Summary
Myelinating oligodendrocytes fremme rask action potensial forplantning og neuronal overlevelse. Beskrevet her er en protokoll for oligodendrocyte-spesifikke uttrykk for fluorescerende proteiner i organotypic hjernen skiver med påfølgende tidsinnstilt bildebehandling. Videre, en enkel prosedyre for å visualisere unstained kvinne myelin presenteres.
Abstract
Neurons er avhengige av den elektrisk isolasjon og trophic støtte av myelinating oligodendrocytes. Til tross for betydningen av oligodendrocytes, blitt de avanserte verktøyene som brukes til å studere neurons, bare delvis tatt på av oligodendrocyte forskere. Celle type-spesifikk farging av viral signaltransduksjon er en nyttig tilnærming å studere live organelle dynamics. Dette dokumentet beskriver en protokoll for å visualisere oligodendrocyte mitokondrier i organotypic hjernen skiver av signaltransduksjon med adeno-assosiert virus (AAV) bærer gener for mitokondrie målrettet fluorescerende proteiner under transcriptional kontroll myelin basic protein arrangøren. Det inkluderer protokollen for å gjøre organotypic koronale musen hjernen skiver. En prosedyre for tidsinnstilt bildebehandling av mitokondrier deretter følger. Disse metodene kan overføres til andre og kan være spesielt nyttig for å studere organeller i myelin-skjeden. Til slutt, beskriver vi en lett tilgjengelig teknikk for visualisering av unstained kvinne myelin i levende skiver av AC Confocal refleksjon mikroskopi (kjernen). Kjernen krever ingen ekstra utstyr og kan være nyttig å identifisere myelin-skjeden under live bildebehandling.
Introduction
Hjernens hvit substans består av nerve celle axons innpakket i myelin, en spesialisert utvidet plasma membran av oligodendrocytes. Myelin kreves for rask og pålitelig handling potensial forplantning og langsiktige overlevelse av myelinated axons, og tap av myelin kan forårsake Nevrologisk dysfunction. Til tross for deres betydning, er egenskapene til oligodendrocytes mindre kjent sammenlignet med neurons og astrocyttene. Derfor har færre verktøy blitt utviklet for å studere oligodendrocytes.
Live bildebehandling av cellen organelles som mitokondrier, endoplasmatic retikulum (ER) eller annen vesicula strukturer kan være nyttig å studere dynamiske endringer i organeller over tid. Tradisjonelt blitt avbilding av levende oligodendrocytes utført i monokulturer1,2. Men oligodendrocytes i monokultur vises ikke kompakt myelin, og organotypic eller akutt hjerne stykker kan derfor være et bedre alternativ når studere lokalisering og bevegelse av organeller. Lokalisering av små organeller og proteiner i myelin-skjeden kan være utfordrende på grunn av den korte avstanden mellom myelinated axon og omkringliggende myelin-skjeden. Dermed har ikke lys mikroskopiske immunostai-prosedyrer alene romlig oppløsning å forskjellsbehandle organeller i myelin-skjeden og de myelinated axon. Dette kan løses ved viral signaltransduksjon med gener for organelle målrettede fluorescerende proteiner drevet av celle type-spesifikk arrangører. Fordelene er en celle-spesifikke og sparsom uttrykk, som muliggjør nøyaktig vurdering av organelle lokalisering og dynamikk. Transgene dyr kan også brukes til å oppnå slike en organelle målrettede celle-spesifikke uttrykk3. Men produksjon og vedlikehold av transgene dyr er dyre og vanligvis tilbyr ikke sparsommelig uttrykket oppnås ved viral metoder.
Metoden beskrevet bruker her viral Albin på oligodendrocytes med mitokondrie målrettede fluorescerende proteiner (dsred eller grønn fluorescerende protein, GFP) drevet av myelin basic protein selskapet (MBP-mito-dsred eller MBP-mito-GFP) for å visualisere oligodendrocyte mitokondrier i organotypic hjernen skiver. I tillegg brukes uttrykk for en annen fluorescerende protein i cytoplasma (GFP sammen med mito-dsred eller tdtomato med mito-GFP) til å aktivere visualisering av cellen morfologi, inkludert cytoplasmatiske seksjonene av myelin-skjeden. Protokollen inneholder fremgangsmåten for å gjøre organotypic hjernen skiver (en modifisert versjon av protokollen som De Simoni og Yu, 20064,5). Vi beskriver time-lapse tenkelig prosedyren for å studere mitokondrie bevegelse. Denne fremgangsmåten bruker en oppreist AC confocal mikroskop med en kontinuerlig utveksling av tenkelig medium, et oppsett som muliggjør enkel bruk av narkotika eller andre mellomstore endringer under bildebehandling. Time-lapse tenkelig prosedyren kan utføres på alle AC confocal mikroskop, noe ekstra utstyr for å opprettholde levende skiver som beskrevet nedenfor. Protokollen inneholder også flere tips for å optimalisere bildebehandling og redusere Phototoksisitet.
Til slutt, en rask og enkel måte å visualisere unstained kvinne myelin ved AC Confocal refleksjon mikroskopi (kjerne) er beskrevet. Dette kan være nyttig for å identifisere myelin-skjeden under live bildebehandling. De siste årene, flere teknikker har blitt utviklet til bildet myelin uten noen flekker nødvendig, men de fleste av disse krever bestemte6,7,8-med utstyr og ekspertise. Fremgangsmåten som er beskrevet her reflekterende egenskapene for myelin-skjeden og er en forenklet single-eksitasjon bølgelengde versjon av Spectral AC Confocal refleksjon mikroskopi (SCoRe, der flere laser bølgelengder kombineres for å visualisere myelin) 9. kjernen kan gjøres på noen AC confocal mikroskop som har 488 nm laser og en 470-500 nm Båndpassdesign utslipp filter eller filtere tunable utslipp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
prosedyrene som er beskrevet her er godkjent av den norske dyr forskning. Leverandører og katalogfilene tall for forbruksvarer og andre nødvendige utstyr er tilgjengelige i listen materialer på slutten av dokumentet.
