Summary
I detta protokoll, fluorescently märkt T. cruzi skulle injiceras i genomskinliga zebrafiskar larver och parasit motilitet observerades i vivo med lätta blad fluorescensmikroskopi.
Abstract
Chagas sjukdom är en parasitinfektion som orsakas av Trypanosoma cruzi, vars motilitet inte är bara viktigt för lokalisering, men också för cellulära bindande och invasion. Nuvarande djurmodeller för att studera T. cruzi tillåta begränsad granskning av parasiter in vivo representerar en utmaning för förståelse parasit beteende under det inledande skedet av infektionen hos människor. Detta protozo har ett flagellar skede i både vektor- och däggdjur värdar, men det finns inga studier som beskriver dess motilitet i vivo. Syftet med detta projekt var att skapa en levande ryggradsdjur zebrafiskar modell för att utvärdera T. cruzi motilitet i kärlsystemet. Genomskinliga zebrafiskar larver injicerades med fluorescently märkt trypomastigotes och observerade använder ljus ark fluorescensmikroskopi (LSFM), en icke-invasiv metod att visualisera levande organismer med hög optisk upplösning. Parasiter kan visualiseras för längre tid på grund av denna teknik relativt låg risk för åldrad hud jämfört med confocal eller epifluorescence mikroskopi. T. cruzi parasiter observerades resor i cirkulationssystemet av levande zebrafiskar i olika stora blodkärl och äggulan. De kunde också ses bifogade till väggens gulesäcken och atrioventrikulärt ventilen trots de starka krafter som är associerad med hjärtat sammandragningar. LSFM av T. cruzi-inokulerade zebrafiskar larver är en värdefull metod som kan användas för att visualisera cirkulerande parasiter och utvärdera deras tropism, migrationsmönster och motilitet i dynamiska miljön av det kardiovaskulära systemet av ett levande djur.
Introduction
Chagas sjukdom orsakas av en protozo parasit T. cruzi. Cirka 6 till 7 miljoner människor i världen är infekterade med T. cruzi. Sjukdomen överförs främst i Latinamerika, men har rapporterats i USA, Kanada, och många europeiska samt vissa Western Pacific länder, främst på grund av migration av infekterade individer1. Chagas är till stor del vektorburna och överförs till människor genom kontakt med avföring från hematophagic insekter i Triatominae underfamiljen, allmänt känd som ”kysser fel”. Dock kan T. cruzi också överföras via blodtransfusioner, vertikal överföring från mor till barn, eller intag av livsmedel som förorenats med parasiter2. Den akuta fasen infektionen är främst eller konstitutivt symtom och varar mellan 6 till 8 veckor, varefter engagemang av immunsystemet styr parasit belastning, men eliminerar inte helt infektion3. De flesta individer anger sedan en kronisk asymptomatisk fas; dock utvecklar nästan 30% av patienterna en symtomatisk kronisk fas, där hjärt systemet och mindre ofta till mag och nervsystem är komprometterad4. Detta scenario innebär en utmaning för sjukdomsbehandling och kontroll eftersom det finns inget vaccin finns, och det finns endast två effektiva läkemedel för Chagas: benznidazole och nifurtimox. Båda behandlingarna kräver långvarig administrering och kan ha allvarliga biverkningar2.
Ökad förståelse för beteendet för T. cruzi är beteende i vivo avgörande för att fastställa parasitiska migration, cellulära fastsättning och invasion inom mottagande; en brist i vivo modeller begränsar utvecklingen av nya terapeutiska metoder. In vitro studier för T. cruzi infektion har visat att motilitet av trypomastigotes är viktigt för bindning till värd cellmembran och efterföljande cellulära invasion5. Energi utarmning i trypomastigotes i samtidig kultur med en mottagliga cellinje har visat sig minska cellulära invasion6. Intressant, i trypanosomatids karaktäriserats flagellar rörelse också som en skatteflykt mekanism mot parasit-specifika antikroppar7.
Flagellar motilitet har varit flitigt studerade in vitro- i Trypanosoma brucei, närbesläktade parasit som orsakar afrikansk Trypanosomiasis8. In vitro studier av motiliteten av dessa innebörder visade att simulering av villkoren i blod eller kroppsvätskor, inklusive viskositet och förekomsten av hinder som är representativa av blodkroppar, är viktigt för parasit framåt rörelse9 . Som av ännu varit det inte möjligt att visualisera förflyttning av parasiter i blodet i vivo.
Zebrafiskar larverna är en kraftfull modell för att studera värd-patogen interaktioner i vivo. De är små, billig och relativt lätt att höja när jämfört med andra etablerade ryggradsdjur modeller för Chagas sjukdom. Zebrafisk har medfödd och adaptiv immunsystem liknar människor, men deras adaptiva immunsystemet börjar utvecklas på 4 dagar efter befruktning (dpf) och är inte mogen för ytterligare flera veckor10. Under tidig utveckling, när endast makrofager är närvarande, finns det ett stort fönster för att studera parasit beteende utan omedelbar immun störningar10. Den största fördelen med att utnyttja zebrafiskar larver som ryggradsdjur modell för att studera patogen beteende ligger dock i deras optisk transparens, vilket gör dem mottagliga för mikroskopiska screening och imaging11. Dessutom finns det flera verktyg för att manipulera fisk genetik. Till exempel är Casper stammen en mutant rad zebrafiskar med ingen pigmentering, gör djuret helt transparent och användbar för visualisering av enskilda organ och för realtidsspårning av injicerade cellerna12.
