Summary
Ca2 + saklama kapasitesi ve Ca2 +incelemek için bir yöntemi açıklamak için bu protokolü amaçlamaktadır - mitokondrial SH-SY5Y izole mitokondri şişme adım adım hücreleri tetikledi.
Abstract
ATP üretimi oksidatif fosforilasyon tarafından mitokondri birincil işlevidir. Mitokondri daha yüksek ökaryotlarda da tampon sitozolik Ca2 + içinde katılmak ve mitokondriyal ATP üretiminde intramitochondrial ücretsiz Ca2 + konsantrasyon tarafından aracılık. CA2 + saklama kapasitesi mitokondri kalsiyum mitokondrial matris korumak yeteneği olarak kabul edilebilir. Birikmiş intrasellüler Ca2 + yol açan iç mitokondrial membran geçirgenliği molekülleri ile bir moleküler kaçağı neden daha az 1,5 kDa ağırlık mitokondrial geçirgenliği geçiş gözenek (mPTP), açılış olarak adlandırdığı. CA2 +-şişme mPTP açılış belirtmek için kullanılır mitokondri tetikledi. Burada, biz Ca2 + saklama kapasitesi ve Ca2 +incelemek için iki deneyleri tarif-izole mitokondri mitokondrial şişme tetikledi. Ca2 + eklenir belirli miktarda sonra tüm adımları bir günde tamamladı ve Mikroplaka okuyucu tarafından kaydedildi. Böylece, bu iki basit ve etkili deneyleri Ca2 +değerlendirmek için kabul edilebilir-mitokondrial işlevleri ile ilgili.
Introduction
Mitokondri memeli hücrelerinde oksidatif fosforilasyon tarafından kullanılan ATP yaklaşık % 95'i üretmek için ana hücresel organlar vardır. Bu münzevi micromolar konsantrasyonu Ca2 + mitokondri tarafından ADP ve inorganik fosfat varlığı ADP sentez ATP1' e fazdan için kullanılabilir bildirilmektedir. Konsantrasyonu sitozolik Ca2 + bir eşiğin gittiğinde, mitokondri alımını Ca2 + hızla olabilir ve sızma bu yavaş yavaş. Böylece, işleyen mitokondri akını artan sitozolik Ca2 +olabilir. Oksidatif fosforilasyon katılımı için alakasız, mitokondrial Ca2 + Ayrıca sitozolik kalsiyum sinyaller de katılmak ve mitokondriyal iç mPTP açılış inducing tarafından mitokondrial apoptotik mekanizması harekete geçirmek membran2. Bu çok anormal yükselmesine intrasellüler Ca2 + 3mPTP açarak mitokondrial büyük şişlik neden olabilir kabul edilmiştir. Böylece, mitokondriyal işlev mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi ve Ca2 +miktarının tarafından değerlendirmek için bu protokolü amaçlamaktadır-mitokondrial şişlik trigged.
CA2 + saklama kapasitesi alımı sitozolik kalsiyum mitokondri yeteneği ölçümdür. Mitokondri sitozolik bedava kalsiyumu tampon ve kalsiyum-bağımlı hücresel süreçler tarafından etkin olmayan precipitates şeklinde kalsiyum alımını düzenleyen. Engelli Ca2 + saklama kapasitesi enerji sınırlama ve hatta nörodejeneratif hastalıklar4,5ile ilgili stres olayları oluşur. İzole mitokondri veya hücreleri digitonin permeabilized Ca2 + saklama kapasitesi tanımlamak için kullanılabilir ve Ca2 + ek Glutamat ve malat ile izole mitokondri tarafından birikir yeteneği yükseltilmiş tarafından etkilenen değil Mitokondrial yalıtım yordamı6. Digitonin titrated bir miktar farklı hücre tipleri plazma zarı permeabilize için kullanılmalıdır. Ca2 +hexapotassium tuz-yeşil flüoresan boya, bir Ca2 +bağlama-hassas cep impermeant görünür ışık telaşlı göstergesi, yaygın olarak kullanılan7oldu. CA2 +-floresan boya düşük-benzeşme göstergesidir ve hücre içi ücretsiz Ca2 + konsantrasyonları sırasında yükselmeye devam göstermek için kullanılan yeşil bağlama uzun süreli (5 dk) elektrodlar8. Bu yöntem radyoaktif filtre tekniği daha az hassas ancak büyük ölçüde basitleştirilmiştir. Ek Ca2 + kalsiyum yeşil Floresans yükseltir ve Ca2 + alımı mitokondri tarafından Floresans taban çizgisine döndürür. Mitokondri alımı extramitochondrial Ca2 + 9başarısız kadar Ca2 + sıralı eklemeler yapıldı. Bir floresan Mikroplaka okuyucu sürekli kalsiyum yeşil Floresans bildirmek için kullanılabilir.
