Summary
I denne protokollen, fluorescently merket T. cruzi ble injisert i gjennomsiktig sebrafisk larver og parasitten motilitet ble observert i vivo bruker lys ark fluorescens mikroskopi.
Abstract
Chagas sykdom er en parasittisk infeksjon forårsaket av Trypanosoma cruzi, som motilitet ikke er bare viktig for lokalisering, men også for mobilnettet bindende og invasjon. Gjeldende dyremodeller for studier av T. cruzi tillate begrenset observasjon av parasitter i vivo, som representerer en utfordring for forståelse parasitten oppførsel under den innledende stadiet av infeksjon hos mennesker. Denne protozoan har en flagellar fase i både vektor- og pattedyr vertene, men det finnes ingen studier som beskriver sin motilitet i vivo. Målet med dette prosjektet var å etablere en live virveldyr sebrafisk modell for å evaluere T. cruzi motilitet i vaskulære systemet. Gjennomsiktig sebrafisk Larvene ble injisert med fluorescently merket trypomastigotes og observert med lys ark fluorescens mikroskopi (LSFM), en noninvasive metode for å visualisere levende organismer med høy optisk oppløsning. Parasitter kan bli visualisert over lengre tid på denne teknikken er relativt lav risiko for photodamage forhold til AC confocal eller epifluorescence mikroskopi. T. cruzi parasitter ble observert i sirkulasjonssystemet av live sebrafisk i ulike størrelser blodkar og eggeplomme. De kan også bli sett knyttet til eggeplomme sac veggen og til atrioventrikulær ventilen til tross for sterke krefter forbundet med hjertet sammentrekninger. LSFM av T. cruzi-inokulerte sebrafisk Larvene er en nyttig metode som kan brukes til å visualisere sirkulerende parasitter og vurdere deres tropism, migrasjon og motilitet i dynamisk miljø av det kardiovaskulære systemet av levende dyr.
Introduction
Chagas sykdom er forårsaket av protozoan parasitten T. cruzi. Ca 6 til 7 millioner mennesker verden over er infisert med T. cruzi. Sykdommen blir overført i Latin-Amerika, men har blitt rapportert i USA, Canada, og mange European samt noen vestlige Stillehavet land, hovedsakelig på grunn av migrering av infiserte individer1. Chagas er hovedsakelig vektor-borne og overføres til mennesker ved kontakt med avføring av hematophagic og Triatominae, kjent som "kissing bugs". Imidlertid kan T. cruzi også overføres via blodoverføringer, vertikal overføring fra mor til barn eller inntak av mat forurenset med parasitter2. Den akutte fasen infeksjonen er hovedsakelig asymptomatisk eller constitutively symptomatisk og varer fra 6 til 8 uker, etter som engasjement av immunsystemet styrer parasitten belastning, men fullstendig eliminere ikke smitte3. De fleste deretter inn en kronisk asymptomatisk fase; men utvikler nesten 30% av pasientene en symptomatisk kronisk fase, der cardiac systemet og sjeldnere i fordøyelseskanal og nervesystem er kompromittert4. Dette scenariet presenterer en utfordring for sykdommer behandling og kontroll siden det finnes ingen vaksiner, og det er bare to effektiv legemidler for Chagas: benznidazole og nifurtimox. Begge behandlingene krever lengre administrasjon og kan ha alvorlige bivirkninger2.
Økt forståelse av virkemåten til T. cruzi er oppførsel i vivo nøkkelen til å bestemme parasittiske migrasjon og mobilnettet vedlegg invasjonen i host; mangel på modeller i vivo begrenser utviklingen av romanen terapeutiske metoder. In vitro studier av T. cruzi har vist at motilitet på trypomastigotes er viktig for binding til verten cellemembraner og påfølgende mobilnettet invasjon5. Energi uttømming i trypomastigotes i co kultur med en utsatt cellen linje har vist seg å redusere mobilnettet invasjonen6. Interessant, i trypanosomatids, har flagellar bevegelse også blitt karakterisert som en evasion mekanisme mot parasitten-spesifikke antistoffer7.
Flagellar motilitet har vært grundig studert i vitro i Trypanosoma brucei, et nært beslektede parasitten som forårsaker Sovesyke8. In vitro studier av motilitet i disse trypanosomes viste at simulering av betingelsene for blod eller kroppsvæsker, inkludert viskositet og tilstedeværelsen av hindringer representant av blodceller, er viktig for parasitten fremover bevegelse9 . Idet av ennå er det ikke mulig å visualisere bevegelsen av parasitter i blodet i vivo.
Sebrafisk Larvene er en effektiv modell å studere vert-patogen interaksjoner i vivo. De er små, rimelige og relativt enkle å heve sammenlignet med andre etablerte virveldyr modeller for Chagas sykdom. Sebrafisk har medfødte og adaptive immunsystem ligner på mennesker, men deres adaptive immunsystemet begynner å utvikle på 4 dager innlegget befruktning (dpf) og er ikke moden for en annen flere uker10. Under tidlig utvikling, når bare makrofager er til stede, er det et stort vindu for å studere parasitten oppførsel uten umiddelbare immun forstyrrelser10. Den største fordelen av å utnytte sebrafisk larver som virveldyr modell for å studere patogen atferd ligger i deres optisk åpenhet, noe som gjør dem mottakelig for mikroskopiske screening og imaging11. I tillegg finnes det flere verktøy for å manipulere fisk genetikk. Casper belastningen er for eksempel en mutant linje av sebrafisk med ingen pigmentering, gjøre dyret helt gjennomsiktig og nyttig for visualisering av organer og sanntidssporing injisert celler12.