1. forberedelse av Organotypic skiver
Merk: denne oppskriften bruker to mus pups på postnatal dag 7-9 (p7-9), som gir 24 organotypic skiver fordelt på to seks-brønnen retter. Ikke annet er angitt, alle prosedyrer bør gjøres i sterilt hette og nitril eller latex hansker bør brukes. Bare celle kultur grade bestanddel bør brukes.
- Autoclave flasker, disseksjon verktøy (1 stor saks, 1 liten saks, 1 stor flate slikkepott, 1 liten avrundet og skjerpet spatel og 1 tang, se materialer liste for detaljer), glass Pipetter, pipette-spisser og vev kluter brukes for skive utarbeidelse.
- Som halvparten av glass Pipetter bør brukes med den store åpningen, bryte av den smale enden.
- Score med en diamant scriber penn (hvis tilgjengelig) rundt pipette rett under punktet hvor glasset begynner innsnevring. Plass den spisse enden av Pipetter i en nitril eller lignende. Nøye bryte tipset ved å bøye pipette mens skyve den mot en arbeidsbenk.
- Så sløv brutt slutten ved å gni på et stykke sand papir eller smelte litt på en Bunsen-brenner. De ødelagte Pipetter brukes til å overføre kuttet hjernen skiver med brukket slutten omgjort til gummi pære og store åpne slutten berøre løsning/skiver.
Merk: Dette er ikke gjort i sterilt hette og kan gjøres flere dager i forveien.
- Forberede kultur retter.
Merk: Dette kan gjøres før kutting eller minst 2 timer før kutting.- Sterilisere Polytetrafluoroethylene (PTFE) membraner (" konfetti "). Bruk to sterile pinsett fjerne enkelt konfetti fra omkringliggende blå plast bitene og sterilisere av dipping to ganger i en Petriskål med 96% etanol (EtOH). Deretter legge konfetti i et sterilt store Petriskål tørke.
Merk: Konfetti er hydrofile PTFE membraner ligner på membraner i kultur skivene. Bruk av konfetti hjelpemidler det live imaging fordi enkelt skiver kan enkelt overføres fra innsatsen til mikroskopet oppsett ved å løfte konfetti med tang (se 4.8. for detaljer). Alternativt kan hjernen skiver kultivert uten konfetti (der skiver vil legge direkte til membranen av kultur sette). I dette tilfellet membran innsatsen kuttes med en skalpell overføre stykket til mikroskopet badekaret. - Legge til 1 mL av kultur medium (oppskrift i reagenser ' tabell) til hver brønn av seks-brønnen rettene.
- Sted en kultur inn i hver brønn ved hjelp av sterile pinsett. Unngå luftbobler mellom innsettings- og kultur medium.
Merk: For å spare penger og miljøet, er det mulig å bruke kultur skivene. Dette kan gjøres ved å skylle grundig i destillert H 2 O (dH 2 O) etterfulgt av inkubasjon i 70% EtOH i minst 24 timer før gjenbruk. Når forbereder ny kultur, tørr som setter inn i en celle kultur plate under ultrafiolett (UV) lys for 15-30 min.
Setter inn - sted to (sterilisert og tørr) konfetti på hver av kulturen. Plasser konfetti mot kantene av skivene å få minimal overlapping.
- Sette platene i celle kultur inkubator på 37 ° C med 5% CO 2.
- Sterilisere Polytetrafluoroethylene (PTFE) membraner (" konfetti "). Bruk to sterile pinsett fjerne enkelt konfetti fra omkringliggende blå plast bitene og sterilisere av dipping to ganger i en Petriskål med 96% etanol (EtOH). Deretter legge konfetti i et sterilt store Petriskål tørke.
- Boble kaldt disseksjon medium (oppskrift i reagenser ' tabellen) med bioxide gass (95% O 2 /5%CO 2). For å holde løsningen sterilt, koble røret fra gassflasken til filtere sterile sprøyter (0.22 µm porestørrelse).
- Par den andre enden av filteret slik sterilt koblet til en steril glass pipette. Plasser glass Pipetter i løsningen, dekk med parafilm og slå på gassen. Holde disseksjon mediet på ice.
- Forberede området disseksjon/kutting.
Merk: Ideelt sett denne fremgangsmåten bør gjøres i sterilt hette. Hvis dette ikke er mulig, kan du vibratome stå på en arbeidsbenk. I dette tilfellet er det anbefalt å bruke en hår nettet og ansikt maske.- Bruker en enkel kant razor blad, klippe ut et rektangulært stykke (ca 2 cm x 0,5 cm) agarose gel (oppskrift i reagenser ' tabell) og Lim dette på vibratome scenen slik at langsiden ansikter vibratome bladet.
- Rengjør alle flater og vibratome deler med 70% EtOH og tørk med autoklaveres vev kluter.
Merk: Det er viktig at alle bitene som vil klontakte hjernevev er helt tørt siden EtOH kan skade cellene. - Knytter et sterilt barberblad til vibratome og utføre vibrasjon sjekk hvis vibratome har denne funksjonen.
- Sted autoklaveres disseksjon verktøy i panseret med autoklaveres vev wipes, fire små Petri retter, rund-hjørnet skalpell, 2 glass Pipetter med gummi pærer, to åpne slutten glass Pipetter (se pkt. 1.1) og super lim (sprayet med EtOH).
- Hell boblet disseksjon medium i vibratome båten og i fire Petri småretter.
Merk: Dette trinnet bør bare gjøres umiddelbart før disseksjon siden medium fra dette punktet ikke boblet eller holdt på ice.
