Summary
Олигодендроциты Myelinating способствуют быстрое действие потенциал распространения и выживаемость нейронов. Описанные здесь — это протокол для выражения конкретных Олигодендроциты флуоресцентных белков в organotypic срезы мозга с последующим покадровой изображений. Кроме того представлена простая процедура для визуализации неокрашенных миелина.
Abstract
Нейроны полагаться на электроизоляции и трофические поддержки myelinating олигодендроциты. Несмотря на важность Олигодендроциты дополнительные инструменты в настоящее время используется для изучения нейронов, лишь частично были приняты исследователями олигодендроциты. Ячейка пятнать вирусный трансдукции конкретного типа является полезным подходом для изучения динамики живых органеллы. Этот документ описывает протокол для визуализации Олигодендроциты митохондрий в срезах головного мозга organotypic, трансдукция с аденоассоциированный вирус (AAV) гены для митохондриального целевых флуоресцентных белков под контролем транскрипционный анализ Промоутер основной белок миелина. Она включает в себя протокол для изготовления organotypic корональных мыши мозга ломтиками. Ниже представлена процедура затем time-lapse изображений митохондрий. Эти методы могут быть переданы в другие органеллы и могут быть особенно полезными для изучения органеллы в Миелиновые оболочки. Наконец мы описывают метод легко доступны для визуализации неокрашенных миелина в живых фрагментов, конфокальная отражения микроскопии (ядро). Ядро не требует дополнительного оборудования и может быть полезно для идентификации Миелиновые оболочки во время живых изображений.
Introduction
Белого вещества мозга состоит из аксонов нервных клеток, завернутые в миелина, специализированные расширенной плазматической мембраны, образованный олигодендроциты. Миелина необходима для быстрого и надежного действия потенциал распространения и долгосрочное выживание Миелинизированные аксонов, и потеря миелин может вызвать неврологической дисфункции. Несмотря на их важность свойства Олигодендроциты менее известные сравниваются с нейронов и астроциты. Следовательно меньше инструменты были разработаны для изучения олигодендроциты.
Живут изображений Органеллы клетки, такие как митохондрии, эндоплазматический ретикулум (ER) или различные везикулярного структуры может быть полезным для изучения динамических изменений в органеллы с течением времени. Традиционно изображения живых Олигодендроциты была выполнена в монокультур1,2. Однако Олигодендроциты в монокультуре не отображаются компактные миелина, и кусочки острый мозга или organotypic таким образом, может быть лучшим вариантом, при изучении движения органелл и локализации. Локализация небольших органеллы и белков в Миелиновые оболочки может быть сложным из-за короткого расстояния между Миелинизированные Аксон и окружающие Миелиновые оболочки. Таким образом только свет микроскопические иммуноокрашивания процедуры не имеют пространственное разрешение для различения органеллы в Миелиновые оболочки и те в Миелинизированные аксон. Это может быть решена путем вирусного трансдукция с генами органеллы целевой флуоресцентных белков, движимый промоутеров определенного типа клеток. Преимущества являются клетки конкретные и разреженные выражение, которое дает возможность точной оценки органеллы локализации и динамики. Трансгенные животные могут также использоваться для достижения таких целевых Органеллы клетки конкретных выражение3. Однако производство и обслуживание трансгенных животных дорого и обычно не предлагают разреженные выражение, которое может быть достигнуто путем вирусных методов.
Метод, описанный здесь использует вирусные трансдукции Олигодендроциты с таргетингом на митохондриальной флуоресцентных белков (dsred или Зеленый флуоресцирующий белок, GFP) обусловлен промоутер основного белка миелина (MBP-mito-dsred или MBP-mito-GFP) для визуализации Олигодендроциты митохондрий в organotypic срезы мозга. Кроме того выражение другого флуоресцирующего белка в цитоплазме (GFP, используемые вместе с mito-dsred или tdtomato, используемые с mito-GFP) используется для визуализации морфологии клеток, включая цитоплазматических отсеков Миелиновые оболочки. Протокол включает в себя процедуры для приготовления organotypic срезы мозга (модифицированная версия протокола, описанный De Simoni и Юй, 20064,5). Мы затем описать покадровой изображений процедуры для изучения митохондриальной движения. Эта процедура использует вертикально Конфокальный микроскоп с непрерывный обмен изображений среднего, установки, что позволяет легко применение наркотиков или других средних изменений во время визуализации. Промежуток времени визуализации процедура может быть выполнена на любой конфокального микроскопа, с некоторым дополнительным оборудованием для поддержания жизни ломтиками, как описано ниже. Протокол также содержит несколько советов для оптимизации изображений и уменьшить Фототоксичность.
И наконец описан простой и быстрый способ визуализировать неокрашенных миелина, конфокальная отражения микроскопии (ядро). Это может быть полезно для идентификации Миелиновые оболочки во время живых изображений. В последние годы несколько методов были разработаны для миелина изображения без каких-либо окрашивание требуется, но большинство из них требуют определенного оборудования и специалистов6,7,8. Процедуру, описанную здесь используется отражательные свойства Миелиновые оболочки и версия упрощенный сингл возбуждения волны спектральных характеристик Confocal микроскопии (оценка, в которых некоторые лазерные длин волн объединяются, чтобы визуализировать миелина) 9. ядро может быть сделано на любой Конфокальный микроскоп имеющий 488 нм лазер и 470-500 Нм полосовой выбросов или выбросов перестраиваемый фильтр.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
описанные здесь процедуры были одобрены Норвежский орган исследования животных. Поставщики и Каталог номеров для расходных материалов и других необходимых оборудование доступны в списке материалов в конце документа.
