Summary
本文概述了一种用于检测哺乳动物细胞中的一种或多种等离子和/或胞内膜蛋白的方法。在这里, 我们讨论的好处和考虑使用这种方法的可视化和量化的细胞蛋白。
Abstract
荧光显微镜和细胞生物学的进展是密切相关的, 增强的能力, 可视化细胞事件往往导致戏剧性的飞跃, 我们的理解细胞的功能。超分辨率显微镜的发展和可用性大大扩展了光学分辨率的极限, 从 ~ 250-20 nm。生物学家不再局限于在衍射有限区域内描述分子间的相互作用, 相反, 现在有可能对单个分子的动态相互作用进行可视化定位。在这里, 我们概述了一个协议的可视化和量化的细胞蛋白的地面状态损耗显微镜的固定细胞成像。我们提供的例子来自两种不同的膜蛋白, 一个元素的内质网 translocon, sec61β, 和一个等离子膜局部电压门控 L 型 ca2 +通道 (caV1.2)。讨论了具体的显微镜参数、固定方法、光开关缓冲配方、图像处理的缺陷和挑战。
Introduction
细胞信号反应转换内部和外部环境, 以启动细胞的反应。它们调节人类生理学的各个方面, 作为激素和神经递质释放、心跳、视力、受精和认知功能的基础。这些信号级联的中断可能会有严重的后果, 包括癌症, 帕金森病和阿尔茨海默氏症等病理生理条件。几十年来, 生物学和医学研究人员成功地使用了荧光蛋白、探针和生物传感器, 并以荧光显微镜作为主要工具, 了解这些细胞的精确时空组织信号.
光学技术的优势, 如荧光, 共焦, 或全内反射荧光 (TIRF) 显微镜是他们的灵敏度, 速度和与活细胞成像的兼容性, 而主要的限制是他们的衍射有限的分辨率, 意味着结构或蛋白质复合物小于 200-250 nm 不能解决。随着确定性超分辨率的理论和实际发展 (例如, 受激辐射损耗显微镜 (STED1), 结构化照明显微镜 (SIM2) 或随机超分辨率 (例如, 光定位显微镜 (PALM3), 或基态损耗 (物料供应量4,5), 在荧光显微镜中的横向和轴向分辨率已经超出了衍射屏障, 以数十纳米。因此, 调查人员现在有无与伦比的能力, 以可视化和理解如何蛋白质动力学和组织转化为功能的近分子水平。
基态损耗显微镜后, 个别分子返回 (GSDIM), 或简单的政府物料供应, 因为它是已知的, 绕过衍射限制, 减少同时发射荧光4,5的数量。高能激光用于激发荧光标签的样品, 用光子轰击电子, 并增加他们将经受 "自旋翻转" 的几率, 并从激发态4进入三重或 "暗态"。这实际上耗尽了基态, 因此得名 "基态损耗"。在三重状态, 荧光不发射光子和样品出现变暗。然而, 这些荧光随机返回到基态, 并可以通过几个光子发射 excited-to-ground 状态转换, 然后返回到三重状态。在任何给定的时间荧光发射, 从单个荧光发出的光子爆发在空间上和世俗上不同于邻近的荧光。光子的爆发可以与高斯函数相匹配, 计算的质心与荧光的位置相对应, 它的定位精度取决于透镜的数值孔径 (NA), 光的波长用于激发和关键的是, 每荧光发出的光子数。物料供应处的一个限制是, 由于只有一个荧光的子集在任何时候积极发出, 数千张图像必须收集超过几分钟, 以建立一个完整的本地化地图。较长的采集时间与高激光功率要求相结合, 意味着物料供应处更适合于固定而非活体样品。
本文介绍了用于膜和内质网 (ER) 驻留蛋白的超分辨率显微成像固定样品的制备 (如需消耗品和试剂清单, 请参阅材料表)。如何方便地对此协议进行调整, 以量化心肌细胞肌中 L 型电压门控 ca2 +通道 (cav1.2) 的大小和聚类, 或用于可视化 ER 的细胞分布,被证明。了解这些单元格组件的分布和组织对于了解许多 Ca2个相关的信号级联的启动、翻译和最终功能至关重要。例如, cav1.2 通道对于激发-收缩耦合至关重要, 而受体介导的 ca2 +则可能是哺乳动物细胞中最普遍的信号级联。
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Protocol
1. 洗涤玻璃片
- 在样品处理前的前一天, 清洁 #1. 5 玻璃片由 sonicating 在一个 1 M 解决方案的 KOH 为1小时。这将消除片上可能存在的任何荧光污染物.