En viktig begränsning av längsgående observation av snabbt rörliga parasiter i levande zebrafiskar använder confocal eller epifluorescence mikroskopi ligger i omöjligheten av imaging vid hög förvärv hastigheter och stor penetration djup med bra bildkvalitet och låga risk för åldrad hud. Ljusa blad fluorescens micsroscopy (LSFM) är en framväxande bildteknik som övervinner dessa begränsningar för att tillåta dessa observationer. Med ett mål för att upptäcka fluorescens och ett andra ortogonala belysning mål som bara lyser fokalplanet upptäckt målet, är det möjligt att få högupplöst optisk sektioner som i en confocal mikroskopet, men med betydligt minskad åldrad hud, även med avseende på epifluorescence mikroskopi13. Den LSFM teknik som används här som kallas enda planet belysning mikroskopi (SPIM), där ett tunt ljus lyser upp ett enda plan inom larvaena zebrafiskar.
Syftet med denna metod är att etablera larval zebrafiskar som en livskraftig icke-infektion modell för att förstå T. cruzi motilitet och beteenden i vivo. För att åstadkomma detta, vi injicerade genomskinliga zebrafiskar larver med fluorescently märkta trypomastigotes, cellulär form ansvarar för infektion av människor, och identifierade rörligheten för T. cruzi i kardiovaskulär cirkulationen av zebrafisk använda LSFM.
Protocol
följande protokoll godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén av Los Andes universitet (CICUAL). Biosäkerhet nivå 2 (BSL-2) riktlinjer bör följas strikt för att förhindra kontaminering med patogenen T. cruzi.
Obs: djurens skötsel och underhåll: Casper zebrafiskar, en genetiskt modifierade stam av zebrafisk (Danio rerio) används i detta protokoll på grund av deras värdefulla optisk transparens i alla utvecklingsstadier. Fisk är manipulerade med optimal vård villkor för arter 14, i en 14 h ljus-10 h mörka cykel, vid 28 ± 1 ° C, i en pH (7,0-7,4) kontrolleras multi tank recirkulerande vatten-system. Djuren utfodras dagligen med levande Artemia (Artemia salina) och berikad med uppfödning mat. Alla protokoll godkändes av CICUAL på Universidad de los Andes (C.FUA_14-017).
1. beredning av ägg vatten
- Förbered 0,6 g/L akvarium salt i omvänd osmos (RO) eller avjoniserat vatten (DI) och lägga till 0,01 mg/L metylenblått lösningen.
Obs: Uppmätta konduktiviteten bör vara 400-500 µS/cm och pH nivå på 7,2-7,9. För att sänka pH, lufta ägg vatten ett par timmar.
2. Beredning av Tricaine lager lösning
- Förbered 0,4% tricaine stamlösning av upplösning 400 mg tricaine (MS-222) i 97,9 mL destillerat vatten (ddH 2 O). När pulvret är helt upplöst, justera pH till 7,0 använder 2,1 mL 1M Tris (pH 9,0) och kyla lösningen.
3. Beredning av 1,0% låg smältpunkt agaros
- Lös låg smältning pekar agaros pulvret i ägg vatten till en slutlig koncentration på 1,0%. Värm blandningen i en mikrovågsugn eller på en värmeplatta med kontinuerlig omrörning tills agar lösningen visas homogena.
- Lagra alikvoter vid 4 ° C längre än en vecka.
4. Parning Assay och embryosamlingsgruppen
- tre dagar före injektioner ställa in parningar med friska par manliga och kvinnliga fisk i avel tankar. Berikning med glas kulor och konstgjorda växter förbättrar lekande. Parningar ska ställa in under eftermiddagen och lämnas över natten.
- Nästa morgon, samla lekt ägg genom att tömma tanken genom en sil och tvätta äggen med ägg vatten. Ta bort alla ägg genom invertering silen och hälla ägg vatten genom silen i en petriskål. För att hålla embryon friska, rent deras vatten genom att ta bort eventuella skräp och döda embryon med en överföring plast pipett.
- Överföra embryon till en inkubator på en stabil temperatur på 28,5 ° C att möjliggöra utveckling av embryon enligt zebrafiskar mellanlagringsplatsen standarder 15. Undersöka embryona två gånger om dagen, och kassera omintetgör ägg för att hålla kopplingen friska.
5. Embryo Dechorionation
Obs: den här proceduren krävs om embryon inte har kläckts vid tidpunkten för injektion. I den här proceduren " larverna " är djur ur deras chorion från 48 h efter befruktning (hpf) framåt.
- På dagen för experimentet, placera petriskål som innehåller de friska embryona under en dissekera stereoskop.
- Ta motsatta ändarna av chorion med två skarpa pincett (Dumont #5), och tår och dra öppna försiktigt chorion. Ca 5-6 larver injiceras i taget, och vanligtvis 3-4 är avbildade.
- Ta bort chorions från vattnet med överföring pipett.