1. Подготовка Organotypic ломтиками
Примечание: этот рецепт использует две мыши щенков на послеродовой день 7-9 (p7-9), которые дают 24 organotypic ломтиками, разделены на два шесть ну культуры блюда. Если не указано иное, все процедуры должно быть сделано в стерильных капот и nitril или латексные перчатки должны быть использованы. Должны использоваться только клетки культуры класс ингредиенты.
- Бутылки автоклав, рассечение инструменты (1 большой ножницами, 1 небольшой ножницами, 1 большой плоский шпатель, 1 небольшие округлые и заточенные шпателем и 1 щипцы, смотрите материалы список для деталей), стеклянные пипетки, наконечники и салфетки ткани, используется для подготовки фрагмента.
- Как половина из стеклянной пипетки следует использовать с большим открытием, разорвать узкий конец.
- Оценка с алмазной Чертилка ручка (если доступно) вокруг пипеткой чуть ниже точки, где стекло начинает сужения. Затем поместите заостренный конец пипеткой в нитриловые перчатки или аналогичный. Тщательно отломить кончик, сгибая пипеткой прижимая его против верстаке.
- Затем тупой конец сломанной, потерев на куске наждачной бумаги или расплава незначительно на горелки Бунзена. Сломанной пипетки используются для передачи вырезать мозг ломтики с конца сломанной, превратился в резиновую грушу и большой открытый конец, касаясь решения/ломтики.
Примечание: Это делается не в стерильных капот и может быть сделано несколько дней, в.
- Готовят блюда культуры.
Примечание: Это может быть сделано в день до нарезки или по крайней мере за 2 часа до нарезки.- Стерилизовать политетрафторэтилена (ПТФЭ) мембраны (" конфетти "). Используйте два стерильный пинцет для удаления одного конфетти из окружающих синий пластиковых частей и стерилизации путем погружения дважды в чашку Петри, содержащий 96% этанола (EtOH). Затем заложить конфетти квартиру в стерильных большой Петри сушиться.
Примечание: Конфетти, гидрофильные мембраны из PTFE, похож на мембраны в культуре вставок. Использование конфетти СПИД живут изображений, потому что одного ломтика может легко передаваться от вставки Микроскоп установки, подняв конфетти пинцетом (4,8 см. Подробнее). Кроме того срезы мозга может выращиваются без конфетти, (в котором срезы будет прикрепить непосредственно к мембране Вставка культуры). В этом случае вставка мембраны должны быть срезаны с помощью скальпеля для передачи фрагмента в Микроскоп ванну. - Добавляют 1 мл питательной среды (рецепт в реагентов ' таблица) к каждой скважины шести ну культуры блюд. В каждой скважины с использованием стерильный пинцет вставить
- место одной культуры. Избежать воздушных пузырей между insert и культуры среднего.
Примечание: Чтобы сэкономить деньги и окружающей среды, это возможно для повторного использования вставок культуры. Это может быть сделано путем тщательной промывки в дистиллированной H 2 O (dH 2 O) следуют инкубации в 70% EtOH минимум 24 ч до повторного использования. При подготовке новой культуры, сухие вставок в пластине культуры клеток под ультрафиолетового (УФ) света на 15-30 мин
Вставки - два (стерилизованные и сухой) конфетти на каждой культуры. Место конфетти к краям вставок для получения минимального дублирования.
- Поместить пластины в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO 2.
- Стерилизовать политетрафторэтилена (ПТФЭ) мембраны (" конфетти "). Используйте два стерильный пинцет для удаления одного конфетти из окружающих синий пластиковых частей и стерилизации путем погружения дважды в чашку Петри, содержащий 96% этанола (EtOH). Затем заложить конфетти квартиру в стерильных большой Петри сушиться.
- Средний холодный рассечение пузырь (рецепт в реагентов ' таблица) четырёхокись газом (95% O 2 /5%CO 2). Чтобы раствор стерильный, подключить трубку от газового баллона к фильтру стерильный шприц (размером пор 0,22 мкм).
Фильтр
- пара на другом конце шприца в стерильную пробирку подключен к стерильной стеклянной пипетки. Место стеклянной пипетки в растворе, накрыть парафина и поверните на газ. Держите средний рассечение на ice.
- Подготовить области рассечение/нарезка.
Примечание: В идеале, эта процедура должна быть выполнена в стерильных Худ. Если это не представляется возможным, vibratome можно оставить на верстаке. В этом случае рекомендуется использовать маску сети и лица волосы.- С помощью одним краем лезвия бритвы, вырезать прямоугольный кусок (примерно 2 см x 0.5 см) геля агарозы (рецепт в реагентов ' таблица) и клей это на сцену vibratome, таким образом, что длинной стороне сталкивается лезвие vibratome.
- Очистить все поверхности и части vibratome с 70% EtOH и протереть газобетона ткань салфетки.
Примечание: Важно, что все части, которые будут контактировать с ткани мозга полностью сухой, с EtOH может повредить клетки. - Придают стерильные лезвия бритвы vibratome и проверки вибрации, если vibratome имеет этой функции.
- Место газобетона рассечение инструменты в капюшоне вместе с газобетона ткань салфетки, четыре небольших Петри, раунд край скальпель, 2 стеклянные пипетки с резиновыми луковицы, двух рожковый стеклянные пипетки (см. пт 1.1) и супер клей (распыляется с EtOH).
- Pour передающиеся вверх рассечение среднего в лодке vibratome и в четырех небольших Петри.
Примечание: Этот шаг должен только быть сделан непосредственно перед рассечение поскольку средний с этого момента не кипела или хранится на льду
- Нактоузах и горе мозги.
Примечание: Для получения здорового ломтиками, этот шаг должен быть сделано быстро и точно. Необходима определенная практика.- Усыпить животных #1 путем дислокации neckor согласно местных руководящих принципов и затем обезглавить с большими ножницами.