En nøkkel begrensning av langsgående observasjon av raskt bevegelige parasitter i live sebrafisk bruker AC confocal eller epifluorescence mikroskopi ligger i umuligheten i bildebehandling på høy oppkjøpet hastigheter og store gjennomtrenging dyp med god bildekvalitet og lav risiko for photodamage. Lys ark fluorescens micsroscopy (LSFM) er en ny bildeenhet teknikken som overvinner disse begrensningene for å tillate disse observasjonene. Med ett mål for å oppdage fluorescens og en andre ortogonale belysning målet som bare lyser opp fokalplanet for gjenkjenning målsettingen, er det mulig å få høy resolution optisk deler som AC confocal mikroskop, men med betydelig redusert photodamage, selv når det gjelder epifluorescence mikroskopi13. LSFM teknikken brukes her kalles enkelt flyet belysning mikroskopi (SPIM), som et tynt ark av lys lyser opp en eneste fly innen sebrafisk larvene.
Målet med denne metoden er å etablere larver sebrafisk som levedyktig ikke-infeksjon modell for å forstå T. cruzi motilitet og relaterte atferd i vivo. Dette vi injisert gjennomsiktig sebrafisk Larvene med fluorescently merket trypomastigotes, Mobiltlf skjemaet ansvarlig for smitte av mennesker, og identifisert bevegelsen av T. cruzi i hjerte sirkulasjon av sebrafisk bruker LSFM.
Protocol
følgende protokoller ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av Los Andes universitet (CICUAL). Biosikkerhet nivå 2 (BSL-2) retningslinjer bør følges strengt for å hindre forurensning med patogen T. cruzi.
Merk: dyr pleie og vedlikehold: Casper sebrafisk, en genetisk modifisert stamme av sebrafisk (Danio rerio) brukes i denne protokollen på grunn av verdifull optisk gjennomsiktigheten i alle utviklingsstadier. Fisk er manipulert med optimale forhold for den arter 14, i en 14 h lys-10 h mørke syklus, på 28 ± 1 ° C, i en pH (7.0-7.4) kontrolleres flere tank resirkulerende vann helsevesenet. Dyr er matet to ganger om dagen med live saltlake reker (Artemia salina) og beriket med oppdrett mat. Alle protokoller ble godkjent av CICUAL på Universidad de los Andes (C.FUA_14-017).
1. forberedelse av Egg vann
- forberede 0,6 finans akvariet salt i omvendt osmose (RO) eller deionisert (DI) vann og legge til 0,01 mg/L methylene blåfarge løsningen.
Merk: Målt ledningsevne bør være 400-500 µS/cm og pH nivå på 7,2-7,9. For å lavere pH, aerate egg vannet for et par timer.
2. Utarbeidelse av Tricaine lager løsning
- forberede 0,4% tricaine lagerløsning smelte 400 mg tricaine (MS-222) i 97,9 mL destillert vann (ddH 2 O). Etter at pulveret er fullstendig oppløst, justere pH 7.0 bruker 2,1 mL 1M Tris (pH 9.0) og kjøle løsningen.
3. Utarbeidelse av 1,0% lavt Smeltepunkt Agarose
- oppløsning lavt Smeltepunkt punkt agarose pulver i egg vann til en siste konsentrasjon på 1,0%. Varm blandingen i mikrobølgeovn eller på en kokeplate med kontinuerlig under omrøring til den agarose løsningen vises homogen.
- Lagre dele på 4 ° C lenger enn en uke.
4. Parring analysen og Embryo samling
- tre dager før injeksjoner definere parring bruker sunn parene av mannlige og kvinnelige fisk i avl tanker. Berikelse med glass kuler og kunstige planter forbedrer gyting. Parring bør settes opp i løpet av ettermiddagen og venstre over natten.
- Neste morgen, samle gytt egg av drenering tanken gjennom en sil og vaske egg med egg vannet. Fjern alle eggene invertere silen og pouring egg vann gjennom silen i en Petriskål. For å holde embryoene sunt, rent vann ved å fjerne alle rusk og død embryo med en overføring plast pipette.
- Overføre embryoene til en inkubator ved en stabil temperatur på 28,5 ° C å tillate utviklingen av embryo ifølge sebrafisk oppsetning standarder 15. Undersøk embryoene to ganger om dagen, og forkaste inviable egg for å holde clutch sunn.
5. Fosteret Dechorionation
Merk: denne prosedyren kreves hvis embryoene ikke er klekket ved injeksjon. I denne prosedyren " larver " er dyr av deres plasmocitara fra 48 h legge befruktning (hpf) videre.
- Dagen for eksperimentet, plasserer Petriskål som inneholder de sunn embryoene under en dissecting stereoscope.
- Ta motsatte ender av plasmocitara med to skarpe tang (Dumont #5), og forsiktig rive og dra åpne plasmocitara. Ca 5-6 Larvene er injisert samtidig, og vanligvis 3-4 er fotografert.
- Fjerner chorions fra vannet ved hjelp av en overføring pipette.