- Analysere og mount hjerner.
Merk: For å oppnå sunn skiver, dette trinnet må gjøres raskt og nøyaktig. Noen praksis er nødvendig.- Euthanize dyr #1 av forvridning i neckor etter lokale retningslinjer og deretter halshugge med store saksen.
- Bruke små, skarp saks, raskt fjerne hud ved å gjøre et sagittal snitt fra nakken til nesen og trekk til side å avsløre skallen.
- Kutt langs det sagittal suture, etterfulgt av lateral snitt over den indre delen av frontal bein og lamboid Sutur (grensen mellom hjernen og lillehjernen).
- Bruk tang til å bøye åpne skallen på hver side. Hjernenerve er avskåret fra hjernen ved å sette inn en avrundet, skarpe slikkepott under ventrale siden av hjernen og forsiktig flytte spatula lateralt.
- Bruker en enkel kant razor blad for å gjøre en Koronal kutte rostral til lillehjernen.
Merk: Dette kuttet avgjør vinkelen som kuttes i skiver. Det bør derfor gjøres i rett vinkel. - Vend hjernen ut av skallen og i en liten Petriskål inneholder disseksjon medium.
- Gjenta trinn 1.6.1.-1.6.4. for dyr #2 og sted rett denne hjernen i en andre Petri.
Merk: Dyrene er ikke sterile. Utføre dissection på siden av panseret og deretter flytte til andre, ren side når hjernen er fjernet fra skallen. - Endre hansker.
- Fest hjernen vibratome scenen: Legg et tynt lag av superlim til scenen rett foran montert agarose gel. Hold hjernen #1 med en stor flate slikkepott med fersk kuttet (caudal) siden berøre spatula og det ventrale vendt (og blir så nær som mulig til) agarose gel.
- Deretter forsiktig plassere hjernen på limet ved å skyve det av spatula med en tang. Kontroller at plass for hjernen #2.
Merk: Det er viktig at hjernen er godt festet til scenen, men uten overdreven lim, som dette kan hindre skjæring.
- Deretter forsiktig plassere hjernen på limet ved å skyve det av spatula med en tang. Kontroller at plass for hjernen #2.
- Umiddelbart etter montering av hjernen #1, bruker den store slikkepott til noen dråper av disseksjon medium på hjernen. Dette vil holde hjernen fuktig, herde limet og forhindre stikker til sidene av hjernen.
- Gjenta 1.6.7 og 1.6.8. for hjernen #2.
- Legge scenen på vibratome båten.
- Skiver 230 µm tykk koronale med en amplituden 1-1,5 mm, en frekvens på 85 Hz og en hastighet av 0.2 mm/s. samle skiver ca mellom 1,4 mm rostral og 2.1 mm caudal til Bregma.
- Samle skiver etter hvert stykke har blitt kuttet ved hjelp av åpne slutten glass Pipetter (pt. 1.1). Overføre skiver til en Petriskål inneholder disseksjon medium. Bruke avrundede skalpell for å kutte skiver i to deler, dele de to halvkulene.
- Når alle sektorene er kuttet, plassere skiver i kultur rettene.
- Ta kultur parabol (en samtidig) ut av inkubatoren.
- Bruke de åpne slutten glass Pipetter, nøye overføre en del til hver av konfetti.
Merk: Skiver bør ligge flatt i konfetti. Dette krever litt dyktighet. Men hvis noen skiver ikke perfekt, det er bedre å la dem enn å tilbringe tid på å flytte dem som det er viktig å få alle sektorene i inkubator mulig. - Bruker en glass pipette (spisse enden) Fjern overflødig medium uten å berøre sektoren.
Merk: Skiver bør ikke være nedsenket i væske under incubation. Overflødig medium må derfor være aspirated slik at sektorene er eksponert for luft (en tynn film av mediet vil fortsatt dekker skiver). Skiver som er midt i væsken vil vanligvis være usunn eller dø (4 og våre observasjoner). - Flytte rett tilbake i inkubator når alle konfetti har én sektor.
- Gjenta 1.7.8.-1.8.4. for rett #2.
- Endre kultur medium.
Merk: Dette bør gjøres dagen etter kutting (dag 1 i vitro, DIV1) og deretter hver 2-3 dager.- Forvarm kultur medium i et vannbad eller inkubator.
- i sterilt hette, bruke vakuum sugekraft eller en vanlig pipette med et sterilt tips inneholder kultur medium i hver brønn. Dette gjøres ved forsiktig tipping rett (ved ca 30 grader) og å plassere pipette på kanten av kultur sette.
- Ta ca 800 µL fra hver brønn (forlater bare nok medium for å holde bunnen av sette dekket i medium). Deretter bruker en ren pipette, legge til 800 µL av forvarmet medium i hver brønn. Plasser retter tilbake i celle kultur inkubator.
2. Viral signaltransduksjon
- Kjøp eller lage AAVs med en plasmider av interesse, som beskrevet tidligere 10 , 11.
Merk: Denne protokollen beskriver bruken av AAV serotype 2/8 (AAV 2/8) bærer mitokondrie målrettet dsred eller GFP som en reporter genet under transcriptional kontroll av myelin basic protein promoter 12 (AAV2/8 MBP_mito_dsred eller AAV2 / 8 MBP_mito_GFP) å visualisere oligodendrocyte mitokondrier. AAV 2/8 bærer GFP eller tdtomato som reporter genet drevet av generelle CAG selskapet (AAV 2/8 CAG_GFP eller AAV 2/8 CAG_tdtomato) brukes til å visualisere oligodendrocyte cytoplasma. Dermed kombinasjonen av AAV2/8 MBP_mito_dsred med AAV 2/8 CAG_GFP gir røde mitokondrier og grønne cytoplasma i oligodendrocytes, mens AAV2/8 MBP_mito_GFP og AAV 2/8 CAG_tdtomato gir grønne mitokondrier og røde cytoplasma. Konstruerer er beskrevet i mer detalj andre steder 13. - På dag 7 i vitro (DIV7), transduce oligodendrocytes med AAVs.