- 用去水彻底冲洗片中的 KOH.
- 一旦在 KOH 中清洗, 将片储存在70% 乙醇中直到准备使用.
2。镀膜玻璃片
注意: 本节中的步骤应在细胞培养罩中进行, 以防止污染.
- 使用镊子将单个片从70% 乙醇溶液中移除, 然后迅速火焰除去多余的。把片放进一个6井的盘子里。如果燃烧在文化敞篷不是一个选择, 考虑灭菌片在漂洗以后与去水并且/或者绝育在紫外光之下在文化敞篷为至少 30 min.
- 为了帮助细胞黏附, 在室温下用无菌的0.01% 聚 l-赖氨酸涂层片1小时.
- 吸聚 l-赖氨酸, 用无菌磷酸缓冲盐 (PBS) 冲洗片。空气干燥, 在冰箱里过夜.
- 第二天早上, 从冰箱中取出片, 并添加300和 #181; 层粘连蛋白, 浓度为50和 #181; 克/毫升, 在室温下至少30分钟。确保将层粘连蛋白直接放在片上.
注意: 这种层粘连蛋白的步骤对于 COS-7 细胞或 HEK293 细胞是不必要的, 但对于心室肌细胞是必需的。其他主要细胞, 如血管平滑肌细胞或神经元可能会更好地坚持胶原蛋白或纤维连接蛋白涂层片.
3。制备单元格
- 培养单元格
- 在10毫升 Dulbecco 和 #39 的 10 cm 培养基上生长 COS-7 细胞 (或优选的细胞系); 经改良的鹰培养基 (DMEM) 培养基, 辅以10% 胎牛血清 (FBS) 和1%青霉素/链霉素 (PS) 溶液。在37和 #176 的细胞培养孵化器中培养细胞; C 和 5% CO 2 .
- 当细胞达到 90% 70-100, 从 10 cm 盘中吸取 DMEM 培养基, 并加入5毫升0.05% 胰蛋白酶 EGTA 溶液。一旦细胞开始旋转和分离, 立即中和的胰蛋白酶与补充 DMEM。
- 使用5毫升血清吸管从盘中取出细胞。将培养基移到盘底上数次, 以除去所有保持附着的细胞, 并在培养基中 homogenously 分布细胞.
- 将细胞印在 35 mm 培养基上, 实现 70% 70-100 转染。用新鲜的 DMEM/FBS/PS 溶液使碟中的培养基体积达2毫升.
- 染 COS-7 细胞与所需的质粒 DNA 结构 ( 如 , sec61 和 #946;-mCherry 质粒), 使用适当的转染试剂, 并根据制造商和 #39; s 说明.
注意: 根据质粒和/或所使用的转染试剂, 蛋白质的表达可能需要24-48 小时.
- 成年小鼠心室肌细胞
- 使用成熟的共生灌注法分离成年小鼠心室肌细胞
- 6 。在中 199 (M199) 中, 再用 2.5% FBS 和 1% PS, 重新暂停产生的心肌细胞颗粒.
4。电镀单元格
- 转染 COS-7 单元
- 从 35 mm 盘中抽出2毫升 DMEM/FBS/PS 解决方案, 并添加1毫升 Ca 2 + 免费 PBS。将该盘从盘中的2分钟内的收获细胞中, 先将钙的 2 + 免费 PBS 吸出, 再加入1毫升的0.05% 胰蛋白酶-EGTA 溶液。
- 一旦细胞开始旋转和分离, 立即中和胰蛋白酶与1毫升补充 DMEM。在2毫升胰蛋白酶-EGTA-DMEM 悬浮液中, 轻轻地上下吸管多次, 以确保转染细胞均匀分布.