6. Förbereda injektion Material
- förbereda 1.0 mm nålar med tunn vägg glas kapillärer och en mikropipett avdragare enhet med följande inställningar: 2 lätta vikter + 1 tung vikt, 2 mm top pull + 5 mm botten pull, 75,9 ° C (steg 1) + () 78,2 ° C Steg 2). Lagra nålar i en petriskål på en remsa av modellera. Perfekt nålen bör ha en smal spets, som T. cruzi mäta cirka 20 x 1-3 µm och kommer att passera genom nålen lätt. Längden på spetsen kan variera: en längre spets är användbart för att nå djupare strukturer, men en kortare tips blir styvare underlättar injektion för användaren.
Obs: Nål spets storlek beror på temperaturen används: en högre temperatur för steg 2 resulterar i en längre och finare spets. - Bered en 1,5% agaros i ddH 2 O och häll det i en 10 cm petriskål. Täcka ett djup av cirka 1,0 cm.
- Placera en prefabricerade Mikroskop mögel över Agarens och låt det stelna.
- Lyft prefabricerade Mikroskop mögel ut och tillsätt ägg vatten för lagring vid 4 ° C. Detta förhindrar Agarens uttorkning.
- Lägg ägg vatten till tricaine stamlösning till en slutlig koncentration av 150 mg/L. Store vid 4 ° C.
7. Cellodling för parasit tillväxt
- parasiter bibehålls i en mänsklig astrocytom cellinje (CRL-1718) med den metod som beskrivs av Vargas-Zambrano o.a. 16
- Starta kulturen av mänskliga celler i en T25 kultur kolvar (yta = 25 cm 2) på en densitet på 2 x 10 5 eller 4 x 10 5 celler i 4 mL RPMI-1640 medium med 10% av fetalt kalvserum (FCS), kompletterad med 2 mM L-glutamin, 4,5 g/L glukos, 10 mM HEPES, 1 mM pyruvat och 1% penicillin-streptomycin (kallas " komplett media "). Inkubera astrocytom kulturer vid 37 ° C i en 5% CO 2 miljö.
- När en enskiktslager är konfluenta, lossa cellerna med 2 mL av 0,25% av trypsin-EDTA genom inkubering under 3 minuter vid 37 ° C. visuellt kontrollera celler för avskildhet och blockera trypsin lösningen med 10% FCS i en 15 mL tub 3 mL RPMI-1640.
- Centrifugera cellsuspensionen för 5 min vid 1.350 x g.
- Tvätta den resulterande cellulära pelleten i DMEM medium i en 15 mL tub och Centrifugera under 5 minuter vid 1.350 x g 22 ° C.
- Räkna cellerna manuellt i en Neubauer kammare och kontrollera för livskraft i ett ljusmikroskop på 40 X förstoring.
- Försiktigt åter tillfälligt cellulära pellet 4 ml av komplett media och använda den för att skapa nya cellkulturer med 2 x 10 5 celler per T25 kultur kolv.
8. T. cruzi kultur och märkning
- parasiter är en stam ursprungligen erhållits från en infekterad människa och kännetecknas som T. cruzi DA stam (MHOM/CO/01/DA), genotyp diskret skriva Unit (DTU) TcI 16. Efter 3 eller 4 dagar av odling, samla de rörliga parasiterna från mänskliga astrocytom cell kultur supernatanten och Centrifugera under 5 minuter vid 1.350 x g. Kassera mediet.
Obs: Parasiter i komplett medium kan användas för nytt kultur i förhållandet 1:1 med astrocytom celler i T25 kultur mätkolvar. - Försiktigt resuspendera pelleten i 10 mL steril 1 x fosfat buffert saltlösning (PBS) med 0,1% FCS och Centrifugera under 5 minuter på 1.350 x g.
- Avlägsna supernatanten och slamma i 1 mL PBS. Ta 10 µL för inventering frisimmande parasiter i en kammare som Neubauer.
- Ta resten av nytt svävande parasiter (990 µL) och tillsätt 1 µL av Carboxyfluorescein diacetat Succinimidyl Ester (CFSE), slutlig koncentration 5,0 µM. Inkubera i 10 min i rumstemperatur.
Obs: CFSE lager vid 5 mM ska vara aliquoted och underhållna på -20 ° C. - Pellet parasiter (1.350 x g, 5 min). Rekonstituera parasit pelleten genom att snärta röret och tvätta i 10 mL 1 x PBS-0.1% FCS följt av en efterföljande spin (1.350 x g, 5 min).
- Avlägsna supernatanten och försiktigt åter centrifugerade märkt parasit i 1 X PBS med lämplig volym att erhålla en slutlig koncentration på cirka 10-20 parasiter nL injektionsvätska.
- Använda en liten volym (∼ 10 µL, ca 1 x 10 4 -2 x 10 4 parasiter) av trypomastigotes att bedöma lönsamhet och märkning. En inverterad fluorescens Mikroskop kan användas för direkt visualisering av parasiterna. I överförd lätt läge, kontrollera att parasiterna flytta. I fluorescens-läge, använda filtret Fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) för att bedöma parasit märkning.
9. Injicera zebrafiskar larver
- parasit laddar
- ta 10 µL av parasiter från resuspension (100 µL) och ladda in dem i förseglade glas nålar använder en 10 µL microloader pipettspetsen.
- In glas nålen i nålen innehavaren av micromanipulator, använda en magnetisk stå och placera bredvid stereoskop.