Advarsel: Følg sikkerhetsforskrifter for å arbeide med AAVs. Kontroller at du har riktig trening og Biosafety nivå godkjenning kreves. Alle følgende punkter skal utføres i et klasse II biosafety skap med hansker og Laboratoriefrakk. Her, er anvendelse av AAV cortex området sektorene beskrevet, som dette er området der beste utvinning.- Dilute AAV i forvarmet (37 ° C) kultur medium. Fortynninger rundt 2 × 10 9 genomet Kopier/mL (GC/mL) anbefales å få en sparsom Albin på oligodendrocytes som muliggjør avbilding av enkeltceller i stykket. Men bør en pilot med forskjellige titers gjøres for å sikre en tetthet av transduced oligodendrocytes som passer for bestemte eksperimenter. Hvis det brukes to ulike AAVs, de skal være blandet i den samme løsningen og lagt til sektoren samtidig.
- Legge til rundt 1,3 µL utvannet AAV til hver skive: Kontroller utsiden pipette tips er tørt. Pipetter 1.3 µL utvannet AAV og holde pipette over cortex, så nært som mulig uten å berøre sektoren med Pipetter spissen (ca 1 mm bort).
- Deretter sakte skyve løsning av pipette. Når løsningen berører sektoren, flytter pipette spissen over cortex å spre løsningen over hele cortex området.
Merk: Denne fremgangsmåten bør gjøres så fort som mulig for å unngå å holde skiver av panseret lenger enn nødvendig. Gjøre dette på en rett samtidig og sette den første parabolen tilbake i inkubator før du starter på parabolen #2. Å få en tilfredsstillende fordeling av AAV uten skade vevet krever litt øvelse og en stødig hånd.
- Hvis en oppreist fluorescens mikroskopet er tilgjengelig i celle lab, protein uttrykk kan kontrolleres i løpet av tiden i kultur ved å plassere rett under mikroskopet.
Merk: Parabolen burde ikke være holdt av inkubator for mer enn 2-5 minutter.
3. Tidsinnstilt bildebehandling
Merk: avbilding kan utføres når uttrykket fluorescerende markører er tilstrekkelig og skiver ser sunn (vanligvis DIV11-14).
- Kontroller at mikroskop, perfusjon og oppvarming er konfigurert slik at boblet avbildningsløsning er oppvarmet og kan angi og avslutte badekaret.
Merk: Ulike løsninger finnes for bad kamre. En enkel versjon er presentert her.- Lage inn- og uttak på badet av avstumpet sprøyte nåler (bøyd i ~ 45°) som er knyttet til sidene på badet av blu-tack/moro tack.
- Sikrer at slangen går fra en flaske kontinuerlig boblet avbildningsløsning, via peristaltiske pumpen, gjennom oppvarming røret av ovnen, og deretter til innløp sprøytenålen i badekaret.
- Koble en annen rør til sprøyte nål uttaket. Denne rør deretter går via peristaltiske pumpen og tilbake til flasken Imaging løsning (eller en avfall flaske).
- Boble imaging løsning (oppskrift i reagenser ' tabellen) med bioxide gass.
Merk: Dette bør være staRTed minst 15 minutter før bildebehandling og fortsette utover forsøket. - Slå på peristaltiske pumpen og Varmeovn og kjøre løsning gjennom badet å få optimal badevann (37 ± 0,5 ° C). Sikre at termometer sensoren koblet til temperatur enhet er neddykket i Bad løsningen.
- Slå på mikroskopet, fluorescens lampe og riktig lasere.
- Sett et egnet lys banen for eksempel.
Merk: Dette vil variere avhengig av mikroskopet oppsett og sonde. Generell kunnskap om hvordan du bruker AC confocal mikroskopet kreves og deles ikke med her. - Bruker et vann nedsenking mål med passende forstørrelsen og numeriske blenderåpning (na). Vi bruker en 40 x vann nedsenking plan-apochromat målsetting (n.a. 1.0).
- Åpen pinhole å oppnå en optisk del av ca 2-2.5 µm for time-lapse video. Dette reduserer forekomsten av mitokondrier flytte ut av fokus under time-lapse.
- Overføre organotypic sektor bad:
- legge til en dråpe bildebehandling løsning eller kultur medium i en liten plast Petriskål.
- i sterilt hette, bruk sterilt tang overføre én organotypic sektor fra membranen setter til drop. Pinsett bør bare ta konfetti og ikke stykket.
- Sette lokk på Petriskål.
- Umiddelbart satt kultur parabol med resten av sektorene tilbake i inkubator.
- Bringe Petriskål inneholder sektoren til mikroskopet.
- Slå av peristaltiske pumpen ved overføring skive til mikroskopet bath. Bruk først tang for å løfte konfetti med SKIVE fra Petriskål øverst på badet (konfetti flyter). Deretter plasserer to tips av Tang på hver side av konfetti slik at de berører konfetti uten å berøre sektoren, og skyv konfetti løsningen til bunnen av badekaret. Midtstille konfetti i badekaret.
- Bruk tang plassere hold ned ankeret (harpe) over konfetti uten å berøre sektoren.
Merk: En harpe er en hesteskoformet platina anker som brukes til å hindre stykket fra flytende eller drivende i badekaret. For akutt skiver løpe tynne strenger fra en side av harpe til den andre (ligner en musikk harpe). For organotypic skiver, harpe bør være stringless og plass konfetti slik at det kan legge på konfetti uten å berøre sektoren. - Aktiverer peristaltiske pumpen på.
- Lavere målet ned prøven.