- Использование малых, острые ножницы, быстро снять кожу, делая Сагиттальный разрез от шеи к носу и тянуть в сторону раскрыть черепа.
- Разрезом вдоль Сагиттальный шов, а затем боковые разрезы над внутренней части лобной кости и шовный материал lamboid (граница между головного мозга и мозжечке).
- Использовать пинцет согнуть открытый череп на каждой стороне. Черепных нервов отрезаны от мозга, вставив округлые, резкий шпатель под вентральной стороне мозга и осторожно двигаться шпатель боково.
- Использовать одним краем лезвия бритвы, чтобы сделать корональный вырезать ростральной мозжечка.
Примечание: Этот отрезок будет определять угол, на котором нарезаются ломтиками. Он таким образом, следует на прямой угол. - Флип мозг из черепа и в небольшой Петри, содержащие рассечение среднего.
- Повторить шаги 1.6.1.-1.6.4. и для животных #2 место этот мозг в втором Петри блюдо.
Примечание: Животные не являются стерильными. Выполните рассечение на одной стороне капота и затем перейти к другой, чистой стороне, как только мозги были удалены из черепа. - Изменить перчатки.
- Присоединить мозга vibratome этап: добавить тонкий слой супер клей на сцену перед навесные агарозном геле. Держать мозг #1 с большой плоский шпатель с свежесрезанных (хвостовой) стороне трогательно шпателем и облицовки вентральной стороне (и быть как можно ближе) геля агарозы.
- Затем осторожно поместите мозг на клей, отталкиваясь шпатель с набором щипцами. Убедитесь в том оставить достаточно пространства для мозга #2.
Примечание: Важно, что мозг хорошо прикреплены на сцену, но без чрезмерного клея, как это может помешать резки.
- Затем осторожно поместите мозг на клей, отталкиваясь шпатель с набором щипцами. Убедитесь в том оставить достаточно пространства для мозга #2.
- Сразу же после монтажа головного мозга #1, используйте шпатель большой добавить несколько капель рассечение средней верхней части мозга. Это будет держать мозг влажные, упрочнения клея и предотвратить его от прилипания к бокам мозги.
- Повторите шаги 1.6.7 и 1.6.8. для мозга #2.
- Прикрепить сцену на лодке vibratome.
- Вырезать 230 мкм толщиной корональных ломтики с амплитудой 1-1,5 мм, частотой 85 Гц и скорости 0,2 мм/s. собирать кусочки примерно между ростральной 1.4 и 2,1 мм хвостового Bregma.
Собирать фрагменты
- после того, как каждый ломтик была сокращена с помощью open-end стеклянной пипетки (pt. 1.1). Передача фрагментов на чашку Петри, содержащие рассечение среднего. Использовать закругленными скальпель разрезать фрагменты на две части, деления двух полушарий.
- Когда все фрагменты вырезаны, место ломтики в культуре блюда.
- Взять культуры блюдо (один в то время) из инкубатора.
- С помощью пипетки open-end стекла, тщательно передать один срез каждого из конфетти.
Примечание: Срезы должны лежать в середине конфетти. Это требует некоторых навыков. Однако, если некоторые фрагменты не являются идеальными, то лучше оставить их чем тратить время пытаются переместить их, как это важно как можно быстрее получить все фрагменты в инкубатор. - Использовать стеклянные пипетки (заостренный конец) аккуратно удалить избыток среднего без касатьться срез.
Примечание: Фрагменты не должен быть погружен в жидкость во время инкубации. Таким образом избыток среднего должны быть придыхательным, таким образом, чтобы срезы подвергаются воздействию воздуха, (тонкая пленка среды по-прежнему будет охватывать срезы). Фрагменты, которые по-прежнему погружен в жидкость обычно быть нездоровым или умереть (4 и нашим наблюдениям). - Перемещение блюдо обратно в инкубаторе, после того как все конфетти один ломтик.
- Повторите шаги 1.7.8.-1.8.4. блюдо #2.
- Изменить культуру среднего.
Примечание: Это должно быть сделано на следующий день после нарезки (день 1 в пробирке, DIV1) и затем каждые 2-3 дня.- Подогрева питательной среды в водяной бане или инкубатора.
- В стерильных капот, используйте вакуумного всасывания или регулярные пипетки с стерильных наконечником аспирационная питательной среды от каждой скважины. Это делается путем нежно чаевые блюдо (на приблизительно 30 градусов) и размещение наконечник пипетки на краю культуры Вставка.
- Удалить примерно 800 мкл из каждой скважины (оставляя только достаточно среднего сохранить в нижней части пластины покрыты в среде). Затем используя чистый пипетки, мкл 800 подогретую среднего для каждой скважины. Затем поместите блюда обратно в инкубатор культуры клеток.
2. Вирусная трансдукции
AAVs- покупки или сделать с плазмиду интереса, как описано выше 10 ,- 11.
Примечание: Этот протокол описывает использование AAV серотипа 2/8 (ААВ 2/8) ношение митохондриальной целевых dsred или GFP как репортер ген под контролем transcriptional промоутер основной белок миелина 12 (AAV2/8 MBP_mito_dsred или AAV2 / 8 MBP_mito_GFP) для визуализации Олигодендроциты митохондрий. Аав 2/8 перевозящих GFP или tdtomato как репортер ген обусловлен общим CAG промоутер (ААВ 2/8 CAG_GFP или Аав 2/8 CAG_tdtomato) используется для визуализации Олигодендроциты цитоплазмой. Таким образом, сочетание AAV2/8 MBP_mito_dsred с Аав 2/8 CAG_GFP дает красный митохондрии и зеленый цитоплазмы в олигодендроциты, тогда как сочетание MBP_mito_GFP AAV2/8 и Аав 2/8 CAG_tdtomato дает зеленый митохондрий и красный цитоплазмой. Конструкции описаны более подробно в другом месте 13. - На день 7 в пробирке (DIV7), передают Олигодендроциты с AAVs.
