Summary
이 프로토콜 Ca2 + 보존 용량 및 캘리포니아2 +검사 하는 방법을 설명 하는 것을 목표로-트리거 SH-SY5Y의 고립 된 미토 콘 드리 아의 붓기 미토 콘 드리 아 세포 단계.
Abstract
산화 인 산화에 의해 ATP의 생산은 미토 콘 드리 아의 주 기능은 이다. 더 높은 진핵생물의 미토 콘 드리 아도 참여할 cytosolic 캘리포니아2 + 버퍼링, 그리고 미토 콘 드리 아에서 ATP 생산 intramitochondrial 무료 캘리포니아2 + 농도 의해 중재 될 수 있다. 캘리포니아2 + 보존 용량 미토 콘 드 리아 매트릭스에 칼슘을 유지 하는 미토 콘 드리 아의 기능으로 간주 될 수 있습니다. 축적 된 세포내 캘리포니아2 + 리드 안 미토 콘 드리 아 막의 침투성을 미토 콘 드리 아 침투성 전환 기 공 (mPTP)는 분자와 분자의 유출에는 리드 무게 1.5 kDa의 개통 되 나. 캘리포니아2 +-트리거 미토 콘 드리 아 붓기 mPTP 개방을 나타내는 데 사용 됩니다. 여기, 우리가 설명 하는 Ca2 + 보존 용량 및 캘리포니아2 +검사를 두 분석-고립 된 미토 콘 드리 아에서 미토 콘 드리 아 붓기를 트리거. 특정 양의 캘리포니아2 + 추가 후 모든 단계는 하루에 완료 고 microplate 리더에 의해 기록 될 수 있습니다. 따라서,이 두 가지 간단 하 고 효과적인 분석 평가 Ca2 +채택 될 수-미토 콘 드 리아 기능 관련.
Introduction
미토 콘 드리 아 ATP 산화 인 산화에 의해 포유류 세포에서 사용의 거의 95%를 생산 주요 세포 기관 이다. 그것은 그의 캘리포니아2 + 미토 콘 드리 아에 의해 분리 된 micromolar 집중, ADP와 무기 인산 염의 존재를 사용할 수 있는 합성 ATP1ADP phosphorylate 보고. Cytosolic 캘리포니아2 + 의 농도 임계값 이상 되 면 미토 콘 드리 아 수 이해 캘리포니아2 + 급속 하 게 경과 하 고 그것은 천천히. 따라서, 작동 미토 콘 드리 아 수 유입 증가 cytosolic 캘리포니아2 +. 없는 산화 인 산화에 참여 하는 미토 콘 드 리아 Ca2 + 또한 cytosolic 칼슘 신호에 참여 및 미토 콘 드리 아 내에는 mPTP의 개방을 유도 하 여 미토 콘 드 리아 apoptotic 메커니즘을 활성화 막2. 그것은 널리 인정 되었습니다 세포내 캘리포니아2 + 의 비정상적인 상승 mPTP3여 미토 콘 드리 아 대규모 붓기를 일으킬 수 있다. 따라서,이 프로토콜 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 및 캘리포니아2 +측정 하 여 미토 콘 드리 아 기능을 평가 하는 것을 목표로-유혹 trigged 미토 콘 드 리아 붓기.
캘리포니아2 + 보존 용량 글귀 cytosolic 칼슘을 미토 콘 드리 아의 능력의 측정입니다. 미토 콘 드리 아 무료 cytosolic 칼슘을 버퍼링 하 고 비활성 침전의 형태로 칼슘 통풍 관에 의해 칼슘-의존 세포질 과정을 조절 수 있습니다. 장애인된 캘리포니아2 + 보존 용량 에너지 제한 및 심지어 neurodegenerative 질병4,5와 관련 된 스트레스 현상에서 발생 합니다. 고립 된 미토 콘 드리 아 또는 셀 digitonin permeabilized Ca2 + 보존 용량, 식별 하는 데 수 고 축적 캘리포니아2 + 추가 조미료와 malate 고립 된 미토 콘 드리 아에 의해 상승 된 능력에 의해 영향을 받지는 합니다 미토 콘 드리 아 격리 절차6. 적정 한 양의 digitonin 플라즈마 막 종류의 다른 세포를 permeabilize를 사용 해야 합니다. 캘리포니아2 +의 hexapotassium 소금-녹색 형광 염료, 캘리포니아2 +바인딩-민감한 셀 impermeant 표시 빛 고르기 표시기, 널리7되었습니다. 캘리포니아2 +-(5 분) stimulations8연장 바인딩 녹색 형광 성 염료는 낮은 선호도 표시기 이며 무료 세포내 캘리포니아2 + 농도 동안 상승 계속 표시 하는 데 사용. 이 방법은 방사성 필터 기법 보다 덜 민감한 하지만 매우 간단 하 게 했다. 추가 Ca2 + 칼슘 녹색 형광을 끌어올리고 고 미토 콘 드리 아에 의해 Ca2 + 통풍 관 기준선에 형광을 반환 합니다. 캘리포니아2 + 의 순차적 추가 mitochondria 통풍 관 extramitochondrial Ca2 + 9실패까지 했다. 형광 microplate 리더는 지속적으로 칼슘 녹색 형광을 보고 사용할 수 있습니다.