- Med fin pincett under den stereoskop, skär nålen skapar ett trubbigt öppet slut och mäta droppe storlek för att erhålla en injektionsvolym om 1 nL (det motsvarar en pärla diameter på 0,12-0,13 mm mätt i mineralolja 17). Ett längre tips är att föredra så att nålen kan nå strukturer djupt inne i fisken utan att skada vävnaden. I detta protokoll, en trubbig nål används, men en avfasad nål kan användas samt.
- Montering
- söva larver av 48 hpf, med 150 mg/L tricaine. Kontrollera att de inte svarar för att röra, men se till att hjärtat slår.
- Placera larverna i Mikroskop agaros mögel i en sidoläge.
- Placera nålen innehavaren bredvid stereoskop och justera micromanipulator så att spetsen på nålen är i mitten av synfältet. Flytta petriskål beredd i steg 6,2 - till 6,4 så att larver äggulan är nära nålspetsen. Kontrollera att larven att hjärtat fortsätter slå.
- Ange microinjector värden enligt följande: injektion tryck 9,6 pounds per tum (psi); Håll trycket: 20 psi; 100 ms rad gating; periodvärdet 1,9 (motsvarar 10,9 ms). Volymen av injektionen bör vara mellan 1-3 nL, med cirka 10-20 parasiter nL.
10. Injektion av parasiten
- injicerar fisken i superior-främre delen av äggulan på kanalen av Cuvier. Detta steg bör praktiseras för att säkra djurens överlevnad efter injektionen. Det tar cirka 10 min att injicera 5-6 larver framgångsrikt.
- Som en kontroll, injicera 1-2 larver med samma fordon volym (1 x PBS).
- Överför larven till färska ägg vatten omedelbart.
11. LSFM montering av injiceras larver
- överföra larven injiceras med parasiter till en tom petriskål och ta försiktigt bort det omgivande vattnet med en plast pipetten och absorberande papper. Tillsätt 100 µL av förvärmd 1,0% låg smältning pekar agaros omedelbart (se steg 3 för agaros förberedelse) att täcka larven. Säkerställa Agarens inte är över 40 ° C.
- Sätt en rak tråd inuti en 1,0 mm glas kapillär och använda den som en kolv för att suga upp larven i vertikal position. Se till att lämna en liten mängd av agaros ovan larven. Vänta tills Agarens stelnar innan utsätta larven (detta kommer att kräva ett par minuter). Om nödvändigt, tryck ut överflödig agaros nedanför larven och skär den off.
- Placera kapillären i mikroskopet provhållaren och tryck ut slutet innehållande larven tills det hänger gratis från kapillären. Preparatet kammaren ska fyllas med tricaine lösning (150 mg/L) och temperaturen ligger på 28 ° C.
- Position larven framför eleven av upptäckt målet använder ett XYZ-micromanipulator system. För rotationer om den vertikala axeln, använda en rotation scenen. Positionering av larven bör göras i överförd lätt läge att tydligt identifiera larval strukturer.
12. LSFM Imaging av injiceras parasiter
- förändring till fluorescens-läge och justera belysning intensitet samt exponeringstiden att minska photodamage och optimera tidsupplösning. För dessa särskilda försök, vi använde en makt 2,8-3.0 MW för provet och utsätts varje bildruta för 200 ms använder en kamera med 6,45 µm pixlar och ~ 70% quantum effektivitet vid upptäckt våglängder. Dessa inställningar bör resultera i tillräcklig utsträckning exponerade bilder på cirka 5 ramar/s. se till att använda ett mål med den högsta möjliga numeriska bländaröppningen.
- Startar en video förvärv av regionen av intresse (ROI). I vårt fall observeras parasiter bifogas ventiler och fritt flytta runt området hjärta. Det rekommenderas att ta en video av en enda plan över tid, eller att använda micromanipulator eller piezo-galvo systemet för att fokusera olika plan medan parasiten flyttar.
Obs: Den här proceduren är användbar för kort anskaffningstid för upp till 2 h. För lång sikt förvärv, larverna ska monteras med hjälp av alternativa metoder 20.
13. Bild bearbetning och analys av förvärvade Data
Obs: bildbehandling utfördes på en persondator med en 2,90 GHz processor, 8.00 GB minne och ett grafikkort med 1,00 GB minne.
- Öppna den förvärvade datamängden i bildbehandling programvara val. Öppna programvaran FiJi rekommenderas för LSFM databehandling och analys 21.
- i bild analys programvara, justera ljusstyrka och kontrast nivåer för att förbättra bilderna.
Obs: Inga fasta parametrar är användas i detta fall, men Markera den " Auto " alternativet kan vara användbart att få en initial förbättring. - Välj ROI.
Obs: För att spåra enskilda parasiter, FiJi har både manuell och automatisk spårning plugins tillgängliga.
14. Återställer avbildade larver
- ta bort larven noggrant från agaros med fin pincett och ett hår slinga verktyg. Överföra fisken tillbaka till färskt ägg vatten och kontrollera för återhämtning efter 15 min. återvända larven till inkubatorn på 28 ± 0,5 ° C.
- Fortsätt alternativt till eutanasi larvaena avbildad med en överdos av tricaine. Sedan introducera larverna i en lösning av natriumhypoklorit (6,15% NaClO) för 5 min att döda parasiten. Kassera enligt institutionen ' s standardprotokoll.