6. Forbereder injeksjon materiale
- forberede 1.0 mm nåler med tynn vegg glass kapillærene og en brønnene avtrekker med følgende innstillinger: 2 lette vekter + 1 tung vekt, 2 mm toppen trekke + 5 mm nedre trekk, 75.9 ° C (trinn 1) + 78.2 ° C ( Trinn 2). Lagre nåler i en Petriskål på en stripe av modell-leire. Ideell nålen bør ha en smal tips, som T. cruzi måle ca 20 x 1-3 µm og vil passere gjennom nålen lett. Lengden på spissen kan variere: et lengre tips er nyttig å nå dypere strukturer, men en kortere tips blir mer rigid gjør injeksjon enklere for brukeren.
Merk: Tips p er avhengig av temperaturen brukes: en høyere temperatur for trinn 2 resulterer i en lengre og finere tips. - Utarbeide en 1,5% agarose løsning i ddH 2 O og hell den i en 10 cm Petriskål. Dekke en dybde på ca 1.0 cm.
- Sted prefabrikerte microinjection mold over agarose og tillate det å stivne.
- Løft prefabrikerte microinjection mold ut og legge egg vann for lagring på 4 ° C. Dette hindrer at agarose uttørking.
- Legg egg vann tricaine lager løsningen på en siste konsentrasjon av 150 mg/L. butikken på 4 ° C.
7. Celle kultur for parasitten vekst
- parasitter vedlikeholdes i en menneskelig astrocytom celle linje (CRL-1718) ved hjelp av metoden beskrevet av Vargas-Zambrano et al. 16
- starte kulturen i menneskeceller i en T25 kultur flasker (arealet = 25 cm 2) på en tetthet av 2 x 10 5 eller 4 x 10 5 celler i 4 mL av RPMI-1640 medium med 10% av fetal kalv serum (FCS), supplert med 2 mM L-glutamin, 4,5 finans glukose, 10 mM HEPES, 1 mM pyruvate og 1% penicillin-streptomycin (kalt " fullføre media "). Inkuber astrocytom kulturer på 37 ° C i en 5% CO 2 miljø.
- Når et monolayer er confluent, koble cellene med 2 mL 0,25% av trypsin-EDTA ved rugende dem i 3 minutter på 37 ° C. visuelt av celler for avdeling, og blokkere trypsin løsningen med 3 mL RPMI-1640 med 10% FCS i en 15 mL tube.
- Sentrifuger celle suspensjon i 5 min på 1350 x g.
- Vask det resulterende mobilnettet pellet i DMEM medium i en 15-mL tube og sentrifuge for 5 min 1350 x g på 22 ° C.
- Telle celler manuelt i en Neubauer kammer og kontroller levedyktighet i en lys mikroskop på 40 X forstørrelse.
- Forsiktig re suspendert mobilnettet pellets i 4 mL komplett og bruke den til å opprette nye cellekulturer med 2 x 10 5 celler per T25 kultur kolbe.
8. T. cruzi kultur og merking
- parasitter er en stamme opprinnelig Hentet fra et infisert menneske og karakterisert som T. cruzi DA belastning (MHOM/CO/01/DA), genotype diskret å skrive enhet (DTU) TcI 16. Etter 3 eller 4 dager dyrking, samle bevegelige parasitter fra menneskelige astrocytom celle kultur nedbryting og sentrifuge for 5 min på 1350 x g. forkaste medium.
Merk: Parasitter i fullstendig medium kan brukes for nytt kultur i en 1:1 ratio med astrocytom celler i T25 kultur kolber. - Forsiktig å suspendere pellet i 10 mL steril 1 x fosfat Buffer Saline (PBS) med 0,1% FCS og sentrifuge for 5 min på 1350 x g.
- Slett nedbryting og å suspendere i 1 mL av PBS. Ta 10 µL for opptelling frittlevende parasitter i en Neubauer kammer.
- Ta resten av nytt suspendert parasitter (990 µL) og tilsett 1 µL av Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE), endelig konsentrasjon 5.0 µM. Incubate for 10 min ved romtemperatur.
Merk: CFSE lager på 5 mM bør være aliquoted og vedlikeholdt på -20 ° C. - Pellets parasitter (1350 x g, 5 min). Rekonstituer parasitten pellet ved å sveipe røret og vaske i 10 mL 1 x PBS-0.1% FCS etterfulgt av en etterfølgende snurr (1350 x g, 5 min).
- Forkaste nedbryting og forsiktig å avbryte merket parasitten pellet 1 X PBS med riktige volumet å få en endelig konsentrasjon på ca 10-20 parasitter/nL injeksjonsvæske.
- Bruker et lite (∼ 10 µL, ca 1 x 10 4 -2 x 10 4 parasitter) av trypomastigotes å vurdere levedyktighet og merking. En invertert fluorescens mikroskop kan brukes til direkte visualisering av parasitter. Den overførte lys modusen, kontroller at parasitter flytte. I fluorescens modus, bruke filteret Fluorescein Isothiocyanate (FITC) for å vurdere parasitten merking.
9. Sprøytebruk sebrafisk Larvene
- parasitten lasting
- ta 10 µL av parasitter fra rørets (100 µL) og laste dem inn i forseglet glass nålene bruker en 10 µL microloader pipette tips.
- Glass nålen inn nålen innehaver av micromanipulator, bruke en magnetisk stå og plasser ved siden av stereoscope.