캘리포니아2 + 축적, 후 미토 콘 드리 아 depolarized, 캘리포니아2 + , 매체에 발표 고 팽창 하기 시작 했다. 캘리포니아2 +-트리거 미토 콘 드리 아 붓기 mPTP 개방을 나타내는 데 사용 됩니다. 전자 현미경 및 측정 캘리포니아2 +데 540 nm 수에 빛 흡 광도 감소-미토 콘 드 리아 붓기10,11을 실행. 앞으로 각 산란12, 흡수도 감소 미토 콘 드 리아 매트릭스의 수동 붓기를 반영 미토 콘 드리 아 볼륨을 직접 확인할 수 있습니다.
여기, 우리는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 및 캘리포니아2 +검사 방법론 설명-SH-SY5Y 세포에서 고립 된 미토 콘 드리 아에서 미토 콘 드리 아 붓기를 트리거.
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Protocol
1입니다. 미토 콘 드리 아의 격리
참고: 모든 솔루션 및 장비 0-4 ° C에 precooled와 있어야 얼음에 보관 합니다.
- 10 cm 세포 배양 접시 당 종자 약 3 x 106 SH SY5Y 셀. 높은 포도 당 Dulbecco에 문화 세포의 10% 태아 둔감 한 혈 청, 페니실린 (100 U/mL)와 글 중간을 수정-스 (100 µ g/mL). 밤새 5% CO2 를 포함 하는 인큐베이터에서 37 ° C에서 유지 합니다.
참고: 107 SH SY5Y 셀 x 적어도 1-2 각 격리 분석 결과 대 한 필요. - 매체를 제거 하 고 세척 약 1 mL 10 cm 세포 배양 접시에 얼음 차가운 PBS의 셀 3 번.
- 10 cm 세포 배양 접시에 얼음 차가운 PBS의 새로운 1 mL을 추가 하 고 새로운 1.5 mL 튜브에 부착 세포를 긁어. 4 ° c.에서 10 분 동안 800 x g에서 원심 분리기
- 원심 분리, 동안 5 mL 미토 콘 드 리아 절연 버퍼 (250 m m 자당, 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethanesulfonic 산), 10mm KCl, 1.5 m m MgCl2, 1 mM EDTA) protease 억제제 주식의 50 μ 보완 준비 솔루션 (100 x 농도; 1 EDTA 무료 태블릿 ddH2O의 500 µ L에 용 해).
- 상쾌한을 제거 하 고 미토 콘 드리 아 절연 버퍼의 1 mL와 펠 릿을 resuspend. 30 분 동안 얼음에 1.5 mL 튜브를 품 어.
- Lyse 유리 균질 화기 (15-25 선)와 일시 중단 된 셀 아래로 수동으로 얼음에.
참고: 저기 없는 거품 세포 무 균 다는 것을 확인 하십시오. 현미경에 의해 그대로 셀과 드러난된 핵을 시각적으로 계산 하 고 확인 > 90% 셀 파손 발생 했습니다. - 1.5 mL 튜브 및 (핵 및 나머지 그대로 셀) 파편을 제거 하 4 ° C에서 5 분 동안 1000 x g에서 원심 분리기에는 homogenate를 전송 합니다.