Предупреждение: Следуйте правилам безопасности для работы с AAVs. Убедитесь в том иметь надлежащую подготовку и требуется утверждение уровня биобезопасности. Все следующие моменты должны осуществляться в шкаф класса II биобезопасности, используя перчатки и лаборатории пальто. Здесь применение AAV для области коры ломтиков описано, как это область, которая показывает лучшие восстановления.- Развести AAV в подогретую (37 ° C) питательной среды. Разведений вокруг 2 × 10 9 генома копий/мл (GC/мл) рекомендуется получить разреженных трансдукции олигодендроциты, который позволяет визуализации единичных клеток внутри фрагмента. Однако пилот, используя разные титры должно быть сделано для обеспечения плотности transduced олигодендроциты, которая подходит для конкретных экспериментов. Если используются два разных AAVs, они должны смешивать в одном решении и одновременно добавляется фрагмент.
- Добавить около 1.3 мкл разбавленный AAV для каждого фрагмента: Убедитесь, что снаружи кончика пипетки сухой. Пипетка 1.3 мкл разбавленный AAV и держать пипетку выше коры, максимально без касатьться срез кончиком пипетки (около 1 мм прочь).
- Затем медленно толкать раствора из пипетки. Когда решение касается фрагмента, наведите коры распространить решение над районом всей коры наконечник пипетки.
Примечание: Эта процедура должна быть выполнена как можно быстрее, чтобы избежать, сохраняя фрагменты из капюшона для дольше, чем необходимо. Сделать это на одно блюдо в то время и положить обратно в инкубаторе первое блюдо перед началом на блюдо #2. Для получения удовлетворительного распределения AAV, не повреждая ткани требует некоторой практики и твердая рука.
- Если вертикально флуоресцентным микроскопом в лаборатории клетки, выражение протеина может проверяться во время в культуре, поместив блюдо под микроскопом.
Примечание: Блюдо не следует из инкубатора для более чем 2-5 минут.
3. Промежуток времени изображений
Примечание: изображения может выполняться всякий раз, когда уровни выражения флуоресцентные маркеры являются достаточными и фрагменты выглядят здоровыми (обычно DIV11-14).
- Обеспечить Микроскоп, перфузии и Отопление настроены правильно, чтобы обрабатывать изображений решение нагревается и может войти и выйти из ванны.
Примечание: Для ванной камер существуют различные решения. Здесь представлена простая версия.- Сделать в - и точках ванны притупляются шприц иглами (Бент на ~ 45°), которые прикреплены к бокам ванны, blu Галс/весело тэкса.
- Убедитесь, что трубы идет от бутылка непрерывно обрабатывать решение отображения информации, через Перистальтический насос, через Отопление трубки отопителя, а затем иглу шприца входе в бане.
- Подключить другой трубки к выходу иглой шприца. Эта трубка затем проходит через Перистальтический насос и обратно в бутылку изображений решение (или отходов бутылка).
- Пузырь изображений решение (рецепт в реагентов ' таблицу) с газом четырёхокись.
Примечание: Это должно быть started по крайней мере 15 минут до изображений и продолжаться на протяжении всего эксперимента. - Поворот на перистальтического насоса и нагревателя и выполнения решения через ванну для получения оптимальной температуры (37 ± 0.5 ° C). Убедитесь, что датчик термометра, подключенных к температуре погружен в раствор для ванн.
- Включите Микроскоп, люминесцентная лампа и соответствующие лазеров.
- Набор подходящих свет путь для данного образца.
Примечание: Это будет варьироваться в зависимости от установки микроскопа и зонд. Общие знания о том, как использовать конфокального микроскопа является обязательным и не будут рассматриваться здесь. - Использовать цель погружения воды с соответствующим увеличением и числовая апертура (н.а.). Мы используем цель плана Апохромат погружения 40 x воды (н.а. 1.0).
- Открыть отверстие для достижения оптическая часть примерно 2-2,5 мкм для покадровой видео. Это снижает возникновение митохондрий, двигаться не в фокусе во время покадровой.
- Передачи organotypic срез для ванны:
- Добавить каплю тепловизионные решения или питательной среды для небольших пластиковых Петри.
- В стерильных капот, использования стерильных щипцы для передачи одного фрагмента organotypic от мембраны вставить до капли. Щипцами должны касаться только конфетти и не фрагмент.
- Поставить крышку на Петри блюдо.
- Немедленно положить культуры блюдо, содержащий остальные фрагменты обратно в инкубаторе.
- Принести Петри содержащие фрагмент микроскопом.
- Выключить Перистальтический насос при передаче фрагмента к Микроскоп ванны. Во-первых используйте корнцанг поднять конфетти с фрагментом из Петри в верхней части ванны (конфетти будет плавать). Затем место два советы щипцы на каждой стороне конфетти, так, что они касаются конфетти без касатьться на срез и нажимаем конфетти через решение на дно ванны. Центр конфетти в середине ванны.
- Использования щипцов поставить прижимной Анкер (арфа) поверх конфетти без касатьться срез.
Примечание: Арфа является подковы Платиновый якорь, который используется для предотвращения срез с плавающей или дрейфующие в ванне. Для острых фрагментов тонкие струны запускать с одной стороны арфы на другой (напоминающие музыку арфы). Для organotypic ломтиками, Арфа следует без волокнистых нитей и размеру конфетти таким образом, что он может заложить на вершине конфетти без касатьться срез. - Включите насос перистальтический.