- Bruke fine tang under stereoscope, kuttet nålen oppretter en stump åpen slutt og måle slipp størrelsen for å få en injeksjon volum 1 nL (tilsvarer perle diameter 0,12-0,13 mm når målt i mineralolje 17). Et lengre tips foretrekkes slik at nålen kan nå strukturer dypt inne fisken uten å skade vevet. I denne protokollen, brukes en stump nål, men en skrå nål kan brukes også.
- Montering
- bedøve larver av 48 hpf, med 150 mg/L tricaine. Kontroller at de ikke reagerer for å røre, men sikre at hjertet slår.
- Plasserer Larvene i microinjection agarose mold i en lateral stilling.
- Plasser nål holder ved stereoscope og justere til micromanipulator slik at spissen av nålen i midten av synsfeltet. Flytte Petriskål forberedt i trinn 6.2 - til 6.4 slik at larver eggeplomme ligger pinne-spissen. Kontrollere tilstanden til Larvene å sikre at hjertet fortsetter juling.
- Angi microinjector verdiene som følger: injeksjon press 9,6 pounds per tomme (psi), trykksatt: 20 psi, 100 ms rekke gating; Periodeverdien 1,9 (tilsvarer 10,9 ms). Volumet av injeksjon bør være mellom 1-3 nL, med ca 10-20 parasitter/nL.
10. Injeksjon av parasitten
- injisere fisken i superior-fremre delen av eggeplomme på ledningskanalen av Cuvier. Dette trinnet skal praktiseres for å sikre dyr overlevelse etter injeksjon. Det tar ca 10 min å injisere 5-6 Larvene er.
- Som en kontroll, injisere 1-2 Larvene med samme kjøretøy volum (1 x PBS).
- Overføre Larven ferske egg vann umiddelbart.
11. LSFM montering av injisert Larvene
- overføre Larven injisert med parasitter til en tom Petriskål og forsiktig fjerne omkringliggende vannet med en plastikk pipe og absorberende papir. Straks legge 100 µL av forvarmet 1,0% lavt Smeltepunkt poeng agarose (se trinn 3 i agarose forberedelse) å dekke Larven. Sikre agarose ikke er over 40 ° C.
- Sett en rett ledning inne en 1.0 mm glass kapillære og bruke den som en stempelholderen for å suge opp Larvene i vertikal posisjon. Pass på at en liten mengde agarose over Larven. Vent til agarose stivner før utsette Larven (dette vil kreve noen minutter). Om nødvendig presse ut overflødig agarose under Larven og kutt den av
- Sett av kapillær i mikroskopet eksempel holderen og presse ut slutten inneholder Larven før det henger gratis fra av kapillær. Prøven kammeret skal fylles med tricaine løsning (150 mg/L) og temperaturen satt på 28 ° C.
- Plasser Larven foran elev av gjenkjenning målet ved hjelp av en XYZ-micromanipulator system. Bruke en rotasjon scene rotasjoner om den loddrette aksen. Plassering av Larven bør gjøres i overført lysmodus å identifisere larver strukturer.
12. LSFM Imaging av injisert parasitter
- endre til fluorescens modus og justere belysning intensitet samt eksponeringstid å redusere photodamage og optimere tid oppløsning. For disse spesielle eksperimenter, vi brukte en strøm av 2.8 3,0 mW for prøven og utsatt hver ramme for 200 ms bruke et kamera med 6.45 µm piksler og ~ 70% quantum effektivitet på oppdagelsen bølgelengdene. Disse innstillingene bør resultere i tilstrekkelig eksponerte bilder på ca 5 rammer/s. Sørg for å bruke en målsetting med høyest mulig numeriske blenderåpning.
- Starter en video oppkjøpet av regionen rundt (ROI). I vårt tilfelle er parasitter observert festet ventiler og fritt flytte rundt hjertet området. Det anbefales å ta en video av et enkelt fly over tid, eller å bruke micromanipulator eller piezo-galvo systemet for å fokusere forskjellige fly mens parasitten flytter.
Merk: Denne fremgangsmåten er nyttig for kort oppkjøpet ganger på opptil 2 timer. For langsiktig oppkjøp, larvene skal monteres ved hjelp av alternative metoder 20.
13. Image bearbeiding og analyse av ervervet Data
Merk: bildebehandling ble utført på en PC med en 2,90 GHz prosessor, 8.00 GB minne og en videocard med 1.00 GB minne.
- Åpne den ervervet dataset i bildebehandlingen valgfrihet. Åpne programvaren FiJi anbefales for LSFM behandling og analyse 21.
- i bildet analyseprogramvare, justere lysstyrken og kontrasten nivåer for å forbedre bildene.
Merk: Ingen faste parametere er brukt i dette tilfellet, men velge den " Auto " alternativet kan være nyttig å få en første forbedring. - Velg Avkastningen.
Merk: For å spore individuelle parasitter, FiJi har både manuell og automatisk sporing plugins tilgjengelig.
14. Gjenopprette fotografert Larvene
- Fjern Larven nøye fra agarose ved hjelp fine tang og et hår loop verktøy. Overføre fisken tilbake til ferske egg vann og sjekk for gjenoppretting etter 15 min. tilbake Larvene til inkubator på 28 ± 0,5 ° C.
- Også fortsette å avlive fotografert Larvene med en overdose av tricaine. Deretter introdusere Larvene i en løsning av natriumhypokloritt (6.15% NaClO) i 5 min å drepe parasitten. Kast etter institusjonen ' s standardprotokoller.