- Velg cellen og regionen bildet.
Merk: Unngå overdreven eksponering av cellene til laser lys som kan dette føre til celle toksisitet (se tips i punktene nedenfor).- Bruker okularene og lysrøret for å finne en sunn utseende oligodendrocyte med riktig uttrykk. Vanligvis vises oligodendrocytes som har en sterk overuttrykte fluorescerende protein usunn. Usunn oligodendrocytes vil ha prosesser med en blobby utseende, og mitokondrier vises fragmentert. Sunn oligodendrocytes, soma og prosesser vises glatt og mitokondrier har ulike lengder (men vanligvis mye kortere enn i neurons og astrocyttene 13 , 14 , 15).
- Plasser cellen rundt i synsfeltet.
- Bruk av " live " fungerer i programvaren (for Leica og Zeiss mikroskop) å identifisere cellen på skjermen og velge et område av interesse, f.eks en del av cellen som inneholder flere primære prosesser eller myelin sheaths, eller en enkelt prosess eller myelin-skjeden.
Merk: For å kunne bilde så mye av prosesser/hylser som mulig, velge områder som inneholder prosesser som lå relativt flatt i x-y-retningen. - Inn i feltet av interesse (vanligvis produserer et bilde med pikselstørrelsen av 0.14 - 0,30 µm).
- Bruke den " områder " verktøyet, tegner du et rektangel rundt området og velge Skann kun det markerte området. Skanning tid, og dermed laser eksponering, reduseres bare skanning den valgte regionen.
Merk: Horisontal rektangulære områder vil bli skannet raskere enn loddrette områder på grunn av kortere skannede linjer nødvendig. Hvis en loddrett rektangel region er skannet, skanningen tid kan reduseres ved å rotere feltet skanning 90 grader (rotasjonsverktøyet).
- Juster laser makt og vinning å få innblikk i mitokondrier.
Merk: Bruke minimal laser kraften som trengs. Hvis mulig, slå opp gevinst i stedet for å øke laser makt. I tillegg til forårsaker celle toksisitet, vil for høy laser makt bleke fotografert objektene over tid, noe som krever en ytterligere økning i laser makt eller få under skanning. Den nødvendige laser makt og vinning vil avhenge av hvilket uttrykk og mikroskopet. Med en LSM700 AC confocal mikroskop, vi bruker en 555 nm laser på en strøm av 20-40 µW til bildet dsred eller tdtomato og en 488 nm laser brukes på 20-30 µW å image GFP (laser kraften målt på den tilbake blenderåpningen på målet). Gevinst er satt høyt for live bildebehandling, vanligvis i 700-800 for GFP og 850-980 for dsred og tdtomato. Høy gevinst kan forårsake noen mer bakgrunnsstøy, som er fjernet ved å øke digital forskyvningen (forskyvning verdiene vanligvis lå mellom 0 og 15). I vår erfaring, benytter MBP_mito_GFP gir en bedre signal-til-støy enn MBP_mito_dsred. - Velg skanning fart.
Merk: Minimere skanningen tid ved hjelp av en rask skanning fart og tegne en liten skanning region (se punkt 4.10.5 nedenfor). Det er også mulig å lagre skanning tid ved å utføre en toveis skanning. Men dette anbefales ikke på grunn av dårligere bildekvalitet. - Sett hyppighet og varighet av tid-lapse innspillingen, ta bilder hvert 2 sekunder for totalt 20 minutter for mitokondrie imaging i oligodendrocytes f.eks.
Merk: Hyppighet og varighet bør settes etter mobilitet for objekter av interesse. En høyere frekvens vil utsette prøven laserprodukter mer lys, men raskere bevegelige objekter krever også en kortere total varighet på time-lapse videoer (f.eks mitokondrier i neurons, som flytter oftere og en mye høyere hastighet enn mitokondrier i oligodendrocytes, er vanligvis avbildet hvert sekund i totalt 2 minutter 16). - Start tid-lapse innspillingen.
Merk: Mitokondrier kan flytte ut av fokus og/eller drift av regionen fotografert under innspillingen. For å redusere vibrasjoner og bevegelse, kan du justere inn - og utløp av badekaret og redusere pumpen fart hvis nødvendig. Små endringer i fokus vanligvis fortsatt forekomme. Dermed kontinuerlig overvåking av skjermen under imaging er nødvendig med små justeringer i fokus under innspillingen. - Fange en z-stabel av hele cellen for fremtidig identifisering av cellen og fotografert prosessen.
Merk: For bedre oppløsning,-hullet, bør tilbakestilles til 1 luftige enhet for z-stakken. - Valgfritt: visualisere unstained kvinne myelin.
Merk: I oligodendrocytes transduced med (cytoplasmatiske) GFP, myelin hylser kan vanligvis identifiseres som rette linjer av cytoplasma (cytoplasmatiske åsene) koblet til en primær prosess (se figur 2 A og B). Men hvis GFP uttrykk er svak eller merketråd cytoplasmatiske brukes ikke, er det mulig å visualisere myelin-skjeden ved AC confocal refleksjon mikroskopi (kjernen) som forklart her.- Satt opp en ny lett bane i programvaren med laser eksitasjon på 488 nm og fange slippes ut lys rundt samme bølgelengde, f.eks 470-500 nm.
- Juster laser makt og få til myelin er synlig (se eksemplet i < sterk class = "xfig "> figur 3). Bruker en LSM 510 Meta mikroskop, vi vanligvis bruker en laser makt av 7-12 µW (målt tilbake blenderåpning for målsettingen).
- Valgfritt: utarbeidelse av skiver for immunostaining.
- Hvis fotografert cellen må identifiseres etter immunostaining, ta en lav forstørrelse bilde (10 x) av cellen og angi plasseringen i bildet ved å tegne en pil eller lignende. For å hjelpe oppdagelsen av cellen, er det anbefalt å også tegne kart manuell på hele sektoren, som angir plasseringen av cellen.