- 在适当的密度下将 COS-7 细胞转染到多聚 l-赖氨酸涂层片上, 使单个电池可以可视化, 并以 DMEM/FBS/PS ( 如 、添加90和 #181 的大小来填充2毫升的碟形; L 细胞悬浮到片然后添加1910和 #181; L 补充 DMEM, 旋流盘均匀分布细胞).
注意: 细胞不需要计数, 但每道菜要添加的细胞体积会因细胞的70-100 而变化. - 在一夜之间将镀膜细胞返回细胞培养箱, 以使细胞黏附并恢复.
- 从 35 mm 盘中抽出2毫升 DMEM/FBS/PS 解决方案, 并添加1毫升 Ca 2 + 免费 PBS。将该盘从盘中的2分钟内的收获细胞中, 先将钙的 2 + 免费 PBS 吸出, 再加入1毫升的0.05% 胰蛋白酶-EGTA 溶液。
- 成年的小鼠心室肌细胞
- 将层粘连蛋白和平板肌细胞直接吸到涂覆的片上, 以适当的密度使单个细胞可视化。这将取决于从隔离中获得的活细胞的密度.
- 平衡细胞悬浮在一个圆顶上的片和地方的细胞培养孵化器在37和 #176; C 和 5% CO 2 为〜45分钟, 以允许粘连.
5。细胞固定
- 从孵化箱中取出单元格并小心地吸入培养基.
- 用 PBS 冲洗粘附的单元格一次.
- 使用固定在单个应用程序和抗体上的定影液修复细胞.
注: 在选择固定剂时要牢记的一个重要标准是保存样品的细胞结构, 同时也要确保在抗原中没有构象的变化。为本议定书的目的固定与3% 甲醛/0.1% 戊二醛 (粉煤灰/GA) 和固定100% 甲醇讨论.
- Sec61 和 #946 的转染 COS-7 细胞的灰化/ga 固定;-mCherry
- 混合 1.9 ml 16% 和20和 #181; L 50% ga 并添加 PBS 以使最后的容量10毫升.
- 将1毫升新鲜的粉煤灰/GA 溶液添加到每道细胞中, 并在室温下固定10分钟.
- 在 PBS 中吸出煤灰/GA 并冲洗细胞3次.
- 用 PBS 清洗黏附的细胞, 每5次5分钟。将旋转的所有洗涤步骤设置为中等速度 ( 例如 , 每分钟50转).
- 接下来, 在去水中, 用1毫升新鲜制备的0.1% 质量/体积氢化钠减少游离醛基团.
- 冲洗细胞两次, 然后清洗3次, 每5分钟在 PBS, 以消除所有的痕迹硼氢化钠和酒精, 它产生时, 与自由醛反应.
- 成年小鼠心室肌细胞的甲醇固定
- 小心地在细胞中加入1毫升的 ice-cold 100% 甲醇。倾斜的6井板和吸管的甲醇对侧壁, 而不是直接到片。然后倾斜6井板回水平, 使甲醇均匀洗涤在细胞上。在-20 和 #176 固定5分钟; C.
- 用 PBS 吸出固定剂和冲洗细胞3次.
- 用 PBS 清洗黏附的细胞, 旋转5次, 每次5分钟.
6。阻止非特定绑定
- 阻塞解决方案中室温下的 1 h 块 (请参见 材料表 ).
注: 各种溶液可用于阻断非特异性抗体结合, 包括3% 牛血清白蛋白 (BSA) 或与原抗体相同物种的免疫血清.
7。检测
- 主抗体孵化
- 提取阻塞解决方案。请勿清洗或冲洗.
- 准备主要抗体溶液如下 (参见步骤 7.1.5): 将主要抗体稀释到10和 #181 的浓度; 抗体培养液中的 g/毫升 (或制造商和 #39; s 建议浓度) (请参阅 材料表).平衡这个小体积的片, 并仔细设置一个正方形的塑料石蜡薄膜在上面。这有助于传播小体积的抗体在片和防蒸发.