Representative Results
Optimala förhållanden för injektion:
Grupper av zebrafisk larver injicerades vid 24, 48, 72, 96 och 120 hpf, på olika anatomiska platser, och deras överlevnad undersöktes varje dag i 5 dagar. Efter 5 dagar efter injektion, embryon injiceras 24 hpf hade 6,25% (2/32) överlevnad, medan 95% (38/40) av larver som injiceras vid 48 hpf överlevde. Som en kontroll injicerades larver med 1 x PBS som ett fordon. Det fanns inga skillnader i överlevnad mellan fordon-insprutning och parasit-injiceras larver, som anger inga parasiter-beroende effekter på överlevnad av fisken (p = 0,08). Larver som injiceras mellan 72-120 hpf hade jämförbar överlevnaden till 48 hpf-injiceras larver på konstant injektionsvolym. För alla förfaranden som presenteras här, användes 48 hpf larver på grund av sin användarvänlighet manipulation och ha utvecklat organ och lättgenomträngliga hud utan uppenbara skador efter injektionen.
Larver som injiceras vid 48 hpf var injiceras i perikardiell utrymme, svans muskel, hindbrain ventrikeln, öron vesikler, ryggsträng och kanalen av Cuvier i gulesäcken. Det fanns inga skillnader i överlevnad av larver injiceras på olika anatomiska platser. Den snabbaste och lättaste regionen att injicera var dock kanalen av Cuvier ligger i den främre delen av gulesäcken (figur 1, Movie 1). Injektioner på webbplatsen får införandet av högre volymer med en lägre risk för skador på vitala strukturer. Dessutom, mellan 24-72 hpf är denna region en optimal plats direkt åtkomst till utveckla blodkärlen och hjärtat11.
Parasiten visualisering med hjälp av LSFM:
Inom 8-10 min efter injektion av T. cruzi i kanalen av Cuvier, identifierades parasiter i zebrafiskar larver med LSFM på grund av deras CFSE fluorescerande signal och den optisk transparensen av larverna. Efter inympningen observerades parasiter antingen följas väggar runt cirkulationssystemet eller reser i riktning mot blodflödet (figur 2, figur 3). När en parasit förblir kopplad till en hjärt struktur, såsom atrioventrikulärt ventilen, svänger det med hjärtat sammandragningar, vilket indikerar att de molekylära mekanismerna för adherencen av parasiter kan vara effektiva i vår ryggradsdjur modell (Movie 2, film 3 Kompletterande movie 1). T. cruzi följs också väggarna i larval gulesäcken ( figur 2, Movie 2), en struktur som senare kommer att återabsorberas och bli en del av zebrafisk inälvan22. Detta kan vara liknar vad som händer under fasen kronisk sjukdom hos infekterade människor, där parasiter finns i hjärtmuskelceller och de mag nervsystem23,24. När inte ansluten, parasiterna drev igenom blodflödet i samma riktning som erytrocyterna ( figur 3, film 4). Parasiter kunde observeras i olika storlek fartyg av fisk, men var rikligare i perikardiell utrymme och i regionen intilliggande äggula som innehåller blodflödet ( figur 2, figur 3, kompletterande film 2).
På 10 min efter injektionen var det svårare att upptäcka enstaka former av parasiten på grund av deras fördelning längs kärlsystemet, och en oförmåga att snabbt skärmen olika anatomiska platser av fisk på grund av ett begränsat synfält i LSFM (på 40 X förstoring ). Efter 24 h efter injektion (hpi), CFSE signalen börjar ansamlas i regionen nära utveckla tarmen (kompletterande figur 1).
Figur 1: Optimal injektionsstället. (A) bild av larvaen 48 hpf visar optimal injektionsställe vid kanalen av Cuvier (gul pil) med hjälp av en vanlig stereoskop. (B) förstorad Visa Box i en visar kanalen av Cuvier (gul pil). Skalstapeln = 200 µm (A), 50 µm (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: LSFM bilder av en statisk parasit i en 48 hpf larv. T. cruzi parasiten (gul pil) förblir klibbade till väggarna i gulesäcken, hela sekvensen time-lapse (7,2 s, 17,2 s och 27,2 s), ca ~ 15 min efter parasiten injektion. Ingen förändring i position av parasiten observeras under en förvärv av minst 30 s. a, Atrium; v, ventrikeln. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Banan för en parasit som resor i perikardiell rymden med hjälp av LSFM. T. cruzi parasiten kan spåras medan drivande i perikardiell utrymmet (PS), efter riktning mot blodflödet (spår visas i rött) ca ~ 15 min efter parasiten injektion. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Film 1: blodcirkulationen dalen av äggulan i en larv 48 hpf. Film av en larv 48 hpf visar blodcirkulationen dalen eller kanalen av Cuvier använder en regelbunden stereoskop. Olika regioner är fokuserade under videon för att visa röda blodkroppar cirkulerande i hela kanalen. Gul pil visar optimal injektionsstället. Filmen spelades ca 10-15 min efter parasiten injektion. Vänligen klicka här för att ladda ner video.
Film 2: T. cruzi parasiter bifogas med väggar av gulesäcken. LSFM-film av en larv 48 hpf visar att T. cruzi parasiter förbli vidhäftat till gulesäcken ca 10-15 min efter parasiten injektion. Ingen förändring i position av parasiten observerades under en förvärv av minst 30 s. a, Atrium; v, ventrikeln. Vänligen klicka här för att ladda ner video.