- 새로운 1.5 mL 튜브를 5 분 동안 1000 x g에서 원심 분리기에는 상쾌한 전송 4 ° c.
- 새로운 튜브와 15 분 동안 14000 x g에서 원심 분리기에는 상쾌한 전송 4 ° c.
- 상쾌한을 제거 하 고 미토 콘 드리 아 절연 버퍼의 1 mL와 함께 미토 콘 드리 아를 포함 하는 펠 릿을 resuspend.
- 침전은 미토 콘 드리 아를 14000 x g 4 ° C에서 15 분에 대 한 솔루션을 원심.
- 결과 미토 콘 드리 아 펠 릿 얼음에 보관 되어야 하며 50-100 μ KCl 미디어 (125 m KCl m, 2 m m K2HPO41 m m MgCl2, 20 mM HEPES, 5mm 조미료, 5mm malate, 및 2 μ M로 테 논, pH 7.4) 어떤 엉덩이 전에 펠 릿 볼륨에 따라 resuspended 불안.
- 미토 콘 드 리아 솔루션의 5 μ를 사용 하 여 표준 BCA 분석 결과, OD562를 측정 하 여 미토 콘 드리 아 단백질 농도 측정 하는 플레이트 리더13를 사용 하 여.
2. 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 + 보존 용량 결정
- KCl 미디어를 준비 하 고 추가 Ca2 +-실험 전에 0.5 μ M의 최종 농도에 녹색 형광 염료를 바인딩.
- 고립 된 미토 콘 드리 아 (0.4 mg/mL)에 포함 된 0.5 μ M Ca2 +KCl 미디어의 1 mL를 전송-각 6 잘 플레이트에 녹색 형광 염료를 잘 바인딩.
- 품 어는 미토 콘 드리 아 및 캘리포니아2 +-20 mM CaCl2 솔루션 (20 m m CaCl2, 127 m m KCl, 1 mM MgCl2 의 1 분 추가 4 μ aliquots에 대 한 주위 빛에서 보호 하는 실 온에서 6 잘 플레이트에서 녹색 형광 염료를 바인딩 20 mM HEPES, 5mm 조미료, 5mm malate, pH 7.4) 각 6-잘 접시에 잘 사용 하 여 자동 분배 200 nmol Ca2 +/mg 미토 콘 드리 아 단백질을 소개 하는 설정.
- 모든 3 형광 변화를 모니터링 하는 형광 분석기 사용 506의 여기 파장을 2 분에 대 한 s 및 531의 방출 파장 nm. 접시 3 600 rpm에서 떨고 갖춘 소프트웨어 (그림 1)에 의해 제어 신호 사이 s.
- 각 영역 20 mM CaCl2 솔루션의 추가 4 μ 약 수를 추가 하 고 모든 3 형광 변화를 모니터링 형광 시간 증가 될 때까지이 단계를 반복 하는 2 분에 대 한 s.
참고: 미토 콘 드리 아와 추가 Ca2 + 증가 기록 형광으로 표시도 전했다. mPTP가 열리면 형광 시간이 증가 합니다. - 캘리포니아2 + 는 mPTP Ca2 + 보존 용량으로 열릴 때까지 추가의 총 금액을 해석 합니다.
3. 결정의 캘리포니아 2 +-미토 콘 드 리아 붓기를 유발
- 실험 전에 KCl 미디어를 준비 합니다.
- 잘 각 6 잘 플레이트에 KCl 미디어에서 고립 된 미토 콘 드리 아 (0.4 mg/mL)의 1 mL를 전송.
- 미토 콘 드 리아 붓기 하 미토 콘 드리 아 단백질으로 10 μ의 20mm CaCl2 수성 해결책 (500 nmol/mg 미토 콘 드리 아 단백질)를 추가 합니다.
- 540에 흡 광도 감소를 기록 nm 매 3 10 분 (그림 2)에 대 한 소프트웨어에 의해 제어 microplate 리더에 s. 형광 변화 미토 콘 드리 아 내 막에 걸쳐 용액의 유입에 의해 발생 합니다.
참고: 540에서 감소 흡 광도 nm 부 미토 콘 드리 아에 해당. 독자 흡 광도 감소 관찰 되지 않는 경우는 더 긴 간격 읽거나 독서 시간을 채택 수 있습니다.