- 将6个井板放在湿度室中, 然后在冰箱中过夜.
- 在早上, 从湿度室中取出细胞, 小心地从片的表面去除石蜡薄膜, 并吸取主抗体溶液.
- 用 PBS 冲洗3次, 然后用洗涤块解决方案洗涤5次5分钟 (请参阅 旋转体上的材料表 ).
注: 本协议使用以下抗体, 抗 RFP 小鼠单克隆抗体的图像显示在 图 2 和兔多克隆 FP1 7 抗 Ca V 1.2 抗体 (来自 Prof. 的礼物在 图 3 中显示的图像。关于湿气室, 一个塑料饭盒与一个紧合的盖子, 内衬湿纸巾工作。PBS 可用于洗涤步骤, 但该协议提高了标签的特异性, 并通过使用稀释的堵塞溶液清洗步骤减少了背景.
- 吸入洗涤液并添加200和 #181; 共轭二次抗体溶液稀释 1:1, 000 抗体培养液。在片 (参见步骤 7.1.2) 的顶部放置一正方形石蜡膜.
- 在室温下在黑暗中孵育1小时.
- 吸入二次抗体, 用 PBS 冲洗3次.
- 用稀释的堵塞溶液冲洗细胞5次, 在摇杆上5分钟.
- 以 PBS 为5分钟清洗3次.
注: 本协议描述了使用 anti-mouse alexa 647 共轭继发抗体和兔 alexa 647 共轭继发抗体的 图 2 和 图 3 , 分别。对于单蛋白质标签, Alexa 647 是首选荧光由于其高光子计数 (提高定位精度) 和低占空比 (改善时间分辨率) 8 。许多其他荧光共轭的二次抗体选择, 如阿托或 Cy 染料, 是可利用的。请参阅 et al. 8 和 Chozinski et al. 9 用于综合评估几种荧光/染料对超分辨率成像的适用性.
8。后固定 (可选步骤)
- 在 10 mL PBS 中稀释50和 #181; L 50% ga 以获得 0.25% ga 解决方案。在室温下, 在本解决方案中, 在10分钟后修复细胞.
- 用 PBS 洗涤3次, 在一个旋转的5分钟.
9。存储示例
- 将样品存储在冰箱 (4 和 #176; C) 中, 在铝箔衬里的容器中保存, 直到成像.
- 用于长期储存样品 (最多几个月), 在 PBS 中储存含有3毫米的叠氮化钠, 以防止细菌生长.
10。超分辨率成像 Photoswitching 缓冲准备
- 准备氧清除和 #39; GLOX 和 #39; 解决方法如下:
- 在1.5 毫升离心管, 添加12.5 和 #181; L 过氧化氢酶 (34 毫克/毫升), 3.5 毫克葡萄糖氧化酶, 0.5 和 #181; l 1 米 (pH = 8) 到49.5 和 #181; l PBS.
- 漩涡简要地溶化组分入解答然后离心在 20800 x g 为3分钟在4和 #176; C.
注: 氧清除解决方案, 如 GLOX, 已被发现反对漂白。GLOX 应该放在冰箱里一周。每次使用时重复离心机步骤.
- 准备 photoswitching 诱导的硫醇解决方案, 如下所示:
- 准备100毫米和 #946;-mercaptoethylamine (多边环境协定) 解决方案在 PBS 和修改 ph 值8或交替使用和 #946;-基 (#946; 我)。存储 aliquoted 的解决方案在冰箱 (-20 和 #176; C) 长达1周.
- 在成像之前, 通过将硫醇和氧清除组件一起添加到冰上准备最终的交换缓冲器。500和 #181; 我 GLOX 添加5和 #181; l GLOX 到50和 #181; l (ph 值 = 8) 和445和 #181; l 盐水缓冲 (2.5 毫升 1 M 三 ph = 8, 29.22 毫克氯化钠 (10 毫米最后的集中), 5 g 葡萄糖和47.5 毫升水)。另外, 对于 GLOX #946; 我的解决方案添加5和 #181; 我 GLOX 到5和 #181; l 和 #946; 我和490和 #181; l 盐水缓冲.