Mitokondri depolarized Ca2 + birikimi sonra yayımlanan Ca2 + orta ve şişmeye başladı. CA2 +-şişme mPTP açılış belirtmek için kullanılır mitokondri tetikledi. Elektron mikroskobu ve Ca2 +ölçmek için kullanılan 540 nm can ışık Absorbans azalma-mitokondrial şişme10,11tetikledi. Mitokondri birim doğrudan nerede Absorbans düşüşler mitokondrial matris pasif şişmesi yansıtmak ileriye doğru açı ışık saçılma12' belirlenebilir.
Burada, mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi ve Ca2 +incelemek için metodoloji göstermek-SH-SY5Y hücreleri izole mitokondri mitokondrial şişme tetikledi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mitokondri yalıtım
Not: Tüm çözümleri ve ekipman olmalı 0 - 4 ° C olarak precooled ve buz tuttu.
- 10 cm hücre kültür çanak başına tohum yaklaşık 3 x 106 SH-SY5Y hücreleri. Yüksek glikoz Dulbecco hücrelerde Kültür'ın kartal orta % 10 fetal sığır serum, penisilin (100 U/mL) ile modifiye-streptomisin (100 µg/mL). Gecede %5 CO2 içeren bir kuluçka 37 ° C'de korumak.
Not: en az 1-2 x 107 SH-SY5Y hücreleri her yalıtım tahlil için ihtiyaç vardır. - Orta kaldırmak ve yaklaşık 1 mL 10 cm hücre kültür tabak içinde buz soğuk PBS hücrelerle 3 kez yıkayın.
- Buz soğuk PBS yeni 1 mL 10 cm hücre kültür çanak içine ekleyin ve yeni bir 1,5 mL tüp içine yapışık hücreleri kazımak. 4 ° C'de 10 dakika 800 x g, santrifüj
- Santrifüjü sırasında proteaz inhibitörleri hisse senedi 50 μL ile takıma 5 mL mitokondrial yalıtım arabellek (250 mM Sükroz, 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazin ethanesulfonic asit), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA) hazırlamak çözüm (100 x konsantrasyon; 1 EDTA ücretsiz tablet GKD2O 500 µL içinde çözünmüş).
- Süpernatant kaldırmak ve Pelet mitokondrial yalıtım arabelleği 1 mL ile resuspend. Buz 30 dk için 1,5 mL tüp kuluçkaya.
- Bir cam homogenizer (15-25 vuruş) askıya alınan hücrelerle yukarı ve aşağı el ile buzda parçalayıcı.
Not: hava kabarcığı yok hücreleri homojen olduğundan emin olun. Sağlam hücreleri ve hücre çekirdeği bared tarafından mikroskop görsel olarak saymak ve bunu teyit > % 90 hücre kırılma oluştu. - Homogenate 1.5 mL tüp ve 4 ° C'de (çekirdek ve kalan sağlam hücreleri) enkaz kaldırmak için 5 min için 1000 x g, santrifüj içine aktarın.
- Yeni 1,5 mL tüp ve 5 min için 1000 x g, santrifüj içine süpernatant transfer 4 ° C.
- Yeni tüp ve 15dk için 14.000 x g, santrifüj süpernatant transfer 4 ° C.
- Süpernatant kaldırmak ve mitokondri 1 mL mitokondrial yalıtım arabelleği ile içeren Pelet resuspend.
