Summary
Detta protokoll syftar till att beskriva en metod för att undersöka Ca2 + retention kapacitet och Ca2 +- utlöst mitokondriell svullnad av isolerade mitokondrier av SH-SY5Y celler steg för steg.
Abstract
Produktionen av ATP genom oxidativ fosforylering är den primära funktionen av mitokondrier. Mitokondrier i högre eukaryotes också delta i cytosoliskt Ca2 + buffring och ATP produktionen i mitokondriell kan medlas av intramitochondrial gratis Ca2 + koncentration. Ca2 + retention kapacitet kan betraktas som förmåga att mitokondrierna att behålla kalcium i matrisen mitokondrie. Ackumulerade intracellulära Ca2 + leder till permeabiliteten i det inre mitokondriella membranet, kallas öppnandet av mitokondriell permeabilitet övergången pore (mPTP), vilket leder till läckage av molekyler med en molekylär vikt mindre än 1,5 kDa. Ca2 +-utlöst mitokondrier svullnad används för att indikera mPTP öppningen. Här beskriver vi två analyser för att undersöka Ca2 + retention kapacitet och Ca2 +-utlöst mitokondriell svullnad i isolerade mitokondrier. Efter vissa mängder av Ca2 + läggs, kan alla steg vara klar på en dag och inspelad av en microplate reader. Således dessa två enkla och effektiva testmetoder kan antas för att bedöma den Ca2 +-mitokondriella funktioner.
Introduction
Mitokondrierna är de viktigaste cellulära organen att producera nästan 95% av ATP används i däggdjursceller av oxidativ fosforylering. Det rapporteras att den beslagtagna mikromolära koncentrationen av Ca2 + av mitokondrier, förekomsten av ADP och oorganiskt fosfat kan användas att fosforylera ADP till syntes ATP1. När koncentrationen av cytosoliska Ca2 + går över en tröskel, mitokondrier kan upptag Ca2 + snabbt och efflux det långsamt. Således, fungerande mitokondrier kan inflödet av ökad cytosoliska Ca2 +. Irrelevant för deltagande i den oxidativ fosforyleringen, den mitokondriella Ca2 + också delta i de cytosoliska kalcium signalerna och aktivera mitokondriell apoptotiska mekanismen genom att inducera öppnandet av mPTP i inre mitokondrie membranet2. Det har varit allmänt kända att onormal höjning av intracellulära Ca2 + kan inducera mitokondriell massiva svullnad genom att öppna den mPTP3. Detta protokoll syftar således, att bedöma mitokondriefunktion genom kvantifiera mitokondriell Ca2 + retention kapacitet och Ca2 +-utlöst mitokondriell svullnad.
Ca2 + retention kapacitet är mätning av mitokondrier förmåga att upptag cytosoliska kalcium. Mitokondrier kan buffra de cytosoliska fritt kalciumet och reglera kalcium-beroende cellulära processer av kalcium upptag i form av inaktiva fällningar. Nedsatt Ca2 + retention kapacitet uppstår i stress fenomen förknippade med energi begränsning och även neurodegenerativa sjukdomar4,5. Isolerade mitokondrier eller digitonin-permeabilized celler kan användas för att identifiera Ca2 + retention kapacitet, och den förhöjda förmågan att ackumulera Ca2 + isolerade mitokondrien med tilläggsupplysningar glutamat och malate sker inte genom den mitokondriell isolering förfarande6. En titrerad mängd digitonin bör användas för att permeabilize plasma membran av olika celltyper. Hexapotassium salt Ca2 +-bindande grön fluorescerande färgämne, en Ca2 +-känsliga cell-impermeant synligt ljus-retbara indikator, har varit utbredda7. Ca2 +-bindande grön fluorescerande färgämne är en indikator på låg affinitet och används för att visa att intracellulära gratis Ca2 + koncentrationer fortsätter att stiga under långvarig (5 min) stimuli8. Denna metod var mindre känslig än den radioaktiva filter tekniken men var kraftigt förenklad. Den ytterligare Ca2 + höjer kalcium grön fluorescens och Ca2 + upptaget av mitokondrier returnerar fluorescensen till baslinjen. Sekventiell tillägg av Ca2 + gjordes tills mitokondrierna underlåtit att upptag extramitochondrial Ca2 + 9. En fluorescens microplate reader kan användas kontinuerligt rapportera kalcium gröna fluorescensen.
Efter Ca2 + ackumulation, mitokondrierna Aricebo släppt Ca2 + till medium och började svälla. Ca2 +-utlöst mitokondrier svullnad används för att indikera mPTP öppningen. Elektronmikroskopi och minskningen av ljusabsorbans vid 540 nm kan användas för att mäta den Ca2 +-utlöst mitokondriell svullnad10,11. Mitokondrier volym kan bestämmas direkt genom framåt vinkel ljusspridning12, där minskningar av absorbansen återspeglar passiva svullnad av mitokondriell matrisen.