Representative Results
Optimale forhold for injeksjon:
Grupper av sebrafisk Larvene ble injisert på 24, 48, 72, 96 og 120 hpf, på ulike anatomiske steder, og deres overlevelse ble undersøkt hver dag i 5 dager. Etter 5 dager legge injeksjon, embryo injisert på 24 hpf hadde 6,25 prosent (2/32) overlevelse, mens 95% (38/40) av Larvene injisert på 48 hpf overlevde. Som en kontroll, ble Larvene injisert med 1 x PBS som et redskap. Det var ingen forskjeller i overlevelse mellom kjøretøy-injisert og parasite-injisert larvene, som angir ingen parasittiske-avhengige effekter på overlevelse av fisk (p = 0,08). Larvene injisert mellom 72-120 hpf hadde tilsvarende overlevelse til 48 hpf-injisert larver på konstant injeksjon volum. For alle prosedyrer presenteres her, ble 48 hpf larver brukt på grunn av sin brukervennlighet manipulasjon og har utviklet organer og lett penetrable huden uten tydelig skader etter injeksjon.
Larvene injisert på 48 hpf ble injisert i perikard plass, hale muskel, hindbrain ventrikkel, otic vesicle, notochord og duct av Cuvier i plommesekken. Det var ingen forskjeller i overlevelse av Larvene injisert på ulike anatomiske nettsteder. Imidlertid var den raskeste og enkleste regionen å injisere ledningskanalen av Cuvier ligger i den fremre delen av plommesekken (figur 1, film 1). Injeksjoner på dette området tillatt innføringen av høyere volumer med en lavere risiko for skader på viktige strukturer. I tillegg mellom 24-72 hpf er denne regionen et optimalt sted direkte tilgang til utvikle blodkar og hjertet11.
Parasitten visualisering ved hjelp LSFM:
I 8-10 min etter injeksjon av T. cruzi i ledningskanalen av Cuvier, ble parasitter identifisert i sebrafisk Larvene bruker LSFM deres CFSE fluorescerende signal og optisk gjennomsiktigheten til larvene. Etter vaksinasjon, ble parasitter observert enten overholdt vegger rundt sirkulasjonssystemet eller reiser i retning av blodstrøm (figur 2, Figur 3). Når en parasitt fortsatt festet til en hjerte-struktur, som atrioventrikulær ventilen, svinger det med hjertet sammentrekninger, indikerer at molekylære mekanismer for overholdelse av parasitter kan være effektiv i virveldyr modellen (Movie 2, Movie 3 Ekstra film 1). T. cruzi overholdt også murene til larver plommesekken ( figur 2, Movie 2), en struktur som senere blir reabsorbert og bli en del av det sebrafisk tarmen22. Dette kan være lik hva skjer under den kroniske sykdommen fasen i infiserte mennesker, hvor parasitter finnes i cardiomyocytes og i fordøyelsessystemet nervesystemet23,24. Ikke knyttet, drev parasitter gjennom blodstrømmen i samme retning som erytrocytter ( Figur 3, Movie 4). Parasitter kan være observert i ulike størrelser fartøy av fisk, men var mer rikelig i perikard plass og tilstøtende eggeplomme regionen blodstrøm ( figur 2, Figur 3, ekstra filmen 2).
10 min post injeksjon var det vanskeligere å oppdage enkelt former av parasitten på grunn av distribusjonen er blodkar, og en manglende evne til å raskt skjermen ulike anatomiske steder av fisk på grunn av en begrenset synsfelt av LSFM (på 40 X forstørrelse ). Etter 24 h legge injeksjon (hpi), CFSE signalet begynner å samle i regionen nær utvikle tarmen (supplerende figur 1).
Figur 1: Optimal injeksjonsstedet. (A) bilde av Larven 48 hpf viser optimale injeksjonsstedet på ledningskanalen av Cuvier (gul pil) ved hjelp av en vanlig stereoscope. (B) Magnified Vis-boksen i en viser ledningskanalen av Cuvier (gul pil). Skala bar = 200 µm (A), 50 µm (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: LSFM bilder av en statisk parasitten i en 48 hpf Larven. T. cruzi parasitten (gul pil) er fortsatt adhered til veggene av plommesekken, gjennom time-lapse sekvensen (7.2 s, 17.2 s og 27,2 s), ca ~ 15 min etter parasitten injeksjon. Ingen endring i plasseringen av parasitten er observert i et oppkjøp periode minst 30 s. en, Atrium. v, ventrikkel. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Bane av en parasitt reiser i perikard plass bruker LSFM. T. cruzi parasitten kan spores mens drivende i perikard plass (PS), etter retning av blodstrøm (spor vises i rødt) om ~ 15 min etter parasitten injeksjon. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1: blod sirkulasjon dalen av plommen i en larve 48 hpf. Film av larva 48 hpf viser blod sirkulasjon dalen eller duct av Cuvier ved hjelp av en vanlig stereoscope. Regioner er fokusert under videoen å vise røde blodlegemer sirkulerer gjennom røret. Gul pil viser optimale innsprøytingen sted. Filmen ble spilt inn ca 10-15 min etter parasitten injeksjon. Klikk her for å laste ned videoen.
Film 2: T. cruzi parasitter festet til veggene i plommesekken. LSFM film av en larve 48 hpf viser at T. cruzi parasitter forblir adhered å plommesekken ca 10-15 min etter parasitten injeksjon. Ingen endring i plasseringen av parasitten ble observert i en oppkjøpet periode minst 30 s. en, Atrium. v, ventrikkel. Klikk her for å laste ned videoen.