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Representative Results
캘리포니아2 + 보존 용량의 대표 결과:
결과 형광 값으로 표현 되었다. 캘리포니아2 + (200 nmols/mg 미토 콘 드리 아 단백질)의 더블 mPTP 오프닝 베이스 위에 증가 하는 형광의 추가 펄스와. 5 μ M Bongkrekate (BKA), 캘리포니아2 +의 억제제-mPTP 개방, 또는 1 μ M atractyloside (ATR), 캘리포니아2 +의 활성 유도-mPTP 개방을 유도, 고립 된 미토 콘 드리 아에 추가 되었다. 양의 총 추가 Ca2 + mPTP 개방 기준 형광 위에 이중 증가 의해 표시 될 때까지 캘리포니아2 + 보존 용량으로 해석 되었다. 우리의 데이터는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 BKA 치료에 ATR 그룹에서 보다 훨씬 높은 것 나타났다. 이러한 데이터는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 (그림 3)의 적합 한 측정을 확인 했다.
캘리포니아2 +의 대표 결과-미토 콘 드 리아 붓기 유도:
결과에 540에서 흡 광도 비율 변경으로 표현 되었다 CaCl2의 추가 후에 10 분의 기간 동안 초기 흡 광도 대 nm. 캘리포니아2 + (500 nmol/mg 미토 콘 드리 아 단백질) 540에서 모니터링 감소 흡 광도의 추가 의해 트리거 nm 미토 콘 드 리아 swellings 표시. BKA 또는 ATR의 치료와 교정 곡선 BKA mPTP ATR (그림 4) 여 mPTP를 촉진할 수 있다 하는 동안 열을 억제할 수 있는 나타내는 초기 흡 광도에 비해 약간의 또는 날카로운 감소를 보였다.
그림 1: 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 + 보존 용량 분석 결과 대 한 소프트웨어 설정을. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 +에 대 한 소프트웨어 설정을-미토 콘 드 리아 붓기 분석 결과 발생. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 측정 캘리포니아2 + 보존 용량. 엑스트라-미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 고립 된 미토 콘 드리 아에서 측정 되었다 fluorometrically Ca2 +-5 μ M bongkrekate (BKA), 1 μ M atractyloside (ATR), 또는 빈 제어 (CON) 있을 때 녹색 형광 염료를 바인딩. 캘리포니아2 + BKA, ATR, 죄수와 고립 된 미토 콘 드리 아에 의해 보존의 506에서 측정 되었다 (전) 및 531 microplate 리더에 nm (Em). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 측정 캘리포니아2 +-미토 콘 드 리아 붓기 유도. 캘리포니아2 +-5 μ M bongkrekate (BKA), 1 μ M atractyloside (ATR), 또는 빈 제어 (CON) 있을 때 SH-SY5Y의 유도 미토 콘 드 리아 붓기 540에서 초기 흡 광도의 비율 감소 보정 곡선으로 표현 되었다 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 우리는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 분석 결과 및 캘리포니아2 +에 대 한 간단 하 고 효과적인 프로토콜을 설명-미토 콘 드 리아 붓기 분석 결과 유발.
미토 콘 드리 아 격리에 대 한 모든 자료와 튜브는 얼음, 특히 때 세포 조직 확인 하십시오. 37 ° c.에 5 분 동안 접시에서 세포를 분리 하 0.25% trypsin EDTA는 사용할 수 있습니다. 후에 15-25 선, 그것은 그대로 세포 막 현미경을 관찰 하 고 미토 콘 드리 아 막의 파손을 방지 하는 데 필요한. 그러나, 우리는 고립 된 미토 콘 드리 아 원유 미토 콘 드리 아 및 순화 된 미토 콘 드리 아 1.0 M 통해 얻어질 수 있다 / 1.5M 불연속 자당 기온 변화도. 살아있는 세포에서 미토 콘 드리 아의 생물 학적 특성은 미토 콘 드리 아를 포위 하는 중간 구성 요소의 농도 때문에 그 비보에 보다 고립 된 미토 콘 드리 아에 같은 더 있습니다. 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 또는 캘리포니아2 +-트리거 미토 콘 드 리아 붓기 분석 결과 활성화 조건 하에서 결정 했다. 작동 미토 콘 드리 아의 결정에 대 한 5 m m 합성 조미료 및 malate6대신 호흡 기질으로 추가할 수 있습니다.