- 将解决方案保留在冰上, 并根据需要在玻璃凹陷幻灯片上安装样品.
注: 含硫醇的溶液, 如和 #946; 我或多边环境诱导 photoswitching cyanine-based 染料, 如 alexa 647 10 或 xanthene-based 染料, 如 alexa 568。和 #946; 我的结果与 alexa 的 647, 而多边环境协定是首选的 alexa 568 或当2的蛋白质是用双重标记的方法, 同时利用 alexa 568 和647。由于酸化, 缓冲液在一段时间内会恶化。这将导致样品的平均光子计数的减少。为防止这种情况, 建议在2-3 小时后进行新鲜的 photoswitching 缓冲, 或者如果观察到平均光子计数的下降或诱导 photoswitching 的时间的显著延长。最近的一篇文章描述了一个新的图像缓冲牛 EA, 我们还没有测试, 但据报道, 显示稳定的 pH 值数天, 并表现优于 GLOX 多色成像应用 11 .
- 将解决方案保留在冰上, 并根据需要在玻璃凹陷幻灯片上安装样品.
11。安装示例
- 在抑郁症幻灯片上使用带有标记的单元格 (参见1-9 节) 安装片, 用100和 #181; L 成像缓冲区.
- 用硅胶胶水封住片的边缘, 以防止成像缓冲器的快速氧化。等待几分钟, 直到硅胶胶水已经完全治愈, 否则片将漂移时, 成像.
注: 如果与 #946 接触, 硅胶胶水不会硬化; 我。一定要擦干片的边缘, 以防止硅胶胶水接触成像缓冲器.
12。图像获取
- 请参见表 1, 以获取 图 2 和 图 3 中使用的图像参数列表。
- 开始时, 根据所选的荧光选择适当的激光来照亮样品。本协议中使用的 SR-物料供应系统配备大功率激光器 (488 nm、1.4 kw/cm 2 ; 532 nm、2.1 kw/cm 2 ; 561 nm、2.1 kw/cm 2 642 nm、2.1 kw/cm 2 )。 图 2 使用了 642 nm 激光.
- 使用高 NA 的油浸物镜。在这里使用的 SR-物料供应系统配备了 HC PL 160 x/1.43 NA 目标.
- 选择了适当的分色图像多维数据集。该协议中的 SR-物料供应系统配备了 488 hp t, 532 hp t, 568 hp t, 642 hp t 与发射带通滤波器505-605 毫微米, 550-650 毫微米和660-760 毫微米.
- 选择2D 获取模式。将相机设置为帧传输模式, 曝光时间为10毫秒 (100 Hz)。将 EM 增益设置为300。选择检测阈值.
注意: 低阈值产生高背景的图像。高阈值可能会过滤掉感兴趣的信号。确定基于负控制的阈值, 如 non-transfected 细胞的成像片或只用二次抗体孵育的细胞. - 启用自动事件控制, 并将每个图像的事件设置为 8.
- 在 "物料供应处购置" 选项卡中输入像素大小 (以 10 nm 或 20 nm 像素大小开始)。确保 #34; 直方图模式和 #34; 在图像获取之前, 在高分辨率图像计算选项的 "物料供应" 工具选项卡中选择.
- 对细胞膜上的蛋白质进行成像, 选择 TIRF 模式并修改入射角以确定穿透深度.
- 将电子发送到黑暗状态 (称为泵浦), 将激光强度设置为 100%.
- 在帧相关性为0.20 时, 选择单分子检测, 同时抽取和设置自动获取.
- 用于获取, 将激光强度设置为 50%.
- 将获取帧的数目设置为 6万.
注意: 调查人员可能会发现, 一个样本所需的帧数多于或少于此。修改帧数根据观察荧光漂白和停止承购, 当没有进一步事件是可检测的时. - 开始购置.