Här, vi illustrera metoden för att undersöka mitokondriell Ca2 + retention kapacitet och Ca2 +-utlöst mitokondriell svullnad i isolerade mitokondrier från SH-SY5Y celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. isolering av mitokondrier
Obs: Alla lösningar och utrustning bör vara förhandskyld till 0 - 4 ° C och hållas på is.
- Utsäde ca 3 x 106 SH-SY5Y celler per 10 cm cell kultur maträtt. Kultur celler i hög-glukos Dulbecco ändrade Eagle medium med 10% fetalt bovint serum, penicillin (100 U/mL)-streptomycin (100 µg/mL). Underhåll vid 37 ° C i en inkubator som innehåller 5% CO2 över natten.
Obs: minst 1-2 x 107 SH-SY5Y celler behövs för varje isolering assay. - Ta bort mediet och tvätta cellerna med ca 1 mL is kallt PBS i en 10 cm cell kultur maträtt 3 gånger.
- Tillsätt ny 1 mL is kallt PBS i 10 cm cell kultur skålen och skrapa de vidhäftande cellerna in i en ny 1,5 mL tub. Centrifugera vid 800 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
- Under centrifugeringen, förbereda 5 mL mitokondriell isolering buffert (250 mM sackaros, 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazin ethanesulfonic syra), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA) kompletteras med 50 μL av proteas hämmare lager Lösningen (100 x koncentration; 1 EDTA-fria tablett löses i 500 µL av ddH2O).
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 mL av mitokondriell isolering buffert. Inkubera 1,5 mL röret på is i 30 min.
- Lysera de suspenderade cellerna med en glas Homogenisatorer (15-25 slag) upp och ner manuellt på is.
Notera: Se till att det finns inga bubblor när celler är homogeniserad. Räkna intakta celler och bared atomkärnor av mikroskopet visuellt och bekräfta att > 90% cell brott har inträffat. - Överföra Homogenatet i en 1,5 mL rör och centrifugera vid 1 000 x g i 5 minuter vid 4 ° C att ta bort skräp (kärnor och resterande intakta celler).
- Överför supernatanten till en ny 1,5 mL rör och centrifugera vid 1 000 x g i 5 min 4 ° C.
- Överför supernatanten till en ny tub och centrifugera vid 14 000 x g i 15 min 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten som innehåller mitokondrier med 1 mL av mitokondriell isolering buffert.
- Centrifugera lösningen för 15 min vid 14 000 x g 4 ° C för att fällningen mitokondrierna.
- Den resulterande mitokondrier pelleten hållas på is samt resuspended i 50-100 μL KCl media (125 mM KCl, 2 mM K2HPO4, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 5 mM Glutamat, 5 mM malate, och 2 μM rotenon, pH 7,4) enligt pellet volymen innan någon ass Ay.
- Använd 5 μL av mitokondriell lösning för att mäta den mitokondriella proteinkoncentration av standard BCA assay, mäta OD562 med hjälp av en tallrik läsare13.
2. bestämning av mitokondriell Ca2 + Retention kapacitet
- Förbered KCl och lägga till de Ca2 +-bindande grön fluorescerande färgämne till en slutlig koncentration på 0,5 μM innan experimentet.
- Överför 1 mL av isolerade mitokondrier (0,4 mg/mL) i KCl media som innehåller 0,5 μM Ca2 +-bindande grön fluorescerande färgämne i varje 6-väl plattan väl.
- Inkubera mitokondrierna och Ca2 +-bindande grön fluorescerande färgämne i 6-väl plattan vid rumstemperatur skyddas från omgivande ljus för 1 min. Tillsätt 4 μl portioner av en 20 mM CaCl2 lösning (20 mM CaCl2, 127 mM KCl, 1 mM MgCl2 20 mM HEPES, 5 mM Glutamat, 5 mM malate, pH 7,4) till varje 6-well platta väl automatisk fördela inställningen att införa 200 nmol Ca2 +/mg mitokondriella protein.
- Använda en fluorescens spektrometer för att övervaka fluorescens ändringarna var 3 s för 2 min med en magnetisering våglängd av 506 nm och emissionsvåglängden 531 nm. Plattan är utrustad med skakningar vid 600 rpm för 3 s mellan behandlingen kontrolleras av programvara (figur 1).
- Lägga till en ytterligare 4 μl alikvot av 20 mM CaCl2 lösning till varje brunn och övervaka fluorescens ändringarna var 3 s i 2 min. Upprepa detta steg tills fluorescensen ökar med tiden.