- Çözüm 14.000 x g 4 ° C de 15 dakika santrifüj kapasitesi mitokondri çökelti.
- Elde edilen mitokondri Pelet buz tuttu ve 50-100 μL KCl medya (125 mM KCl, 2 mM K2HPO4, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 5 mM Glutamat, 5 mM malat ve 2 mikron rotenon, pH 7,4) herhangi bir eşek önce Pelet hacmine göre resuspended ay.
- Mitokondrial çözüm 5 μL standart BCA tahlil OD562 ölçme tarafından mitokondrial protein konsantrasyonu ölçmek için kullanın bir plaka okuyucu13kullanarak.
2. mitokondrial Ca2 + saklama kapasite tayini
- KCl ortam hazırlamak ve Ca2 +Ekle-0.5 mikron deneme önce son bir konsantrasyon yeşil flüoresan boya bağlama.
- 1 mL izole mitokondri (0.4 mg/mL) 0.5 mikron Ca2 +içeren KCl medya aktarma-her 6-şey tabak içine yeşil flüoresan boya de bağlama.
- Mitokondri ve Ca2 +kuluçkaya-yeşil flüoresan boya oda sıcaklığında 1 dk. eklemek 4 μL aliquots 20 mm CaCl2 çözüm (20 mM CaCl2, 127 mM KCl, 1 mM MgCl2 için ortam ışığı korunuyorsunuz 6-şey plaka bağlama 20 mM HEPES, 5 mM Glutamat, 5 mM malat, pH 7,4) her 6-şey plakasına iyi otomatik kullanarak dağıtmak 200 nmol Ca2 +mitokondriyal /mg protein tanıtmak için ayarlama.
- Floresans Spektrometre Floresans değişiklikleri izlemek için her 3 kullanın s 506 bir uyarma dalga boyu ile 2 min için nm ve emisyon dalga boyu 531 nm. Plaka için 3 600 RPM sallayarak ile donatılmış s yazılım (şekil 1) tarafından kontrol edilen kaynaklar arasında.
- Her şey için bir ek 4 μL aliquot 20 mM CaCl2 çözüm ekleyin ve her 3 Floresans değişiklikleri izlemek s 2 dakika süreyle Floresans zamanla artar kadar bu adımı yineleyin.
Not: Mitokondri ile artan kayıt Floresans tarafından belirtilen ek Ca2 + zorlanmaktadır. MPTP açıldığında, Floresans zamanla artar. - Toplam miktarı mPTP Ca2 + saklama kapasitesi açana kadar eklendi Ca2 + yorumlamak.
3. tespiti Ca 2 +-mitokondrial şişme indüklenen
- Deneme önce KCl ortam hazırlamak.
- İzole mitokondri (0.4 mg/mL) 1 mL KCl medyada de her 6-şey plaka aktarın.
- 20 mm CaCl2 sulu çözüm (500 nmol/mg mitokondrial protein) 10 μL mitokondrial şişme tetiklemek için mitokondrial protein ekleyin.
- 540 Absorbans azalma kaydetmek nm her 3 s 10 dk (Şekil 2) için yazılım tarafından kontrol Mikroplaka okuyucu. Floresans değişiklikleri arasında mitokondri iç zar solutes bir akını tarafından kaynaklanır.
Not: 540 azalmış Absorbans nm karşılık gelen şişmiş mitokondri. Eğer okuyucu bir düşüş Absorbans gözlemleme, bir daha uzun aralığı okuma veya okuma zamanı kabul edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ca2 + saklama kapasitesi temsilcisi sonuçları:
Sonuçlar floresan değerler olarak ifade edildi. Ve Ca2 + (200 nmols/mg mitokondrial protein), yukarıda mPTP açılış temelle Kişilik artışla Floresans ek darbeleri ile. 5 mikron Bongkrekate (BKA), bir inhibitörü olan Ca2 +-indüklenen mPTP açılış veya 1 mikron atractyloside (ATR), Ca2 +bir aktivatör-mPTP açılış indüklenen, izole mitokondri içinde eklenmiştir. Miktarı kadar mPTP açılış Çift Kişilik artış temel Floresans yukarıda gösterilen toplam eklenen Ca2 + Ca2 + saklama kapasitesi yorumlanır. Bizim veri mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi BKA tedavisinde çok bu ATR grubunda daha yüksek olduğunu gösterdi. Bu veriler mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi (şekil 3) uygun ölçüm doğruladı.