注意: 在收购开始时, 所有染料分子都处于荧光状态, 然后切换到黑暗状态。当帧相关性达到0.20 时, 图像将开始被获取。当每帧检测到少于8事件时, 405 激光将打开, 鼓励荧光从黑暗状态过渡到基态。当为 n = y 动物的数据集获取图像时, 如 TIRF 穿透深度、检测阈值和获取的帧数等参数应保持不变.
13。图像分析
- 用于量化蛋白质簇大小, 使用和 #39; 分析粒子和 #39; ImageJ 的特征.
注: 可以使用随机光学重建 microscopy-based 相对定位分析 (风暴-RLA) 或类似的 13 进行进一步分析。- 使用 ImageJ 执行群集分析 ( 图 3 ), 如下所示:
- 打开要分析的图像文件。这应该是一个 10 nm 直方图单分子本地化地图生成的成像软件上面描述 (第12节).
- 调整亮度和对比度以可视化图像: 单击图像菜单, 选择调整, 然后亮度和对比度。单击 "自动" 选项.
- 将图像类型更改为8位: 选择 "图像" 菜单, 然后选择 "类型", 然后选择8位.
- 设置图像的比例: 打开 "分析" 菜单, 单击 "设置缩放", 然后输入以下参数: 距离 = 1, 已知距离 = 10, 1 像素 = 10 nm.
- 若要选择要获取的度量值, 请打开 "分析" 菜单, 选择 "设置度量值", 然后选中 "区域" 选项旁边的复选框.
- 调整图像的阈值。打开 "图像" 菜单, 选择 "调整", 然后选择 "阈值", 选择 "过/下"。将最大值移动到 255, 并将最小值移动到 1, 然后单击 "应用".
- 要分析粒子, 打开 "分析" 菜单, 选择 "分析粒子"。放置复选标记以选择像素单位、显示结果和汇总。将大小设置为 4-无穷大 (因为分辨率为 ~ 20 nm), 请选择 "裸轮廓" 选项, 然后单击 "确定"。将创建一个摘要文件, 其中将包含分析详细信息, 如图像的平均簇大小和簇数.
注意: 在对特定簇中的蛋白质数量做出结论时应谨慎, 因为局部点的数量与蛋白质的数量没有线性相关。本地化与抗体相结合的染料, 产生连锁错误, 将荧光标签从表位中取代 #62; 10 nm 在任何方向。此外, 如果使用多克隆抗体, 不止一个抗体可以结合到一个单一的抗原和混淆的问题更进一步, 商业二级抗体共轭, 平均, 3-6 分子染料, 所以一个荧光并不总是等于一种蛋白质。通过将染料直接共轭到主抗体 (消除次) 或使用 nanobody-based 标记方案 14 , 可以减少连杆错误.
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Representative Results
如导言中所记载的, 有许多不同的超分辨率显微成像模式。该协议, 重点在物料供应的超分辨率成像。有代表性的图像和本地化映射显示在图 2和图 3中。
图 2显示了转染 ER 蛋白的 COS-7 细胞, mCherry-Sec61β, 并使用上述方法进行处理。图 2A-2B允许在 TIRF 模式 (a) 中使用超分辨率显微镜对 ER 图像进行比较, 并使用物料供应量获取模式 (B)。图像显示了在物料供应模式下获得的轴向分辨率的改善。这在伴生的剧情概要中进一步被证明, 可以使用 ImageJ 生成, 显示在感兴趣区域的规范化的强度曲线的分布的区别 (黄色线)。这些曲线代表的是 ER 小管的直径, 这似乎是更狭窄的检查时, 在物料供应模式。政府物料供应处的显微镜有一个横向定位精度约 20 nm, 从而表示约十倍的增加分辨率超出了衍射极限。这一改进的分辨率导致更准确的表征 ER 小管的结构。