- Ниже цели вниз образца.
- Выберите ячейку и региона образ.
Примечание: Избегайте чрезмерного воздействия клеток лазерного света, как это может вызвать токсичность клеток (см. советы в пунктах ниже).- Использовать окуляры и люминесцентных ламп для поиска с правильным выражением олигодендроциты, здоровый вид. Как правило олигодендроциты, которые имеют сильные гиперэкспрессия флуоресцентный белок появляются нездоровым. Нездоровый Олигодендроциты будет иметь процессы с blobby внешний вид, и митохондрии появится фрагментирован. В здоровых олигодендроциты, сома и процессы будут гладкими и митохондрии имеют различные длины (хотя обычно гораздо короче, чем в нейроны и астроциты 13 , 14 , 15).
- место клетки интереса в центре поля зрения.
- Использования " жить " функции в программное обеспечение (для микроскопов Leica и Zeiss) для выявления клеток на экране и выберите область интереса, например, частью ячейки, содержащей несколько основных процессов или миелиновой оболочки или один процесс или Миелиновые оболочки.
Примечание: Чтобы иметь возможность изображение столько влагалищ процессы как можно скорее, выбрать области, содержащие процессы, которые откладывают относительно плоский в направлении x-y. - Масштаб области интересов (обычно производит изображения с размером пикселя 0,14 - 0.30 µm).
- Использование " регионов " инструмента, нарисуйте прямоугольник вокруг области и выберите опцию для сканирования только выбранного региона. Сканирования, время и таким образом лазерное облучение, уменьшается только сканирование выбранного региона.
Примечание: Горизонтальных прямоугольных областей будут сканироваться быстрее, чем вертикальные регионах вследствие короче количество отсканированных линий необходимо. Если вертикальный прямоугольник области сканирования, время сканирования может быть уменьшена путем ротации поля сканирования на 90 градусов (с помощью инструмента «поворот»).
- Регулировка мощности лазера и получить, чтобы получить хороший взгляд на митохондрии.
Примечание: Используйте необходимую мощность минимальный лазера. Если возможно поверните вверх прибыль, а не увеличения мощности лазера. Помимо вызывая клеток токсичности, слишком высокой лазерной энергии будет отбеливать фотосъемка объектов с течением времени, таким образом, требует дальнейшего увеличения мощности лазера или получить во время сканирования. Мощность требуется лазера и получить будет зависеть от уровня выражения и Микроскоп. С помощью LSM700 конфокального микроскопа мы используем 555 Нм лазер на мощностью 20-40 мкВт на изображение dsred или tdtomato и 488 нм лазер используется в 20-30 мкВт для изображения GFP (мощность лазера измеряется на спине диафрагмы цели). Усиления устанавливается высокий для живых изображений, обычно в диапазоне 700-800 за GFP и 850-980 для dsred и tdtomato. Высокий коэффициент усиления может привести к некоторым более фоновый шум, который удаляется путем увеличения цифровой смещение (смещение, которое значения обычно лежит между 0 и 15). По нашему опыту, использование MBP_mito_GFP дает лучше сигнал шум чем MBP_mito_dsred.
Скорость сканирования выберите - .
Примечание: Минимизировать время сканирования с помощью быстрая скорость сканирования и рисование небольшой регион сканирования (см. пункт 4.10.5 ниже). Это также позволяет сэкономить время, выполняя проверку двунаправленного сканирования. Однако, это не рекомендуется из-за бедных качество изображения. - Набор частоты и продолжительности покадровой записи, например захват изображения каждые 2 секунды для в общей сложности 20 минут для митохондриального изображений в олигодендроциты.
Примечание: Частота и продолжительность должен быть установлен согласно мобильности интересующие вас объекты. Высокой частоты будет подвергать образца более лазерного света, но быстрее движущихся объектов также требуют короче общая продолжительность покадровой видео (например митохондрий в нейроны, которые двигают более часто и в гораздо большей скоростью, чем митохондрий в олигодендроциты, обычно отражаются каждую секунду для в общей сложности 2 минут 16). - Начать запись отснятого.
Примечание: Митохондрий может двигаться не в фокусе и/или дрейфа из образа региона во время записи. Чтобы свести к минимуму вибрации и движения, отрегулируйте в - и точек ванны и уменьшить скорость насоса при необходимости. Небольшие изменения в фокусе обычно все еще происходят. Таким образом, непрерывный мониторинг на экране во время визуализации не требуется, с небольшой корректировки направленности во время записи. - Захватить z стек всей ячейки для будущих идентификации клеток и образ процесса.
Примечание: Для лучшего разрешения, Пинхол следует сбросить в 1 просторный блок для z стека. - Дополнительно: визуализировать неокрашенных миелина.
Примечание: В Олигодендроциты преобразованы с (цитоплазмы) GFP, миелиновой оболочки могут обычно быть определены как прямые линии цитоплазмы (цитоплазматических хребты) подключены к основным процессом (см. рис. 2 A и B). Однако если экспрессия гена GFP слишком слаб или цитоплазматическая маркер не используется, это позволяет визуализировать Миелиновые оболочки, конфокальная отражения микроскопии (ядро), как описано здесь.- Созданы новые светового луча в программное обеспечение с лазерным возбуждением на 488 нм и захвата испускаемого света вокруг же волны, например 470-500 Нм.
- Отрегулируйте мощность лазера и получить пока не виден миелина (см. пример в < сильный класс =»xfig «> рисунок 3). С помощью микроскопа LSM 510 мета, мы обычно используется лазер мощностью 7-12 мкВт (измеряется на спине диафрагмы цель).
- Дополнительно: подготовка фрагментов иммуноокрашивания.