Ca2 +temsilcisi sonuçları-mitokondrial şişme indüklenen:
540 Absorbans değişimler yüzde olarak ifade edilen sonuçları nm CaCl2ek sonra 10 dk süreyle ilk Absorbans karşı. Ca2 + (500 nmol/mg mitokondrial protein), 540 izlenen azalmış Absorbans eklenmesi tarafından tetiklenen nm mitokondrial siskinlikler belirtti. BKA veya ATR tedavi ile kalibrasyon eğrisi BKA ATR (şekil 4) açılış mPTP kolaylaştırabilir süre açılış mPTP engellediğini belirten ilk Absorbans için karşılaştırıldığında hafif veya keskin bir azalma gösterdi.
Şekil 1: yazılım ayarları mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi tahlil için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: yazılım ayarları için mitokondrial Ca2 +-mitokondrial şişme tahlil tetiklenen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Ca2 + saklama kapasitesi ölçüm. Ölçülen fluorometrically ekstra mitokondrial Ca2 + izole mitokondri içinde Ca2 +ile-5 mikron bongkrekate (BKA), 1 mikron atractyloside (ATR) veya boş denetim (CON) huzurunda yeşil flüoresan boya bağlama. Ca2 + saklama BKA, ATR ve CON ile izole mitokondri tarafından izleri ölçülen 506 nm (eski) ve 531 nm (Em) Mikroplaka okuyucu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Ölçüm Ca2 +-mitokondrial şişme indüklenen. CA2 +-SH-SY5Y indüklenen mitokondrial şişmesi 5 mikron bongkrekate (BKA), 1 mikron atractyloside (ATR) veya boş denetim (CON) huzurunda 540 ilk Absorbans bir yüzde azalma kalibrasyon eğrisi olarak ifade edilen nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi tahlil ve Ca2 +için basit ve etkili iletişim kuralı açıklanan-mitokondrial şişme tahlil tetikledi.
Mitokondrial yalıtım için tüm malzeme ve tüpler buza, özellikle hücreleri homojenizasyon zaman olduğundan emin olun. % 0.25 tripsin-EDTA yemek 37 ° C'de 5 min için hücrelerden ayırmak için de kullanılabilir. 15-25 vuruş sonra mikroskop altında sağlam hücre zarı gözlemlemek ve mitokondri zar kırılma önlemek gereklidir. Ancak, biz elde izole mitokondri ham mitokondri ve arıtılmış mitokondri 1,0 M elde edilebilir / 1.5M kesintili Sükroz degrade. Biyolojik canlı hücrelerde mitokondri mitokondri çevreleyen orta bileşenleri konsantrasyonları nedeniyle bu vivo içinde izole mitokondri içinde gibi daha fazla özellikleridir. Mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi veya Ca2 +-tetiklenmiş mitokondrial şişme tahlil enerjik koşullar altında kararlıydım. İşleyen mitokondri belirlenmesi için 5 mM süksinat Glutamat ve malat6yerine solunum yüzeyler olarak eklenebilir.
CA2 +-yeşil flüoresan boya bağlama (Ca2 + 4.29 ± bir ilgi ile bağlar 0.67 mM), Ca2 + fura-2 7gibi yüksek afinite boyalar daha micromolar konsantrasyonlarda ölçmek daha uygundur. Sonra Ca2 +ek-yeşil flüoresan boya, bağlama kuluçka az 240 s. art arda gelen eklemeler (25-200 nmol değişen) Ca2 + 1-3 dk aralıklarla enjekte olması gerekir. Kalibrasyon eğrileri mitokondri çekilmek mümkün olan Ca2 + konsantrasyonları Ca2 +darbeleri mitokondrial alımını gösteren göstermek. Aksi takdirde, Ca2 +-yeşil flüoresan boya da araştırmalar, hücre içi ücretsiz Ca2 + konsantrasyonu ölçümü, aşağıdaki Ca2 + akını ve yayın ve multiphoton uyarma gibi sinyal kalsiyum içinde kullanılan bağlama Ca2 + canlı dokularda görüntüleme.