Filmen 3: T. cruzi parasitter festet til veggene av hjertet. LSFM film av larva 48 hpf vises som T. cruzi parasitter remain overholdt hjerte veggen, til tross for sterk heart riene ca 10-15 min etter parasitten injeksjon. Erytrocytter kan observeres som svarte avrundet skygger. Klikk her for å laste ned videoen.
Movie 4: parasitter flytte inn perikard. LSFM film av en larve 48 hpf viser T. cruzi parasitter drivende i perikard plass. To parasitter kan spores på ulike tidspunkt (ID 1, rød sirkel og ID 2 i gul sirkel), etter en tilsvarende bane. Filmen ble spilt inn ca 10-15 min etter parasitten injeksjon. Klikk her for å laste ned videoen.
Ekstra figur 1: opphopning av CFSE fluorescerende signalet i eggeplomme. Stereoscope bilder av en wildtype Larven injisert på 48 hpf i ledningskanalen av Cuvier. CFSE fluorescerende signalet akkumuleres stadig i eggeplomme, etter to dager legge injeksjon (48 hpi). Skala bar = 500 µm. Klikk her for å laste ned figuren.
Ekstra film 1: parasitter knyttet til vegger og ventiler i sirkulasjonssystemet. Stereoscope tid serie bilder av en vill type Larven injisert på 48 hpf. Bildene er tatt på 0,2 s intervaller fange T. cruzi parasitter i synkronisering med Hjertemuskel sammentrekninger på atrioventrikulær ventilen. Filmen ble spilt inn ca 30 min etter parasitten injeksjon. Klikk her for å laste ned videoen.
Ekstra Movie 2: flytte og overholdt parasitter i periventricular plass og eggeplomme. LSFM film av en larve 48 hpf viser T. cruzi parasitter drivende eller overholdt perikard plassen eller eggeplomme. Overføres lett utsikt ble observert i de første 5 s. Visningen fluorescens ble observert fra 5.2-25.8 s. Filmen ble spilt inn ca 10-15 min etter parasitten injeksjon. Klikk her for å laste ned videoen.
Discussion
Denne studien fremhever fordelene ved sebrafisk som en dyr modell for å studere patogen atferd i vivo. Spesielt denne studien foreslår en metode for å visualisere patogen T. cruzi i sitt naturlige miljø: hematic sirkulasjon. Miljøet på den sirkulasjons microenvironment i fisk sammenlignes for pattedyr, og trypanosomatids har utviklet seg mekanismer for reise, gå utenom immunsystemet og feste til celler for infeksjon i det miljø25. Denne protokollen gir en beskrivelse av en optimal prosedyren kultur T. cruzi i human celle linje og påfølgende isolering av flagellar former for fluorescerende merking. Det viser deretter de aktuelle innstillingene for vellykket injeksjon av parasitter i gjennomsiktig sebrafisk for senere montering og visualisering ved hjelp LSFM. Til slutt gir denne protokollen forslag for effektive i vivo bildebehandling parasitten plassering og bevegelse i omløp bruker LSFM.
Flagell av trypanosomes framgår bakre regionen, strømmer fra celle og henger gratis på den fremre delen av organismen26. T. cruzi driver selv ved å vinke flagell foran kroppen, som betraktes parasittens hele kroppen. Flagellar bevegelse er ikke bare uunnværlig for parasitten motilitet, som i tilfelle av T. brucei27 (den utløsende agenten for Sovesyke), men det er også brukt for mobilnettet infeksjon, som har blitt vist i T. cruzi5 ,28. Selv om sebrafisk ikke naturlig vert for T. cruzi, kan det parasite motilitet studeres i et utviklingsland hjerte sirkulasjonssystem ved hjelp av protokoller som beskrevet her. I tillegg finnes det trypanosomes arter som infiserer Karpefisker, klasse sebrafisk, som T. carassii og T. borreli25. Disse parasitten artene kan brukes til å studere i sanntid bevegelser og vedlegg mekanismer for disse trypanosomatids; slike studier kan låne innsikt i pattedyr celle infeksjon prosessen.
I denne studien injisert motile T. cruzi parasitter ble observert reiser gjennom hjerte sirkulasjon av inokulerte fisk, flytte sammen med ugjennomsiktig erytrocytter og følge strukturer i kardiovaskulære systemet veggene. Vi brukte en hjemme-bygget LSFM med en 10 X akromatisk lenge arbeidsavstand luft målsetting (17,6 mm) for belysning arm med en numerisk blenderåpning på 0,25. En 40 X apochromatic vann nedsenking målet med en numerisk blenderåpning på 0.8 og en arbeidsavstand på 3,5 ble brukt for påvisning armen. Gjenkjenning målet var oppslukt i prøven kammeret, mens belysning målet var utenfor kammeret. En port i kammeret forseglet med en dekkglassvæske og optisk lim tillatt for belysning strålen inn i kammeret, som avbildet i Lorenzo et al. 18 for belysning, vi brukte en 50 mW DPSS laser på 488 nm hvis makt var modulert av et Acousto optisk Tunable Filter. Gjenkjenning banen brukes filtre kompatibel med grønn fluorescerende Protein (GFP) eller FITC. Lys ark mikroskop kapillær eksempel holderen (helst med automatisk rotasjon) og temperaturkontroll av prøve chamber bør være egnet for dette programmet. Mikroskopet skal være justert og kalibrert i henhold til produsentens instruksjoner eller brukerens laboratorium standardprotokoller før oppkjøpet, om nødvendig. I denne protokollen kontrollert vi mikroskopet bruker SPIM programvare19.