- Fastsette skjær i 4% paraformaldehyde (PFA) på shaker i 1 time i rom temperatur.
FORSIKTIG: PFA er skadelig. Bruk beskyttende slitasje og bare bruke i ventilert hette. - Fortynne bindemiddel 1:10 i PBS og la på 4° C før starter immunohistochemistry som beskrevet andre steder 17.
Merk: Selv om skiver kan stå i utvannet bindemiddel i flere uker, fluorescens kan svekkes. Utfører immunohistochemistry innen 10 dager etter fiksering anbefales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organotypic hjernen skiver som var kultivert og transduced som beskrevet ovenfor viste en sparsom fordeling av kortikale oligodendrocytes uttrykke mito_dsred og GFP. Immunostaining med antistoffer mot Olig2 og MBP bekreftet at uttrykket var spesifikke for oligodendrocytes (figur 1).
For live bildebehandling, ble transduced oligodendrocytes anerkjent av sine karakteristiske morfologi av flere myelin sheaths kjører parallelt (figur 1 og figur 2A). Ved å utføre tidsinnstilt bildebehandling på de transduced oligodendrocytes, er det mulig å overvåke bevegelsen av mitokondrier i primære prosesser og myelin sheaths (figur 2B-D).
I celler med lav GFP uttrykk, myelin-skjeden kan bli identifisert i løpet live bildebehandling ved å belyse prøven på 488 nm og fange slippes ut lys 470-500 nm (figur 3A). Denne refleksjon AC Confocal mikroskopi (kjernen) teknikken også jobbet på PFA fast og immunostained vev, selv om myelin Slirer dukket dimmer (figur 3B-C). Av immunostaining med antistoffer mot myelin basic protein (MBP), vi fant ut at nær 100% av myelin sheaths legging vannrett tenkelig flyet (angitt med pilspisser figur 3B-C) vises med kjerne, mens myelin Slirer det lå vinkelrett synsfelt (angitt med stjerner figur 3B-C) er mindre eller ikke synlig. Selv om nesten alle internodes er visualisert, vises mange internodes usammenhengende, med små deler av skjede ikke er synlig (figur 3A sett inn). Disse små "hull" i myelin kan fylles ut av bildebehandling med tre komplementære bølgelengder, såkalte SCoRe9.
Figur 1 : Immunohistochemistry bekrefter at MBP-mito-dsred uttrykkes selektivt i oligodendrocytes som er immun positivt for Olig2 og MBP. Bilder er fra neocortex av kultivert musen hjernen skiver transduced med (AAV2/8) MBP-mito-dsred (rød, mitokondrie markør) og CAG-GFP (grønn, stoffer). Skiver var immunolabeled for myelin markør Myelin Basic Protein (MBP, blå) og Olig2 (oligodendrocyte avstamning celle kjernefysiske markør, magenta). (Figur endret fra referanse13) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Time-lapse tenkelig å spore mitokondrie bevegelser i oligodendrocytes. (A) projeksjon av z-stabel (optisk delen 10.35 µm) av oligodendrocyte transduced med MBP_mito_dsred (rød mitokondrier) og CAG_GFP (grønn fluorescens). (B) AC confocal enkeltbilde (optisk delen 1.04 µm) av samme celle. Firkanten angir regionen som er valgt for tidsinnstilt bildebehandling (C) og linjer trukket for å gjøre kymographs (kym) i (D) angis. (C) bilder fra tid-lapse innspillingen av cellen i A og B tatt på ulike tidspunkt. Flytte mitokondrier er angitt (røde piler). (D) Kymographs fra baner indikert med (B). Stasjonære mitokondrier er sett på som rett loddrette linjer og bevegelige mitokondrier er sett på som diagonale linjer. Som kan sees på kymographs og tid-retters bildene c, er bare mitokondrier i primære prosessen merket Kymograph 1 (Kym 1) bevegelige. Mitokondrier i de andre tre kymographs er stasjonære under tid-lapse innspillingen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Visualisering av unstained kvinne myelin av AC Confocal refleksjon mikroskopi (kjernen). (A) projeksjon av z-stakken (optisk delen 10.35 µm) fra neocortex av en live organotypic hjernen skive. Det GFP uttrykket i oligodendrocyte vises her (grønn celle kroppen) er for svakt for identifikasjon av primære prosesser og myelin sheaths. I stedet ble myelin sheaths visualisert ved eksitasjon på 488 nm og fange lyset fra cellen på 470-500 nm (vises i magenta). Noen av cytoplasma-rike paranodes av GFP + oligodendrocyte kan sees på tuppen av myelin internodes (piler). Sett inn: Forstørret del av myelin-skjeden viser at myelin visualisert med CoRe vises "usammenhengende" eller usammenhengende (se hovedteksten for detaljer). (ABC) AC confocal bilder fra striatum (B) og stratum radiatum av hippocampus CA1 (C) av en akutt musen hjernen sektoren som er løst i 4% PFA og immunostained for myelin basic protein (MBP). Horisontal myelin sheaths (pilspisser) vises med kjerne, mens hylser som er vinkelrett synsfelt (stjerner) er oftest ikke synlige. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Reagenser tabell: Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen for å gjøre organotypic kulturer beskrevet her er en modifisert versjon18 av protokollen beskrevet av De Simoni og Yu (2006)5. De viktigste endringene er skissert nedenfor. Tris buffer legges til kultur medium, som forbedrer overlevelse sektorene utenfor inkubator under viral signaltransduksjon og endre cellen medium. Steriliseringsprosess for konfetti også endret. Mens andre protokoller sterilisere konfetti av autoklavering, anbefaler vi ikke dette fordi det vil føre til flere av konfetti krøller seg. Unngå å bruke krøllet konfetti som skiver vokst på disse pleier å være mindre sunt. Våre protokollen bruker mus, ikke rotter og er endret for å kultur cortex i stedet for hippocampus, som vi finner fungerer godt med tynnere skiver (230 µm vs 300 µm). Myelination topper rundt postnatal dag 10-20 i mus og rotter19, kulturer laget av er mus p7-9 (og deretter kulturperler 11-14 dager) optimal for å studere myelinating oligodendrocytes. 11-14 dager i vitro inneholder kulturer flere eldre oligodendrocytes med kompakt myelin sheaths13. Kulturer av yngre mus inneholder færre modne oligodendrocytes på slutten av kultur perioden, mens kulturer laget fra eldre mus har vist mer utfordrende å holde sunn20.