Film 3: T. cruzi parasiter bifogas med väggarna i hjärtat. LSFM film av en larv 48 hpf visar att T. cruzi parasiter Wikströmn följas hjärt-väggen, trots de starka hjärta sammandragningarna ca 10-15 min efter parasiten injektion. Erytrocyter kan observeras som svart rundad skuggor. Vänligen klicka här för att ladda ner video.
Movie 4: parasiter inflyttning perikardiell utrymmet. LSFM film av en larv 48 hpf visar T. cruzi parasiter drifting i perikardiell utrymmet. Två parasiter kan spåras vid olika tidpunkter (ID 1, i röd cirkel, och ID 2 i gul cirkel), efter en liknande bana. Filmen spelades in ca 10-15 min efter parasiten injektion. Vänligen klicka här för att ladda ner video.
Kompletterande Figur1: ansamling av CFSE fluorescerande signal i äggulan. Stereoskop bilder av en vildtyp larv injiceras vid 48 hpf på kanalen av Cuvier. CFSE fluorescerande signal ackumuleras successivt i äggulan, efter två dagar efter injektion (48 hpi). Skalstapeln = 500 µm. vänligen klicka här för att ladda ner siffran.
Kompletterande film 1: parasiter bifogas väggar och ventiler i cirkulationsorganen. Stereoskop tid serie bilder av en vildtyp larv injiceras vid 48 hpf. Bilderna tas med 0.2 s mellanrum fånga T. cruzi parasiter flytta synkront med hjärtmuskulatur sammandragningar på atrioventrikulärt ventilen. Filmen spelades ca 30 min efter parasiten injektion. Vänligen klicka här för att ladda ner video.
Kompletterande Movie 2: rörliga och klibbade parasiter i periventrikulär utrymme och äggula. LSFM film av en larv 48 hpf visar T. cruzi parasiter drifting eller anslutit sig till perikardiell utrymmet eller äggulan. En överförd ljus Visa observerades för de första 5 s. Vyn fluorescens observerades från 5.2-25,8 s. Filmen spelades in ca 10-15 min efter parasiten injektion. Vänligen klicka här för att ladda ner video.
Discussion
Denna studie belyser fördelarna med zebrafiskar som en djurmodell för att studera patogen beteende i vivo. I synnerhet denna studie föreslår en metod för att visualisera patogenet T. cruzi i sin naturliga miljö: hematic omsättning. Miljön av den cirkulatoriska närmiljön i fisk är jämförbar med däggdjur, och trypanosomatids har utvecklats mekanismer för resor, undkomma immunförsvaret och fästa till celler för infektion i denna miljö25. Detta protokoll ger en beskrivning av ett optimalt förfarande för kultur av T. cruzi i en human cellinje och efterföljande isolering av flagellar former för fluorescerande märkning. Det visar sedan lämpliga inställningar för framgångsrika injektion av parasiterna i genomskinliga zebrafiskar för senare montering och visualisering med hjälp av LSFM. Slutligen ger detta protokoll förslag på effektiva i vivo imaging parasit läge och rörelse i omlopp med LSFM.
Flagellen av innebörder framgår dess bakre regionen, flödar från cellkroppen, och låser sig gratis på den främre delen av organismen26. T. cruzi framdriver sig genom att vifta flagellen framför kroppen, som böljer parasitens hela kroppen. Flagellar rörelse är inte bara oumbärligt för parasit motilitet, som i fallet med T. brucei27 (vilka smittämnen av afrikansk trypanosomiasis), men det används också för cellulära infektion, vilket har visats i T. cruzi5 ,28. Även om zebrafiskar inte de naturliga värdarna för T. cruzi, kan parasitens motilitet studeras i en utveckla hjärt-cirkulationssystem med de protokoll som beskrivs här. Dessutom finns det innebörder arter som infekterar mörtfiskar, klassen av zebrafiskar, såsom T. carassii och T. borreli25. Dessa parasitarter kunde användas för att studera i realtid rörelser och kvarstad mekanismer av dessa trypanosomatids; sådana studier kan ge insikt i däggdjursceller infektionsprocessen.
I denna studie injiceras motila T. cruzi parasiter var observerade reser genom kardiovaskulära cirkulationen av inokulerade fisk, flyttar tillsammans med ogenomskinlig erytrocyter och ansluter sig till strukturer i hjärt-kärlsystemet väggarna. Vi använde en hembyggda LSFM med en 10 X akromatisk långa arbetsavstånd luft mål (17,6 mm) för belysning armen med en numerisk bländare på 0,25. En 40 X apokromatiska vatten nedsänkning mål med en numerisk bländare på 0,8 och ett avstånd om 3,5 mm användes för detektion armen. Syftet upptäckt var nedsänkt i provkammaren, medan syftet belysning var utanför kammaren. En port i kammaren förseglas med ett täckglas och optiska lim tillåtet för belysning balken ange kammaren, som skildras i Lorenzo o.a. 18 för belysning, vi använde en 50 mW DPSS laser på 488 nm vars makt var moduleras av ett Acousto optiskt avstämbara Filter. Upptäckt sökvägen används filter kompatibelt med grönt fluorescerande Protein (GFP) eller FITC. Ljus ark Mikroskop utrustat med kapillär provhållare (helst med automatisk rotation) och temperaturkontroll av provkammaren bör vara lämplig för denna ansökan. Mikroskopet bör anpassas och kalibreras enligt tillverkarens anvisningar eller användarens laboratorium standardprotokoll före förvärv, om det behövs. I detta protokoll kontrollerade vi mikroskopet med SPIM programvara19.