Obs: Mitokondrier utmanas med tillsatt Ca2 + anges av ökad inspelning fluorescensen. När mPTP öppnar, ökar fluorescensen med tiden. - Tolka den totala mängden Ca2 + tills mPTP öppnar som Ca2 + retention kapacitet.
3. bestämning av Ca 2 +-inducerad mitokondriell svullnad
- Förbered KCl innan experimentet.
- Över 1 mL av isolerade mitokondrier (0,4 mg/mL) i KCl media i varje 6-väl plattan väl.
- Tillsätt 10 μL av 20 mM CaCl2 vattenlösning (500 nmol/mg mitokondriell protein) i mitokondriell protein att utlösa mitokondriell svullnad.
- Spela in minskningen av absorbansen vid 540 nm var 3 s på en microplate reader kontrolleras av programvara för 10 min (figur 2). Fluorescens förändringarna orsakas av ett inflöde av koncentrationsfördelningen över det mitokondriella inre membranet.
Obs: Minskad absorbansen vid 540 nm motsvarar svullna mitokondrierna. Om läsaren inte iakttar en minskning av absorbansen, kan en längre mätnings intervall eller lästid antas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa resultat av Ca2 + Retention kapacitet:
Resultaten uttrycktes som fluorescens värden. Med ytterligare pulser av Ca2 + (200 nmols/mg mitokondriell protein), fluorescensen ökade med dubbel över baslinjen med mPTP öppningen. 5 μM Bongkrekate (BKA), en hämmare av Ca2 +-inducerad mPTP öppning, eller 1 μM atractyloside (ATR), en aktivator av Ca2 +-inducerad mPTP öppning, lades i isolerade mitokondrier. Mängden totala tillsatt Ca2 + tills mPTP öppning indikeras av en dubbel ökning ovanför baslinjen fluorescensen tolkades som Ca2 + retention kapacitet. Våra data visade att mitokondriell Ca2 + retention kapacitet i BKA behandling var mycket högre än i ATR-gruppen. Dessa uppgifter bekräftas lämplig mätning av mitokondriell Ca2 + retention kapacitet (figur 3).
Representativa resultat av Ca2 +-inducerad mitokondriell svullnad:
Resultaten uttrycktes som förändring av absorbansen vid 540 nm jämfört med inledande absorbansen under en period av 10 min efter tillsats av CaCl2. Utlöses genom tillsats av Ca2 + (500 nmol/mg mitokondriell protein), minskad absorbansen övervakas vid 540 nm anges mitokondriell svullnader. Med behandling av BKA eller ATR, kalibreringskurvan visade en svag eller skarp minskning jämfört med första absorbans, vilket indikerar att BKA kan hämma mPTP öppna medan ATR kan underlätta den mPTP öppning (figur 4).
Figur 1: software settings för mitokondriell Ca2 + retention kapacitet assay. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: software settings för mitokondriell Ca2 +-utlöst mitokondriell svullnad assay. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Mätning av Ca2 + retention kapacitet. Extra-mitokondriell Ca2 + i isolerade mitokondrier mättes fluorometrically med Ca2 +-bindande grön fluorescerande färgämne i närvaro av 5 μM bongkrekate (BKA), 1 μM atractyloside (ATR) eller tom kontroll (CON). Spår av Ca2 + lagring av isolerade mitokondrier med BKA, ATR och CON mättes på 506 nm (Ex) och 531 nm (Em) på en microplate reader. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Mätning av Ca2 +-inducerad mitokondriell svullnad. Ca2 +-inducerad mitokondriell svullnad av SH-SY5Y i närvaro av 5 μM bongkrekate (BKA), 1 μM atractyloside (ATR) eller tom kontroll (CON) uttrycktes procent minskad kalibreringskurvan av inledande absorbans vid 540 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här, vi beskrivs ett enkelt och effektivt protokoll för mitokondriell Ca2 + retention kapacitet test och Ca2 +-utlöst mitokondriell svullnad assay.
För mitokondriell isolering, se till att alla material och rör är på is, särskilt när homogenisering cellerna. 0,25% trypsin-EDTA kan också användas för att lossa cellerna från skålen för 5 min vid 37 ° C. Efter 15-25 linjer är det nödvändigt att iaktta intakt cellmembranet under mikroskopet och undvika brott på mitokondrierna membranet. Men isolerade mitokondrierna som vi fått är rå mitokondrier och renat mitokondrier kan erhållas genom 1,0 M / 1.5 diskontinuerligt sackaros lutning. Biologiska egenskaper av mitokondrier i levande celler är mer som dessa i vivo än i isolerade mitokondrier på grund av koncentrationerna av medelstora komponenter som omger mitokondrierna. Mitokondriell Ca2 + retention kapacitet eller Ca2 +-utlösta mitokondriell svullnad assay bestämdes strömförande villkor. För bestämning av fungerande mitokondrier, kan 5 mM succinat läggas som respiratoriska substrat istället för glutamat och malate6.