Prosedyren for å gjøre organotypic skiver innebærer flere kritiske trinn. Den disseksjon og montering av hjernen, samt plassere skiver på konfetti, må gjøres raskt og krever litt dyktighet. Vanligvis de første forsøkene på å gjøre organotypic skive kulturer er mindre vellykkede, men 2-3 omg praksis bør være nok til å tilegne seg ferdighetene som trengs for å lage sunn kulturer. Det er viktig å holde et sterilt miljø gjennom fremgangsmåten for å unngå forurensning av kulturer. Videre, når du arbeider med levende celler, er det alltid viktig å sikre riktig pH og osmolality løsning for å opprettholde celle helse. Det er derfor et godt råd å sjekke osmolality (skal være 270-310 mOsm/kg) og pH av alle løsninger som brukes på sektorene, særlig når du gjør eksperimentet for første gang. Kultur og disseksjon løsninger for organotypic kulturer inneholder en pH indikator (fenol rød), men gule serum i kultur medium kan gi inntrykk av en lavere enn den faktiske pH. Kultur mediet inneholder Penicillin Streptomycin og Nystatin for å minimere sjansene for infeksjon. Det anbefales derfor å bruke disse antibiotika og antimycotics når organotypic skive kultur teknikken i laboratoriet, men de kan senere unngås når ekspert steril teknikk brukes. Gjeldende protokollen bruker celle morfologi for å vurdere celle levedyktighet. For en mer kvantitativ undersøkelse, kan skiver lastes med propidium iodide eller lignende fargestoffer som beskrevet andre steder21. Det er imidlertid viktig å være klar over at utslipp spekteret av propidium iodide overlapper med dsred, tdtomato og andre røde indikatorer. En annen begrensning propidium iodide og lignende reagenser er at de ikke lett angir de dypere lag av stykket, dermed begrense vurdering av cellen levedyktigheten til det øverste laget av celler5.
Det finnes en rekke metoder for gen levering. De viktigste fordelene med å bruke AAV signaltransduksjon organotypic skive kulturer for å visualisere organeller er som følger: AAV signaltransduksjon har en bedre suksessrate for postmitotic oligodendrocytes sammenlignet med ikke-viral transfection metoder22. Videre i organotypic kulturer er alle hjerne celletyper tilstede, og oligodendrocytes har en morfologi lik at sett i vivo, inkludert kompakt myelin13. Dette er forskjellig fra oligodendrocytes i monokultur, som mangler kommunikasjonen med axons, og dermed gjør ikke kompakt myelin. Bildebehandling i vitro er enklere sammenlignet med i vivo , og tilbyr en bedre romlig oppløsning, som er av spesiell interesse når imaging liten organelles som mitokondrier. Fremtidig forskning mål å image i vivo, men ansikter en stor utfordring med optisk misforståelsene forårsaket av lipid-rik myelin-skjeden. Videre kan AAV serotype tropism og formidler spesifisitet variere mellom vivo og i vitro forhold13,23. I protokollen presenteres her, AAV2/8 MBP_mito_dsred og AAV2/8 MBP_mito_GFP til å visualisere oligodendrocyte mitokondrier. AAV serotype 2/1 ble testet med MBP_mito_dsred men infisert et lavere antall oligodendrocytes i organotypic skiver (vises ikke). AAV2/8 CAG_GFP og AAV2/8 CAG_tdtomato ble brukt til å visualisere oligodendrocyte cytoplasma. Til tross bruker generelle CAG arrangøren for dette, AAV 2/8 CAG_GFP og CAG_tdtomato selektivt infisert oligodendrocytes, med bare et lite antall astrocyttene og neurons å bli infisert (dette kan lett identifiseres av deres karakteristiske morfologi). Denne selektiviteten for oligodendrocytes er antagelig ved tropism AAV 2/8 serotype24. Men for organelle målrettede uttrykk, høyere celle-spesifisitet oppnådd med MBP - eller andre oligodendrocyte-spesifikke arrangører anbefales. Andre serotyper testet med CAG_GFP av oss var AAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/7, 2/9, mest som infisert hovedsakelig neurons og astrocyttene (vises ikke).
Avhengig av Konstruer og eksperimentelle forhold, vil endring av cellen signaltransduksjon være nødvendig. Hvis de transduced cellene blir også nedtonet, kan du prøve en lengre tid i vitro etter signaltransduksjon øke uttrykk. Hvis cellene vises lyse men usunn, redusere tiden etter signaltransduksjon. Hvis svært få celler er transduced, kan du øke konsentrasjonen av AAV. Men er det også mulig at tiden i vitro etter signaltransduksjon er for lang og at transduced celler ha dødd. For konstruksjoner som brukes her, var uttrykk nivåer optimal 4-6 dager etter signaltransduksjon. 7-8 dager etter signaltransduksjon, celler dukket opp mindre sunt, med blobby prosesser og 10 dager etter transduction, bare noen transduced celler var synlig (vises ikke).