Det är viktigt att notera att i cirkulationen av zebrafiskar, larver parasitiska fastsättning är effektiv. I kardinal anda förblev parasiter knuten för upp till flera minuter. i hjärtat höll de på att ventiler och väggar, oscillerande med hjärtat sammandragningar. Ytterligare studier återstå för att klarlägga huruvida T. cruzi interagerar med de flödande erytrocyter som drift i riktning mot blodflödet. Tidigare in vitro- studier har visat att förekomsten av fasta strukturer (dvs, blodkroppar) eller ökad viskositet vätskan att efterlikna blod in vitro-, har en betydande effekt på motilitet och hastighet av parasiten 9.
Det finns många frågor angående kursen av infektion av T. cruzi hos människa efter amastigotes fly Fagocytos celler, de initialt infekterade cellen typ29. Till exempel hur kommer de fram till sina målorgan? Vilka är mekanismerna för tropism till Rekommenderad organ, såsom hjärt-, mag- och centrala nervsystemet? Intressant i denna studie var parasiter ursprungligen avbildas i hjärtat eftersom det var platsen för högsta täthet av parasiter. Dock CFSE signalen därefter ackumuleras i utvecklingsländer tarmen av 7 dagar efter injektionen. Även fisk och däggdjur anatomi är olika, visar resultaten av denna studie en form av tropism, som observerades det att parasiter uppvisade tropism mot kända Rekommenderad målorgan trots organismers skillnader. En betydande begränsning av denna studie rör temperaturen används i experiment. Zebrafiskar larver bör hållas runt 28 °C under hela förfarandet. Även om denna temperatur kan vara liknande till vektor värden (insekter av Triatominae underfamiljen), är det helt annorlunda från de varmblodiga däggdjur som utgör de slutliga värdarna (cirka 37 ° C). T. cruzi är kända för att ha flagellar levande former i båda värdarna; Det är dock viktigt att komma ihåg att denna faktor kan ha en effekt i beteendet hos djur i vivo.
Även om det fish´s adaptiva immunsystemet inte är mogna förrän 4 veckor efter befruktningen, är det medfödda immunsystemet aktiv tidigt i utvecklingen10. Så tidigt som 48 eller 96 hpf, observerades Fagocytos celler har uppslukat märkt innebörder (inga data anges). Detta begränsar fönstret tid för visualisering av parasiten. Dock om en studie var att fokusera på utvärdering av fish´s immunsvaret, kan injektion i senare skeden rekommenderas. Injektion av parasiter i transgen fisk linjer med märkta makrofager eller andra celler i immunförsvaret kan också användbart i att studera parasit fastsättning och möjliga endocytos mekanismer. Det är viktigt att notera att om parasiter är märkta med CFSE, transgena cell etiketter bör inte GFP och en markör i den gula eller röda änden av spektrumet krävs.
För att bedöma parasit detaljerad rörelseriktning, kan det vara användbart att följa sin bana i 3 dimensioner (3D). För 3D-visualisering och återuppbyggnad av processen är ett höghastighetståg system nödvändigt. Med den utrustning som används i detta protokoll, är det endast möjligt att visualisera parasiter i ett plan. I det här fallet prioriterat vi att upprätthålla fokalplan stabilitet under parasit rörelsen och registrerar dess bana i ett plan.
Den metod som föreslås här banar väg för ytterligare undersöka parasit beteende i kardiovaskulär omlopp. Sammanfattningsvis är grundläggande stegen för imaging levande fluorescerande parasiter inuti zebrafiskar larver:(i) användning av tidiga kläckta embryon (24-48 hpf) eller larver, eller djur mellan 72-96 hpf med ingen pigmentering så att de är öppet och lätt att injicera; (ii) bild larver så snart som möjligt efter injektion för att undvika parasit clearance av Fagocytos celler; och (iii) fokusera på LSFM på platsen av intresse (t.ex., perikardiell regionen) och behålla fokus. Detta nya förfarande tillåter visualisering av trypomastigotes i en miljö jämförbar med dess naturlig infektion nisch, som ger för första gången möjligheten att studera T. cruzi i en levande organism.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av den Convocatoria Interfacultades från Vicerrectoría de Investigaciones de la Universidad de los Andes, och programmet USAID forskning och Innovation Fellowship. Vi tackar Juan Rafael Buitrago och Yeferzon Ardila för fisk underhåll och hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-10 μL Micropipette | Fisherbrand | 21-377-815 | |
| Agarose RA | Amresco | N605 | Regular |
| Agarose SFR | Amresco | J234 | Low Melting point |
| Aquarium salt | Instant ocean | SS15-10 | |
| Cell Count chamber | Boeco | Neubauer | |
| Cell culture flasks | Corning | 430639 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| CFSE | ThermoFisher | C34554 | |
| Detection objective | Nikon 40x 0.8NA | 40x CFI APO NIR | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Dumont #5 fine forceps | World precision Instruments | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
| Filter | Chroma | ET-525/50M | |
| Glass capillaries for embryo mounting | Vitrez Medical | 160215 | |
| Glass capillaries for pulling needles | World precision instruments | TW100-4 | |
| Glucose | Gibco | A2494001 | |
| HEPES | Gibco | 156300-80 | |
| Incubator | Thermo Corporation | Revco | |
| Larval microinjection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| Laser | Crystalaser | DL488-050 | |
| L-glutamine | Gibco | 250300-81 | |
| Methylene blue | Albor Químicos | 12223 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| Micromanipulator system | Sutter Instrument | MP-200 | For LSFM |
| Micropipette puller device | Narishige | PC-10 | |
| Microscope | Olympus | CX31 | |
| Microscope (inverted) | Olympus | CKX41 | |
| Multipurpose microscope | Nikon | AZ100M | |
| Neubauer counting chamber | Boeco Germany | ||
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-163 | |
| Petri dish 94x16 | Greiner bio-one | 633181 | |
| Plastic pasteur pipette | Fisherbrand | 11577722 | |
| Rotation stage | Newport | CONEX-PR50CC | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R4130 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Stereoscope | Nikon | C-LEDS | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | |
| TRIS | Amresco | M151 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | R-001-100 | |
| Tubes 15 ml | Corning | 05-527-90 |
References
- WHO. Chagas disease (American trypanosomiasis). , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/ (2017).