Det er viktig å merke seg at i sirkulasjon av sebrafisk, larvene parasittiske vedlegg er effektiv. I kardinal blodåre var parasitter knyttet til opptil flere minutter; i hjertet holdt de på ventiler og vegger, oscillerende med hjertet sammentrekninger. Videre studier fortsatt for å belyse om T. cruzi samhandler med de flytende erytrocyttene som Drive i retning av blodstrøm. Tidligere i vitro studier har vist at tilstedeværelsen av solid strukturer (dvs., blod celler) eller økt viskositet av væsken som etterligner blod i vitro, har en betydelig effekt på motilitet og hastighet av parasitten 9.
Det er mange spørsmål i løpet av infeksjon av T. cruzi hos mennesker etter amastigotes rømme phagocytic cellene: først infiserte cellen type29. For eksempel, hvordan de kommer til deres mål organer? Hva er mekanismene for tropism til foretrukket organer, som hjerte, fordøyelseskanal og sentralnervesystemet systemer? Interessant, i denne studien var parasitter opprinnelig avbildet i hjertet fordi det var den høyeste tettheten av parasitter. Men CFSE signalet senere akkumulert i utviklingsland tarmen av 7 dager innlegget injeksjon. Selv om anatomi av fisk og pattedyr er forskjellige, viser resultatene av denne studien en form for tropism, som det ble observert at parasitter utstilt tropism mot kjente foretrukne målet organer til tross organismebiologi forskjeller. En betydelig begrensning av denne studien gjelder temperaturen brukes i forsøkene. Sebrafisk Larvene bør holdes rundt 28 °C i løpet av hele fremgangsmåten. Selv om denne temperaturen kan være lik vektor verten (insekter og kan Triatominae), er det ganske forskjellig fra den hjertelig-blod pattedyr som utgjør de endelige vertene (rundt 37 ° C). T. cruzi er kjent for å ha flagellar levende skjemaer i begge verter; Det er imidlertid viktig å huske at denne faktoren kan ha en effekt i atferden til dyr i vivo.
Selv om fish´s adaptive immunsystemet ikke er moden til 4 uker post befruktning, er det medfødte immunsystemet tidlig i utviklingen10. Så tidlig som 48 eller 96 hpf, ble phagocytic celler observert å ha omsluttet merket trypanosomes (data ikke vist). Dette begrenser vinduet tid for visualisering av parasitten. Men hvis en studie var å fokusere på å vurdere fish´s immunforsvaret, kan injeksjon på senere stadier bli anbefalt. Også kan injeksjon av parasitter i transgene fisk linjer med merket makrofager eller andre celler i immunsystemet være nyttig i å studere parasitten vedlegg og mulig endocytose mekanismer. Det er viktig å merke seg at hvis parasitter er merket med CFSE, transgene celle etiketter skal ikke GFP, og en markør i den gule / røde enden av spekteret er nødvendig.
For å vurdere detaljert bevegelsesretning parasitt, kan det være nyttig å følge deres bane i 3 dimensjoner (3D). For 3D-visualisering og gjenoppbygging av prosessen er Høyhastighetssystem nødvendig. Med utstyr som brukes i denne protokollen, er det bare mulig å visualisere parasitter på ett plan. I dette tilfellet prioritert vi opprettholde fokalplanet stabilitet i parasitten bevegelse og spille inn sin bane på ett plan.
Metodene som er foreslått her baner vei å undersøke nærmere parasitten atferd i hjerte sirkulasjon. I sammendraget er viktige trinnene i imaging live fluorescerende parasitter i sebrafisk Larvene:(i) bruk av tidlig skravert embryo (24-48 hpf) eller larver eller dyr mellom 72-96 hpf med ingen pigmentering slik at de er gjennomsiktig og lett å injisere; (ii) bilde Larvene så snart som mulig etter injeksjon å unngå parasitten godkjennes av phagocytic celler. (iii) fokusere LSFM på stedet av interesse (f.eks, perikard regionen) og holde fokus. Denne romanen prosedyren kan visualisering av trypomastigotes i et miljø sammenlignes med sin infeksjon naturlig nisje, gir for første gang muligheten til å studere T. cruzi i en levende organisme.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Convocatoria Interfacultades fra Vicerrectoría de Investigaciones de la Universidad de los Andes, og USAID forskning og innovasjon kameratskap programmet. Vi takker Juan Rafael Buitrago og Yeferzon Ardila for fisk vedlikehold og assistanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-10 μL Micropipette | Fisherbrand | 21-377-815 | |
| Agarose RA | Amresco | N605 | Regular |
| Agarose SFR | Amresco | J234 | Low Melting point |
| Aquarium salt | Instant ocean | SS15-10 | |
| Cell Count chamber | Boeco | Neubauer | |
| Cell culture flasks | Corning | 430639 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| CFSE | ThermoFisher | C34554 | |
| Detection objective | Nikon 40x 0.8NA | 40x CFI APO NIR | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Dumont #5 fine forceps | World precision Instruments | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
| Filter | Chroma | ET-525/50M | |
| Glass capillaries for embryo mounting | Vitrez Medical | 160215 | |
| Glass capillaries for pulling needles | World precision instruments | TW100-4 | |
| Glucose | Gibco | A2494001 | |
| HEPES | Gibco | 156300-80 | |
| Incubator | Thermo Corporation | Revco | |
| Larval microinjection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| Laser | Crystalaser | DL488-050 | |
| L-glutamine | Gibco | 250300-81 | |
| Methylene blue | Albor Químicos | 12223 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| Micromanipulator system | Sutter Instrument | MP-200 | For LSFM |
| Micropipette puller device | Narishige | PC-10 | |
| Microscope | Olympus | CX31 | |
| Microscope (inverted) | Olympus | CKX41 | |
| Multipurpose microscope | Nikon | AZ100M | |
| Neubauer counting chamber | Boeco Germany | ||
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-163 | |
| Petri dish 94x16 | Greiner bio-one | 633181 | |
| Plastic pasteur pipette | Fisherbrand | 11577722 | |
| Rotation stage | Newport | CONEX-PR50CC | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R4130 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Stereoscope | Nikon | C-LEDS | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | |
| TRIS | Amresco | M151 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | R-001-100 | |
| Tubes 15 ml | Corning | 05-527-90 |
References
- WHO. Chagas disease (American trypanosomiasis). , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/ (2017).