캘리포니아2 +-녹색 형광 염료를 바인딩 (바인딩 캘리포니아2 + 4.29 ±의 선호도 0.67 m m)의 캘리포니아2 + fura-2 7같은 높은 선호도 염료 보다 micromolar 농도 측정 하는 더 적당 한. 캘리포니아2 +의 추가 후-녹색 형광 염료, 바인딩는 외피의 캘리포니아2 + (25-200 nmol에서 다양 한) 미만 240 s. 연속 추가 1-3 분 간격으로 주입 했다 되어야 합니다. 보정 곡선의 캘리포니아2 +펄스의 미토 콘 드리 아 이해를 나타내는 mitochondria 하지 수 있는 격리, 캘리포니아2 + 의 농도 표시. 그렇지 않으면, 캘리포니아2 +-녹색 형광 성 염료 또한 칼슘 세포내 무료 캘리포니아2 + 농도 측정, 다음 Ca2 + 유입 및 릴리스, multiphoton 여기 같은 조사를 신호에 사용 된 바인딩 캘리포니아2 + 살아있는 직물에서의 이미지입니다.
측정 캘리포니아2 + -유도 미토 콘 드 리아 붓기, 붓기도 200mm ATR과 CaCl2의 추가 함께 유도 될 수 있다. 컨트롤, 1mm 체코 여 mPTP 저해 측정 하기 전에 5 분 동안 함께 미토 콘 드리 아의 알을 품 수 있습니다. 이전 연구는 부 미토 콘 드리 아14의 비율의 기능으로 흡 광도의 교정 곡선을 보여주었다. 그것은 그 1 mM CsA, 0.1 m m 루 테 늄 빨강, 알려졌다 고 붓기 완료 했다 때 반응에 신선한 미토 콘 드리 아 (0.5 mg/mL)의 동일한 볼륨을 추가할 수 있습니다. 체코와 루 테 늄 빨강 mPTP 갓 추가 미토 콘 드리 아에서 열을 억제할 수 있는, 때문에 보정 곡선 부 미토 콘 드리 아 및 미토 콘 드리 아 부 비15를 나타냅니다. 캘리포니아2 + 오버 로드 시 미토 콘 드 리아 붓기의 프로토콜은 또한 캘리포니아2 +의 효과적이 고 직접적인 측정-mPTP 개방을 유도.
포유류에서 미토 콘 드리 아에 의해 캘리포니아2 + 그리고 다른 더 높은 척추 동물의 수송의 발견 50 년 전, 이후 메커니즘 및 미토 콘 드리 아 칼슘 경과 및 유입의 기능에 대 한 많은 연구가 되었습니다. 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 통풍 관 기계 장치 포함 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + uniporter, 빠른 모드 또는 RaM, 그리고 ryanodine 수용 체 (mRyR)16. 우리 수 위에서 설명한 분석 평가 캘리포니아2 +-간단 하 고 효과적으로 미토 콘 드리 아 기능을 관련.
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Disclosures
X. 태양 실험을 감독. 웨이 리는 실험을 수행. 첸 장 및 X. 태양 종이 썼다.
Acknowledgments
이 연구는 산동의 뛰어난 과학자 (JQ201421)와 NSFC (81371226)에서 부여의 부여에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | ATCC (The Global Bioresource Center) | ATCC Number: CRL-2266 | |
| Calcium green-5N | Life Technologies | c-3737 | Ca2+-binding green fluorescent dye |
| complete protease inhibitors | Roche Molecular Biochemicals | 4693116001 | |
| glass homogenizer | Kimble Chase | 9885303002 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | RES5063G-A7 | |
| malate | Sigma-Aldrich | 46940-U | |
| rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 00457 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | V900050 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | V900266 | |
| Varioskan flash instruments | Thermo Scientific | IC100E | |
| Bongkrekate | Biovision | 1820-100 | |
| atractyloside | Sigma-Aldrich | C4992 | |
| high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium | Hyclone | SH30022 | 4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate |
| fetal bovine serum | Hyclone | SV30087 | |
| penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| streptomycin | Invitrogen | 11860-038 | |
| BCA assay kit | Thermo Scientific | NCI3225CH | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| 10 cm cell culture dish | NEST | 704001 |
References
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