयता रंजक-2 7. ca के अलावा2 +बाध्यकारी हरी फ्लोरोसेंट डाई, मशीन से कम होना चाहिए २४० s. Ca के लगातार जोड़2 + (25-200 nmol से अलग) 1-3 मिनट के अंतराल पर इंजेक्ट किया गया । अंशांकन curves ca की सांद्रता2 + दिखाती है कि mitochondria एकांत करने में असमर्थ हैं, का संकेत mitochondrial के दालों की2 +ca. अंयथा, ca2 +-बाध्यकारी हरी फ्लोरोसेंट डाई भी इस तरह के रूप में intracellular मुक्त ca2 + एकाग्रता माप, सीए2 + आमद और रिलीज के बाद, और multiphoton उत्तेजना कैल्शियम संकेत जांच में इस्तेमाल किया गया था सीए की इमेजिंग2 + रहने वाले ऊतकों में ।
सीए2 + प्रेरित mitochondrial सूजन के निर्धारण के लिए, सूजन भी २०० mM एटीआर और CaCl2के अलावा के साथ प्रेरित किया जा सकता है । एक नियंत्रण के रूप में, mitochondria माप है, जो mPTP खोलने हिचक से पहले 5 मिनट के लिए 1 मिमी CsA के साथ मशीन हो सकता है । पिछले अनुसंधान सूजन mitochondria के प्रतिशत के एक समारोह के रूप में अवशोषित के अंशांकन curves दिखाया14। यह बताया गया कि 1 मिमी CsA, ०.१ मिमी ruthenium लाल, और एक बराबर मात्रा ताजा mitochondria (०.५ मिलीग्राम/एमएल) की प्रतिक्रिया में जोड़ा जा सकता है जब सूजन पूरा हो गया था । क्योंकि CsA और ruthenium लाल हौसले से जोड़ा mitochondria में mPTP खोलने को बाधित कर सकते हैं, अंशांकन curves दोनों सूजन mitochondria और गैर सूजन mitochondria15संकेत मिलता है । mitochondrial के प्रोटोकॉल सीए पर सूजन2 + अधिभार भी सीए2 +प्रेरित mPTP खोलने का एक प्रभावी और प्रत्यक्ष माप है.
2 Ca के परिवहन की खोज के बाद से+ mitochondria से स्तनधारियों और अंय उच्च रीढ़ से अधिक ५० साल पहले, वहां तंत्र और mitochondrial कैल्शियम समाप्ति और आमद के कार्यों पर बहुत अनुसंधान किया गया है । mitochondrial ca2 + तेज तंत्र mitochondrial ca2 + uniporter, तीव्र मोड या रैम, और ryanodine रिसेप्टर (mRyR)16होते हैं । परख हम ऊपर वर्णित Ca2 +मूल्यांकन कर सकते है संबंधित mitochondrial समारोह बस और प्रभावी ढंग से ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
एक्स रवि ने प्रयोगों की निगरानी की । वेई ली ने प्रयोगों का प्रदर्शन किया. चेन झांग और एक्स रवि ने पेपर लिखा ।
Acknowledgments
इस अध्ययन के अनुदान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया शेडोंग के बकाया वैज्ञानिक (JQ201421) और अनुदान से NSFC (८१३७१२२६).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | ATCC (The Global Bioresource Center) | ATCC Number: CRL-2266 | |
| Calcium green-5N | Life Technologies | c-3737 | Ca2+-binding green fluorescent dye |
| complete protease inhibitors | Roche Molecular Biochemicals | 4693116001 | |
| glass homogenizer | Kimble Chase | 9885303002 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | RES5063G-A7 | |
| malate | Sigma-Aldrich | 46940-U | |
| rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 00457 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | V900050 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | V900266 | |
| Varioskan flash instruments | Thermo Scientific | IC100E | |
| Bongkrekate | Biovision | 1820-100 | |
| atractyloside | Sigma-Aldrich | C4992 | |
| high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium | Hyclone | SH30022 | 4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate |
| fetal bovine serum | Hyclone | SV30087 | |
| penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| streptomycin | Invitrogen | 11860-038 | |
| BCA assay kit | Thermo Scientific | NCI3225CH | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| 10 cm cell culture dish | NEST | 704001 |
References
- Rossi, C. S., Lehninger, A. L. Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria. J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).
- Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions. Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).
- Crofts, A. R., Chappell, J. B. Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling. Biochem J. 95, 387-392 (1965).
- Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. Calcium ions in neuronal degeneration. IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).
- Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Rajdev, S., Reynolds, I. J. Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons. Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).
- Stout, A. K., Reynolds, I. J. High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations. Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).
- Bambrick, L. L., et al. Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons. J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).
- Zhao, K., et al. Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury. J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).
- Muriel, M. P., et al. Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death. J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).
- Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure. Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).
- Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).
- Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A. Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).
- Pastorino, J. G., et al. Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore. J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).
- Gunter, T. E., Sheu, S. S. Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).