Denne protokollen bruker en oppreist mikroskop for live avbilding av organotypic skiver. Dette er forskjellig fra de fleste mono- og co kulturer som vanligvis bruker en invertert mikroskop. Det er suboptimal bruke en invertert mikroskop her fordi skiver må deretter gjøres med konfetti vendt oppover, som formodentlig fører sektorene å være mindre sunt. En fordel med oppreist mikroskopet er muligheten til å legge til elektrofysiologi oppsettet. Videre betyr bruk av en pumpe for å endre medium at stoffet løsninger enkelt lagt til eller fjernet under tidsinnstilt bildebehandling. En ulempe med pumpen er problemer med å holde fokus forårsaket av vibrasjoner og strømninger i badekaret. Under mikroskopet, cellene vil gradvis bli mindresunn. Vi har derfor holde skiver under mikroskop for maksimalt 1 time. Fotografert skiver er kastet (spesialavfall). For å sikre tenkelig forholdene er optimal, bør bildebehandling celleområde kontroll, der mitokondrie bevegelse er allerede godt preget, kjøres parallelt. For eksempel, mitokondrie bevegelse i axons eller dendrites kan avbildes av transducing skiver med AAV 2/1 Syn_mito_dsred (i hvilken dsred uttrykk er drevet av Nevron-spesifikke synapsin selskapet) eller AAV 2/1 CAG_mito_dsred (etterfulgt av immunostaining å bekrefte celle identitet). Analyse av mitokondrie bevegelse kan gjøres ved hjelp av verktøyet for flere kymograph i ImageJ som beskrevet andre steder25.
Her beskriver vi kjernen for visualisering av unstained kvinne myelin under live bildebehandling. Sammenlignet med SCoRe9, som bruker tre eksitasjon bølgelengder, CoRe bare bruker én (488 nm) og er derfor enklere å implementere. I SCoRe avslører tre bølgelengdene hver annen "biter" av myelin-skjeden og sammen gir et fullstendig bilde av skjede. I tillegg kan SCoRe brukes til å oppdage myelin-skjeden strukturer som cytoplasmatiske lommer. Med enkelt bølgelengden brukes i kjernen, gis en mindre detaljert visning og hylser vises kornete eller usammenhengende (Fig. 3). Likevel visualiserer CoRe nær 100% av myelin hylser som er vannrett synsfelt. Dermed er kjernen nyttig for påvisning av myelin sheaths, men ikke for analyse av myelin strukturer eller integritet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Linda Hildegard Bergersen og Magnar Bjørås for tilgang til celle lab og utstyr, Janelia molekylærbiologi delt ressurs personale for plasmider og virus produksjon og Koen Vervaeke for hjelp med laser makt målinger. Dette arbeidet ble finansiert av norsk helse Association, Norges forskningsråd og mikroskopi utstyret ble finansiert av Norbrain.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | Needles used for in- and outlet of bath |
| Bioxide gas | AGA | 105701 | |
| Brand pipette bulbs | Sigma-Aldrich | Z615927 | Pipette bulbs |
| Bunsen burner (Liquid propane burner) | VWR | 89038-530 | |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | 64-0106 | Temperature controller - thermometer part |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 for incubator |
| Cover glass, square Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly. |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Delicate forceps | Finescience | 11063-07 | For dissection |
| Diamond scriber pen | Ted Pella Inc. | 54463 | |
| Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm | VWR | 612-1702 | Glass pipettes |
| Double edge stainless steel razor blade | Electron Microscopy Sciences | #7200 | Razor blade for vibratome |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| Filter paper circles | Schleicher & Schuell | 300,220 | Filter paper used for filtration of PFA |
| Fun tack | Loctite | 1270884 | Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath |
| Hand towel C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harp, Flat for RC-41 Chamber, | Warner Instruments | 64-1418 | Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW: 260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, Model 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Laminar flow hood |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCR Membrane, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | Confetti |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome |
| MEM-Glutamax with HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Micro Spoon Heyman Type B | Electron Microscopy Sciences | 62411-B | Small, rounded spatula with sharpened end for dissection |
| Millex-GP filter unit | Millipore | SLGPM33RA | Syringe filter unit |
| Millicell cell culture insert, 30 mm | Millipore | PICM03050 | Cell culture inserts |
| Minipuls 3 Speed Control Module | GILSON | F155001 | Peristaltic pump for live imaging - Control module part (connect to two-cannel head) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta Surface | Thermo Fischer Scientific | 140675 | Culture plate |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| Paraformaldehyde, granular | Electron Microscopy Sciences | #19208 | |
| PC-R perfusion chamber | SiSkiYou | 15280000E | Bath for live imaging |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri dish 140 mm | Heger | 1075 | Large Petri dish |
| Petri dish 92x16 mm | Sarstedt | 82.1473 | Medium Petri dish |
| Petridish 55x14,2 mm | VWR | 391-0868 | Small Petri dish |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | PBS tablets |
| R2 Two Channel Head | GILSON | F117800 | Peristaltic pump for live imaging - Two channel head part (requires control module) |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Large spatula for dissection |
| Sand paper | VWR | MMMA63119 | Optional, for smoothing broken glass pipettes |
| Scissors, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Large scissors for dissection |
| Scissors, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Small, sharp scissors for dissection |
| Single edge, gem blade | Electron Microscopy Sciences | #71972 | Single edge razor blade |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | Temperature controller - heater part |
| Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm | Millipore | SCGPT05RE | Filter to sterilize solutions |
| Super glue precision | Loctite | 1577386 | |
| Surgical scalpel blade no. 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Rounded scalpel blade |
| Temperature controller TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly) |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| Water jacketed incubator series II | Forma Scientific | 78653-2882 | Incubator |
References
- Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
- Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
- Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
- Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
- Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
- Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).
- Gow, A., Friedrich, V. L. Jr, Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
- Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
- Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
- Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
- Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
- Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
- Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).
- Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
- Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).