- Если образа ячейки должны быть определены после иммуноокрашивания, малое увеличение образ (10 x) ячейки и указать ее расположение в изображении рисуя стрелки или аналогичный. Для облегчения обнаружения ячейки, рекомендуется также нарисовать ручной карту весь срез, указывающий местоположение ячейки.
- Исправить фрагмент в параформальдегида 4% (PFA) на шейкер на 1 час при комнатной температуре.
Предупреждение: PFA вредно. Использовать защитные носить и использовать только в вентилируемых Худ. - Ослабить фиксатор 1:10 в PBS и оставить на 4° C до начала иммуногистохимии, как описано в других разделах 17.
Примечание: Хотя фрагменты могут быть оставлены в разреженных фиксатором на несколько недель, флуоресценции может исчезать. Выполнение иммуногистохимия в течение 10 дней фиксации рекомендуется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Срезы мозга organotypic, которые культивировали и преобразованы, как описано выше показан разреженный распределение корковых олигодендроциты, выражая mito_dsred и GFP. Иммуноокрашивания с антителами против Olig2 и MBP подтвердил, что выражение для Олигодендроциты (рис. 1).
Для живых изображений, transduced Олигодендроциты были признаны их характерным морфологии нескольких миелиновой оболочки, параллельно (рис. 1 и рис. 2A). Выполняя покадровой изображений на transduced олигодендроциты, можно контролировать движение митохондрий в основных процессах и миелиновой оболочки (рис. 2B-D).
В ячейках с низкой экспрессия гена GFP, Миелиновые оболочки могут быть определены во время живых изображений освещение образца в 488 нм и захвата испускаемого света 470-500 Нм (рис. 3A). Эта техника конфокальный отражения микроскопии (CoRe) также работал на PFA фиксированной и immunostained ткани, хотя миелина оболочек появились диммер (рис. 3B-C). По иммуноокрашивания с антителами против основного белка миелина (MBP), мы обнаружили, что почти 100% миелиновой оболочки укладки горизонтальной плоскости изображения (обозначается наконечники стрел, рисунок 3B-C) видны с сердечником, тогда как миелина оболочек меньше или вообще не видно что лежал перпендикулярно поле зрения (обозначается звездочками, рисунок 3B-C). Хотя почти все междоузлий визуализируются, многие междоузлий появляются разрывными, с небольшими участками оболочка, не будучи видимыми (Рисунок 3А вставки). Эти небольшие «пробелов» в миелин может заполняться изображений с трех взаимодополняющих длинах волн, так называемая Оценка9.
Рисунок 1 : Иммуногистохимии подтверждает, что MBP-mito-dsred выборочно выражается в олигодендроциты, которые являются иммунные положительный для Olig2 и MBP. Изображения являются от коры головного мозга мыши искусственный мозг срезов transduced с (AAV2/8) MBP-mito-dsred (красный, митохондриального маркера) и ЦАГ-GFP (зеленый, цитозоле). Ломтики были полученных миелина маркер основной белок миелина (ПМБ, синий) и Olig2 (Олигодендроциты линии клеток ядерной маркер, пурпурный). (Рисунок от ссылка13) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Покадровый imaging для отслеживания митохондриальной движение в олигодендроциты. (A) проекция z-стека (оптически раздел 10,35 мкм) Олигодендроциты преобразованы с MBP_mito_dsred (красный митохондрий) и CAG_GFP (зеленый флуоресценции). (B) одного конфокальный изображение (оптически раздел 1.04 мкм) той же клетке. Квадрат указывает региона, который был выбран для покадровой изображений (C) и линий, рисуемых сделать kymographs (Ким) в (D) указаны. (C) изображения от покадровой записи ячейки в A и B, в разное время моменты. Движущихся Митохондрии являются указанные (красные стрелки). (D) Kymographs от траектории указал в пункте (B). Стационарные митохондрии рассматриваются как прямые вертикальные линии и движущихся митохондрии рассматриваются как диагональные линии. Как можно увидеть в kymographs и время курс изображения (C), движутся только митохондрий в процессе первичной, отмеченные кимограф 1 (Ким 1). Митохондрии в других трех kymographs стационарные во время промежуток времени записи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Визуализация неокрашенных миелина, конфокальная отражения микроскопии (CoRe). (A) проекция z стека (оптически раздел 10,35 мкм) от Неокортекс кусочек живой organotypic мозга. Экспрессия гена GFP в олигодендроциты, показанный здесь (зеленые клетки тела) слишком тусклым идентификации первичных процессов и миелиновой оболочки. Вместо этого миелиновой оболочки были визуализированное возбуждения 488 нм и захвата испускаемого света в 470-500 Нм (показан пурпурным). Некоторые из цитоплазмы богатых paranodes GFP + Олигодендроциты можно увидеть на кончиках миелина междоузлий (стрелки). Вставка: Увеличенная часть Миелиновые оболочки показывает что миелина, визуализируется с сердечником появляется «пятнистый» или разрывными (см. основной текст для подробной информации). (B-C) Конфокальный изображения от стриатума (B) и слой radiatum СА1 гиппокампа (C) срез мозга острый мыши, которая была исправлена в 4% PFA и immunostained для основной белок миелина (ПМБ). Горизонтальных миелиновой оболочки (стрелок) видны с сердечником, тогда как шубы, которые перпендикулярны поле зрения (звездочки) чаще всего не видны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица реагентов: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол для изготовления organotypic культур, в описанный здесь является модифицированной версии18 протокола, описанный De Simoni и ю. (2006)5. Наиболее важные изменения были изложены ниже. Трис-буфер добавляется к питательной среды, которая улучшает выживание ломтики когда за пределами инкубатора во время вирусной трансдукция и изменения среды ячейки. Также меняется процедура стерилизации конфетти. В то время как другие протоколы стерилизация автоклавированием конфетти, мы не рекомендуем это потому что это вызовет некоторые из конфетти виться. Избегайте использования свернувшись конфетти, ломтиками, выращенных на них, как правило, менее здоровыми. Наш протокол использует мышь, не крысы и изменения культуры коры вместо гиппокампа, который мы находим хорошо работает с более тонкие ломтики (230 мкм vs 300 мкм). Как миелинизации пики вокруг послеродовой день, сделанные 10-20 в мышей и крыс19, культур от мышей на p7-9 (и затем культивировали в течение 11-14 дней) являются оптимальными для изучения myelinating олигодендроциты. В 11-14 дней в пробирке культур содержат несколько зрелых Олигодендроциты с компактной миелиновой оболочки13. Культур, из молодых мышей будет содержать меньше Зрелые Олигодендроциты в конце периода культуры, тогда как культур сделаны из старых мышей показали более сложным, чтобы сохранить здоровую20.