Ca2 +-bindande grön fluorescerande färgämne (binder Ca2 + med en affinitet på 4,29 ± 0,67 mM), är mer lämplig att mäta mikromolära koncentrationer av Ca2 + än högre affinitet färgämnen som fura-2 7. Efter tillsats av de Ca2 +-bindande grön fluorescerande färgämne, ruvning måste vara mindre än 240 s. successiva tillägg av Ca2 + (varierande från 25-200 nmol) injicerades med 1-3 minuters mellanrum. Kalibreringskurvorna visar koncentrationerna av Ca2 + att mitokondrierna inte kan binda, som anger det mitokondriellt upptaget av pulser med Ca2 +. Annars Ca2 +-bindande grön fluorescerande färgämne användes också i calcium signalering undersökningar, såsom intracellulära gratis Ca2 + koncentrationsmätning, följande Ca2 + tillströmning och release och multiphoton magnetisering avbildning av Ca2 + i levande vävnader.
För bestämning av Ca2 + -inducerad mitokondriell svullnad, svullnad kan också induceras med tillägg av 200 mM ATR och CaCl2. Som en kontroll, kan mitokondrier inkuberas med 1 mM CsA för 5 min innan mätning, som hämmade den mPTP öppning. Tidigare forskning visade kalibreringskurvorna av absorbansen som en funktion av procentandelen av svullna mitokondrier14. Det rapporterades att 1 mM CsA, 0,1 mM rutenium röd, och en lika stor volym av färska mitokondrier (0,5 mg/mL) kan läggas i reaktionen när svullnad var fullständig. Eftersom CsA och rutenium röd kan hämma den mPTP öppning i de nyligen tillagda mitokondrierna, ange kalibreringskurvorna både svullna mitokondrier och icke-svullna mitokondrier15. Protokollet av mitokondriell svullnad vid Ca2 + överbelastning är också en effektiv och direkt mätning av Ca2 +-inducerad mPTP öppning.
Sedan upptäckten av transport av Ca2 + mitokondrien från däggdjur och andra högre ryggradsdjur mer än 50 år sedan, har man mycket forskning om mekanismer och funktioner av mitokondriell kalcium efflux och tillströmning. De mitokondriella Ca2 + upptag mekanismerna innehåller den mitokondriella Ca2 + uniporter, det snabb läget eller RaM och de ryanodine receptor (mRyR)16. De analyser som vi beskrivit ovan kan utvärdera Ca2 +-relaterade mitokondriefunktion enkelt och effektivt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
X. Sun övervakade experimenten. Wei Li utfört experimenten. Chen Zhang och X. Sun skrev på papper.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidrag från grant av framstående vetenskapsman i Shandong (JQ201421) och bidrag från NSFC (81371226).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | ATCC (The Global Bioresource Center) | ATCC Number: CRL-2266 | |
| Calcium green-5N | Life Technologies | c-3737 | Ca2+-binding green fluorescent dye |
| complete protease inhibitors | Roche Molecular Biochemicals | 4693116001 | |
| glass homogenizer | Kimble Chase | 9885303002 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | RES5063G-A7 | |
| malate | Sigma-Aldrich | 46940-U | |
| rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 00457 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | V900050 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | V900266 | |
| Varioskan flash instruments | Thermo Scientific | IC100E | |
| Bongkrekate | Biovision | 1820-100 | |
| atractyloside | Sigma-Aldrich | C4992 | |
| high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium | Hyclone | SH30022 | 4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate |
| fetal bovine serum | Hyclone | SV30087 | |
| penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| streptomycin | Invitrogen | 11860-038 | |
| BCA assay kit | Thermo Scientific | NCI3225CH | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| 10 cm cell culture dish | NEST | 704001 |
References
- Rossi, C. S., Lehninger, A. L. Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria. J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).
- Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions. Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).
- Crofts, A. R., Chappell, J. B. Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling. Biochem J. 95, 387-392 (1965).
- Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. Calcium ions in neuronal degeneration. IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).
- Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Rajdev, S., Reynolds, I. J. Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons. Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).
- Stout, A. K., Reynolds, I. J. High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations. Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).
- Bambrick, L. L., et al. Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons. J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).
- Zhao, K., et al. Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury. J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).
- Muriel, M. P., et al. Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death. J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).
- Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure. Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).
- Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).
- Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A. Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).
- Pastorino, J. G., et al. Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore. J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).
- Gunter, T. E., Sheu, S. S. Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).