- Bern, C. Chagas's Disease. New England Journal of Medicine. 373 (5), 456-466 (2015).
- Sosa Estani, S., Segura, E. L., Ruiz, A. M., Velazquez, E., Porcel, B. M., Yampotis, C. Efficacy of chemotherapy with benznidazole in children in the indeterminate phase of Chagas’ disease. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 59 (4), 526-529 (1998).
- Rosas, F., Roa, N., Cucunuba, Z. M., Cuellar, A., Gonzalez, J. M., Puerta, J. C. Chagasic Cardiomyopathy. Cardiomyopathies - From Basic Research to Clinical Management. , (2012).
- Finkelsztein, E. J., et al. Altering the motility of Trypanosoma cruzi with rabbit polyclonal anti-peptide antibodies reduces infection to susceptible mammalian cells. Experimental Parasitology. 150, 36-43 (2015).
- Martins, R. M., Covarrubias, C., Rojas, R. G., Silber, A. M., Yoshida, N. Use of L-Proline and ATP Production by Trypanosoma cruzi Metacyclic Forms as Requirements for Host Cell Invasion. Infection and Immunity. 77 (7), 3023-3032 (2009).
- Engstler, M., et al. Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes. Cell. 131 (3), 505-515 (2007).
- Uppaluri, S., et al. Impact of Microscopic Motility on the Swimming Behavior of Parasites: Straighter Trypanosomes are More Directional. PLoS Computational Biology. 7 (6), e1002058 (2011).
- Heddergott, N., et al. Trypanosome Motion Represents an Adaptation to the Crowded Environment of the Vertebrate Bloodstream. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003023 (2012).
- Gratacap, R. L., Wheeler, R. T. Utilization of zebrafish for intravital study of eukaryotic pathogen–host interactions. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 108-115 (2014).
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-Pathogen Interactions Made Transparent with the Zebrafish Model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Huisken, J. Slicing embryos gently with laser light sheets. BioEssays. 34 (5), 406-411 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene. http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Vargas-Zambrano, J. C., Lasso, P., Cuellar, A., Puerta, C. J., González, J. M. A human astrocytoma cell line is highly susceptible to infection with Trypanosoma cruzi. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 108 (2), 212-219 (2013).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (25), e1115-e1115 (2009).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6, 22 (2011).
- Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using μManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), e10 (2014).
- Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (84), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ng, A. N. Y., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmental Biology. 286 (1), 114-135 (2005).
- Higuchi, M. D. L., et al. Correlation between Trypanosoma cruzi parasitism and myocardial inflammatory infiltrate in human chronic chagasic myocarditis: Light microscopy and immunohistochemical findings. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 2 (2), 101-106 (1993).
- Vago, A. R., Silva, D. M., Adad, S. J., Correa-Oliveira, R., d'Avila Reis, D. Chronic Chagas disease: presence of parasite DNA in the oesophagus of patients without megaoesophagus. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (3), 308-309 (2003).
- Wiegertjes, G. F., Forlenza, M., Joerink, M., Scharsack, J. P. Parasite infections revisited. Developmental & Comparative Immunology. 29 (9), 749-758 (2005).
- De Souza, W. Basic cell biology of Trypanosoma cruzi. Current Pharmaceutical Design. 8 (4), 269-285 (2002).
- Langousis, G., Hill, K. L. Motility and more: the flagellum of Trypanosoma brucei. Nature Reviews. Microbiology. 12 (7), 505-518 (2014).
- Johnson, C. A., et al. Cellular response to Trypanosoma cruzi infection induces secretion of defensin α-1, which damages the flagellum, neutralizes trypanosome motility, and inhibits infection. Infection and Immunity. 81 (11), 4139-4148 (2013).
- Magalhães, L. M. D., Viana, A., Chiari, E., Galvão, L. M. C., Gollob, K. J., Dutra, W. O. Differential Activation of Human Monocytes and Lymphocytes by Distinct Strains of Trypanosoma cruzi. PLoS neglected tropical diseases. 9 (7), e0003816 (2015).