Tayin edilmesi Ca2 + -mitokondrial şişlik, indüklenen şişme-da var indüklenen 200 mM ATR ve CaCl2eklenmesi ile. Bir denetim olarak mitokondri açılış mPTP inhibe ölçüm önce 5 min için 1 mM CsA ile inkübe. Önceki araştırma Absorbans kalibrasyon eğrileri şişmiş mitokondri14yüzdesi bir fonksiyonu olarak gösterdi. Bu o 1 mM CsA, 0,1 mM rutenyum kırmızı, bildirildi ve taze mitokondri (0,5 mg/mL) eşit bir hacmi tepki şişme tam eklenebilir. CsA ve rutenyum kırmızı taze ekledi mitokondri açılış mPTP inhibe olabilir çünkü kalibrasyon eğrileri şişmiş mitokondri ve sigara şişmiş mitokondri15gösterir. Mitokondrial şişlik Ca2 + aşırı üzerine de bir etkili ve doğrudan ölçümü Ca2 +protokoldür-mPTP açılış indüklenen.
Keşfi Ca2 + mitokondri memeliler üzerinden tarafından ve diğer yüksek omurgalılarda taşımacılığı beri 50'den fazla yıl önce mekanizmaları ve mitokondrial kalsiyum sızma ve akını fonksiyonları üzerinde çok araştırma olmuştur. Mitokondrial Ca2 + alımı mekanizmaları mitokondrial Ca2 + uniporter, hızlı modu veya RaM ve16ryanodine reseptör (mRyR) içerir. Can açıkladığımız deneyleri Ca2 +değerlendirmek-basit ve etkili mitokondriyal işlev ilgili.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
X. güneş deneyler denetlenir. Wei Li deneyler yapılır. Chen Zhang ve X. güneş kağıt yazdı.
Acknowledgments
Bu çalışmada Shandong seçkin bilim adamı (JQ201421) ve NSFC (81371226) hibe verilmesi gelen hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | ATCC (The Global Bioresource Center) | ATCC Number: CRL-2266 | |
| Calcium green-5N | Life Technologies | c-3737 | Ca2+-binding green fluorescent dye |
| complete protease inhibitors | Roche Molecular Biochemicals | 4693116001 | |
| glass homogenizer | Kimble Chase | 9885303002 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | RES5063G-A7 | |
| malate | Sigma-Aldrich | 46940-U | |
| rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 00457 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | V900050 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | V900266 | |
| Varioskan flash instruments | Thermo Scientific | IC100E | |
| Bongkrekate | Biovision | 1820-100 | |
| atractyloside | Sigma-Aldrich | C4992 | |
| high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium | Hyclone | SH30022 | 4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate |
| fetal bovine serum | Hyclone | SV30087 | |
| penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| streptomycin | Invitrogen | 11860-038 | |
| BCA assay kit | Thermo Scientific | NCI3225CH | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| 10 cm cell culture dish | NEST | 704001 |
References
- Rossi, C. S., Lehninger, A. L. Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria. J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).
- Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions. Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).
- Crofts, A. R., Chappell, J. B. Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling. Biochem J. 95, 387-392 (1965).
- Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. Calcium ions in neuronal degeneration. IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).
- Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Rajdev, S., Reynolds, I. J. Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons. Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).
- Stout, A. K., Reynolds, I. J. High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations. Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).
- Bambrick, L. L., et al. Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons. J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).
- Zhao, K., et al. Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury. J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).
- Muriel, M. P., et al. Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death. J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).
- Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure. Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).
- Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).
- Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A. Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).
- Pastorino, J. G., et al. Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore. J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).
- Gunter, T. E., Sheu, S. S. Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).