- Bern, C. Chagas's Disease. New England Journal of Medicine. 373 (5), 456-466 (2015).
- Sosa Estani, S., Segura, E. L., Ruiz, A. M., Velazquez, E., Porcel, B. M., Yampotis, C. Efficacy of chemotherapy with benznidazole in children in the indeterminate phase of Chagas’ disease. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 59 (4), 526-529 (1998).
- Rosas, F., Roa, N., Cucunuba, Z. M., Cuellar, A., Gonzalez, J. M., Puerta, J. C. Chagasic Cardiomyopathy. Cardiomyopathies - From Basic Research to Clinical Management. , (2012).
- Finkelsztein, E. J., et al. Altering the motility of Trypanosoma cruzi with rabbit polyclonal anti-peptide antibodies reduces infection to susceptible mammalian cells. Experimental Parasitology. 150, 36-43 (2015).
- Martins, R. M., Covarrubias, C., Rojas, R. G., Silber, A. M., Yoshida, N. Use of L-Proline and ATP Production by Trypanosoma cruzi Metacyclic Forms as Requirements for Host Cell Invasion. Infection and Immunity. 77 (7), 3023-3032 (2009).
- Engstler, M., et al. Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes. Cell. 131 (3), 505-515 (2007).
- Uppaluri, S., et al. Impact of Microscopic Motility on the Swimming Behavior of Parasites: Straighter Trypanosomes are More Directional. PLoS Computational Biology. 7 (6), e1002058 (2011).
- Heddergott, N., et al. Trypanosome Motion Represents an Adaptation to the Crowded Environment of the Vertebrate Bloodstream. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003023 (2012).
- Gratacap, R. L., Wheeler, R. T. Utilization of zebrafish for intravital study of eukaryotic pathogen–host interactions. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 108-115 (2014).
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-Pathogen Interactions Made Transparent with the Zebrafish Model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Huisken, J. Slicing embryos gently with laser light sheets. BioEssays. 34 (5), 406-411 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene. http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Vargas-Zambrano, J. C., Lasso, P., Cuellar, A., Puerta, C. J., González, J. M. A human astrocytoma cell line is highly susceptible to infection with Trypanosoma cruzi. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 108 (2), 212-219 (2013).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (25), e1115-e1115 (2009).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6, 22 (2011).
- Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using μManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), e10 (2014).
- Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (84), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ng, A. N. Y., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmental Biology. 286 (1), 114-135 (2005).
- Higuchi, M. D. L., et al. Correlation between Trypanosoma cruzi parasitism and myocardial inflammatory infiltrate in human chronic chagasic myocarditis: Light microscopy and immunohistochemical findings. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 2 (2), 101-106 (1993).
- Vago, A. R., Silva, D. M., Adad, S. J., Correa-Oliveira, R., d'Avila Reis, D. Chronic Chagas disease: presence of parasite DNA in the oesophagus of patients without megaoesophagus. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (3), 308-309 (2003).
- Wiegertjes, G. F., Forlenza, M., Joerink, M., Scharsack, J. P. Parasite infections revisited. Developmental & Comparative Immunology. 29 (9), 749-758 (2005).
- De Souza, W. Basic cell biology of Trypanosoma cruzi. Current Pharmaceutical Design. 8 (4), 269-285 (2002).
- Langousis, G., Hill, K. L. Motility and more: the flagellum of Trypanosoma brucei. Nature Reviews. Microbiology. 12 (7), 505-518 (2014).
- Johnson, C. A., et al. Cellular response to Trypanosoma cruzi infection induces secretion of defensin α-1, which damages the flagellum, neutralizes trypanosome motility, and inhibits infection. Infection and Immunity. 81 (11), 4139-4148 (2013).
- Magalhães, L. M. D., Viana, A., Chiari, E., Galvão, L. M. C., Gollob, K. J., Dutra, W. O. Differential Activation of Human Monocytes and Lymphocytes by Distinct Strains of Trypanosoma cruzi. PLoS neglected tropical diseases. 9 (7), e0003816 (2015).