Процедура для изготовления срезов organotypic включает в себя несколько важных шагов. Рассечение и монтаж мозги, а также размещение фрагментов на конфетти, должно быть сделано быстро и требует некоторых навыков. Как правило первые попытки сделать organotypic срез культур являются менее успешными, но 2-3 раундов практике должно быть достаточно, чтобы приобрести навыки, необходимые для создания здоровой культуры. Важно сохранить стерильных условиях на протяжении всей процедуры, чтобы избежать загрязнения культур. Кроме того при работе с живых клеток, это всегда необходимо обеспечить правильный баланс pH и осмотического давления решений для поддержания здоровья клеток. Это, таким образом, хороший совет, чтобы проверить осмотического давления (должно быть 270-310 мОсм/кг) и pH всех решений, которые используются на ломтики, особенно при проведении эксперимента в первый раз. Культура и рассечение решения для organotypic культур содержат pH индикатор (красный фенола), но желтый сыворотки в среде культуры может дать впечатление ниже чем фактические рН. Культура средних содержит пенициллин, стрептомицин и нистатин, чтобы свести к минимуму риск заражения. Поэтому рекомендуется использовать эти антибиотики и противогрибковые при настройке метода культуры срез organotypic в лаборатории, но позднее их можно избежать, когда эксперт асептическая технология применяется. Текущий протокол использует морфологии клеток оценить жизнеспособность клеток. Для более количественного обследования фрагменты могут быть загружены с пропидий йодидом или аналогичных красители, как описано в других местах21. Однако важно помнить, что спектр излучения пропидий йодидом перекрывается с dsred, tdtomato и другие красные индикаторы. Еще одно ограничение пропидий йодидом и аналогичные реагентов является, что они не легко войти в более глубокие слои фрагмента, тем самым ограничивая оценки жизнеспособности клеток верхнего слоя клеток5.
Для доставки генов существует целый ряд методов. Основные преимущества использования AAV трансдукции organotypic срез культур для визуализации органеллы являются следующие: Аав трансдукции имеет лучший показатель успеха для Постмитотические олигодендроциты, по сравнению с не вирусный трансфекции методы22. Кроме того в organotypic культур присутствуют все типы клеток мозга, и Олигодендроциты имеют морфологию похож на что видели в естественных условиях, в том числе компактный миелина13. Это отличается от Олигодендроциты в монокультуре, которые не имеют связи с аксонов и таким образом не сделать компактный миелина. Imaging в vitro легче по сравнению с in vivo и предлагает лучше пространственным разрешением, которая представляет особый интерес при визуализации малых органеллы например митохондрий. Будущие исследования будут направлены на изображение в естественных условиях, но лица, большой вызов с оптических аберраций, вызванных липидов богатых Миелиновые оболочки. Кроме того Аав серотип тропизма и промоутер специфика могут различаться в vivo и in vitro условия13,23. В протоколе, представленные здесь MBP_mito_dsred AAV2/8 и AAV2/8 MBP_mito_GFP используется для визуализации Олигодендроциты митохондрий. AAV серотипа 2/1 также был протестирован с MBP_mito_dsred но инфицированных меньшее количество Олигодендроциты organotypic ломтиками (не показан). CAG_GFP AAV2/8 и AAV2/8 CAG_tdtomato был использован для визуализации Олигодендроциты цитоплазмой. Несмотря на использование общего CAG промоутер для этого, Аав 2/8 CAG_GFP и CAG_tdtomato выборочно инфицированных олигодендроциты, с только небольшое количество астроциты и нейроны заражения (они могут легко опознаны по их характерным морфологии). Эта избирательность для Олигодендроциты предположительно обусловлен тропизм Аав 2/8 серотипа24. Однако для выражений, ориентированные на органеллы, выше ячейки специфика достигли с MBP - или других конкретных Олигодендроциты промоутеров рекомендуется. Другие серотипы протестированы с CAG_GFP нами были Аав 2/1, 2/2, 2/5, 2/7, 2/9, наиболее которых инфицированы главным образом нейронов и астроциты (не показан).
В зависимости от конструкции и экспериментальных условиях потребуются изменения ячейки трансдукции. Если transduced клетки появляются слишком тусклым, попробуйте длиннее время в vitro после трансдукции увеличить выражение. Если клетки появляются яркие но нездоровой, сократить время после трансдукции. Если очень немногие клетки будут преобразованы, концентрация AAV может быть увеличена. Однако это также возможно, что время в пробирке после трансдукции слишком долго и что transduced клетки погибли. Для конструкций, используемых здесь уровни выражения были оптимальной 4-6 дней после трансдукции. В 7-8 дней после трансдукции клетки появился менее здоровыми, с blobby процессы, и через 10 дней после трансдукции, только несколько transduced клетки были видны (не показан).
Этот протокол использует вертикально микроскоп для живых изображений organotypic ломтиками. Это отличается от наиболее моно- и Сопредседатель культур, которые обычно используют инвертированным микроскопом. Это субоптимальные использовать инвертированным микроскопом здесь, потому что кусочки затем должны быть включены с конфетти вверх, который предположительно вызывает ломтики быть менее здоровым. Одним из преимуществ вертикально микроскопа является возможность установки добавить электрофизиологии. Кроме того использование насоса для изменения среднего означает, что решения наркотиков могут быть добавлены и удалены в ходе покадровой съемки. Недостаток с насосом — проблемы поддержания фокус, вызванные вибрации и течений в ванне. Под микроскопом, клетки постепенно станет меньшездоровым. Мы поэтому хранить фрагменты под микроскопом для максимум 1 час. Фотосъемка ломтики выброшены (специальные отходы). Для обеспечения визуализации условия являются оптимальными, визуализации управления клеток, в которых уже хорошо характеризуется митохондриальной движение, должны выполняться параллельно. Для например, митохондриальных движения в аксонов и дендритов может отражаться на преобразователя ломтики с Аав 2/1 Syn_mito_dsred (в котором dsred выражение управляется Синапсин промоутер нейрон специфические) или Аав 2/1 CAG_mito_dsred (с последующим иммуноокрашивания для идентификации клеток). Анализ митохондриальной движения может быть сделано с использованием нескольких кимограф инструмент в ImageJ как описано25.
Здесь мы описываем основные для визуализации неокрашенных миелина во время живых изображений. По сравнению с Оценка9, которая использует три волны возбуждения, ядро использует только один (488 нм) и таким образом проще реализовать. В оценка трех длинах волн показывают различные «куски» Миелиновые оболочки и вместе дать полное изображение оболочка. Кроме того оценка может использоваться для обнаружения Миелиновые оболочки структуры, такие как цитоплазматических карманы. С одной длины волны, используемые в ядре, дается более менее детального и влагалищ могут появиться гранулированный или дискретные (рис. 3). Тем не менее ядро визуализирует около 100% миелиновой оболочки, которые являются горизонтальное поле зрения. Таким образом основной полезен для обнаружения миелиновой оболочки, но не для анализа структуры миелина или целостности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Bergersen Линда Хильдегард и Magnar Bjørås для доступа к ячейке лаборатории и оборудование, персонал Janelia молекулярной биологии общий ресурс для плазмид и вирусом производства и Koen Vervaeke для помощи с измерения мощности лазера. Эта работа финансировалась ассоциацией норвежской здравоохранения, Норвежский исследовательский совет и микроскопии оборудование было профинансировано Norbrain.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | Needles used for in- and outlet of bath |
| Bioxide gas | AGA | 105701 | |
| Brand pipette bulbs | Sigma-Aldrich | Z615927 | Pipette bulbs |
| Bunsen burner (Liquid propane burner) | VWR | 89038-530 | |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | 64-0106 | Temperature controller - thermometer part |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 for incubator |
| Cover glass, square Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly. |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Delicate forceps | Finescience | 11063-07 | For dissection |
| Diamond scriber pen | Ted Pella Inc. | 54463 | |
| Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm | VWR | 612-1702 | Glass pipettes |
| Double edge stainless steel razor blade | Electron Microscopy Sciences | #7200 | Razor blade for vibratome |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| Filter paper circles | Schleicher & Schuell | 300,220 | Filter paper used for filtration of PFA |
| Fun tack | Loctite | 1270884 | Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath |
| Hand towel C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harp, Flat for RC-41 Chamber, | Warner Instruments | 64-1418 | Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW: 260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, Model 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Laminar flow hood |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCR Membrane, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | Confetti |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome |
| MEM-Glutamax with HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Micro Spoon Heyman Type B | Electron Microscopy Sciences | 62411-B | Small, rounded spatula with sharpened end for dissection |
| Millex-GP filter unit | Millipore | SLGPM33RA | Syringe filter unit |
| Millicell cell culture insert, 30 mm | Millipore | PICM03050 | Cell culture inserts |
| Minipuls 3 Speed Control Module | GILSON | F155001 | Peristaltic pump for live imaging - Control module part (connect to two-cannel head) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta Surface | Thermo Fischer Scientific | 140675 | Culture plate |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| Paraformaldehyde, granular | Electron Microscopy Sciences | #19208 | |
| PC-R perfusion chamber | SiSkiYou | 15280000E | Bath for live imaging |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri dish 140 mm | Heger | 1075 | Large Petri dish |
| Petri dish 92x16 mm | Sarstedt | 82.1473 | Medium Petri dish |
| Petridish 55x14,2 mm | VWR | 391-0868 | Small Petri dish |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | PBS tablets |
| R2 Two Channel Head | GILSON | F117800 | Peristaltic pump for live imaging - Two channel head part (requires control module) |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Large spatula for dissection |
| Sand paper | VWR | MMMA63119 | Optional, for smoothing broken glass pipettes |
| Scissors, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Large scissors for dissection |
| Scissors, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Small, sharp scissors for dissection |
| Single edge, gem blade | Electron Microscopy Sciences | #71972 | Single edge razor blade |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | Temperature controller - heater part |
| Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm | Millipore | SCGPT05RE | Filter to sterilize solutions |
| Super glue precision | Loctite | 1577386 | |
| Surgical scalpel blade no. 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Rounded scalpel blade |
| Temperature controller TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly) |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| Water jacketed incubator series II | Forma Scientific | 78653-2882 | Incubator |
References
- Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
- Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
- Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
- Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
- Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
- Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).
- Gow, A., Friedrich, V. L. Jr, Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
- Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
- Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
- Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
- Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
- Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
- Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).
- Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
- Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).