在图 3中进一步演示了超分辨率图像处理技术提供的分辨率的改善, 显示了一个带有反 Ca 的v1.2 抗体的标记心肌细胞, 如上文所述。图 3A中的图像是使用 TIRF 设置中的超分辨率显微镜拍摄的。可以看到 CaV1.2 通道群集沿 t-小管网络组织。图 3B显示相同的单元格, 但此图像是使用 "物料供应" 模式获取的。轴向分辨率的改进在集中于单个通道簇 (图 3B) 的面板中更为突出, 当对使用 TIRF 和物料供应的相同 ROI 进行比较时, 不同的通道簇更容易识别为由物料供应处影像所提供的分辨率改善的结果。这些面板还比较了检测阈值中定义为每个像素的光子数的差异。这个参数必须慎重选择, 并适应实验的要求。面板3D 显示了使用 ImageJ 软件处理物料供应处图像时的群集轮廓, 由此可以确定映像中每个群集的群集区域 (请参见上面的注释13.1.8 和讨论一节以了解重要的注意事项在执行此类量化时)。此信息可用于在面板3C中生成频率直方图。此分析可用于检查簇大小的变化, 或对照测试条件 (例如、与突变通道或未经处理的与药物治疗的细胞) 之间的样本簇数。使用本协议中概述的方法, 辅以逐步漂白实验, 调查人员确定, CaV1.2 通道分布在心肌细胞平均8通道的簇中,15.
图 1: 用于膜蛋白超分辨率成像的事件时间线的示意图表示.0天是指第一天处理抗体的标签。协议部分指的是协议中每个步骤都有详细信息的部分。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 超分辨率显微镜提供了改进的噪声信号和增加的空间分辨率.(A) 左 COS-7 细胞表达 mCherry-Sec61β, 固定和标签的描述, 在协议和影像使用传统的 TIRF 显微镜。右上部面板: 单 ER 小管。右下面板: 在二小管 (黄线) 宽度范围内拍摄的剖面图。(B) 与 (A) 相同的单元格, 但使用物料供应处超分辨率生成的本地化地图除外。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 心肌细胞中 Cav1.2 通道的超分辨率成像。() TIRF 从一个孤立的心肌细胞的足迹, 固定, 并染色与抗钙V1.2 抗体 (FP1)。(B) 左: 从同一个心肌细胞的超分辨率 TIRF 足迹 (A)。右: 已被置于不同检测阈值的本地化地图的放大部分。注意, 当一个增加检测阈值时, CaV1.2 通道群集的表观大小会减少。(C) 从 (B) 中的本地化映射获得的簇大小的频率直方图。(D) 左侧: 从 (B) 的 CaV1.2 群集的轮廓。右: 图像的放大部分已受到不同的检测阈值。注意, 与 (B) 类似, 随着检测阈值的增加, 由 CaV1.2 通道群集占用的区域会减少。请单击此处查看此图的较大版本.
| 荧光使用 | Alexa-647 |
| 激光 | 642毫微米 |
| 发射过滤器 | 623 HP t |
| 镜头 | 160X 1.43 NA |
| 曝光时间 | 10毫秒 |
| 检测阈值 | 65 |
| 入射角 (穿透深度) | 65.04° (150 nm) |
| EM 增益 | 300 |
| #frames 获得 | 30,000–60,000 |
| 泵浦激光强度 | 100% |
表 1: 成像参数列表。
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Discussion
最近的技术爆炸使得成像超出了衍射极限, 为哺乳动物细胞信号在空间和时间上的复杂性提供了新的窗口。这些技术包括风暴、STED、棕榈、物料供应、SIM 和它们的变体 (例如、dSTORM、FPALM)。这些技术背后的科学家的聪明才智使我们能够绕过物理学定律对光的衍射所施加的限制。尽管取得了这一巨大成就, 但每种技术都做出了某种妥协, 以达到超分辨率, 因此, 有其局限性。细胞生物学家和 biophysicists 追求的理想状态是最佳灵敏度、高分辨率和快速采集, 无漂白。此外, 人们还应该认识到, 通过从动物身上移除细胞, 我们自然地改变它们, 并可能改变分子动力学。因此, 寻求开发一种超分辨率技术, 允许动态, 活细胞, 单分子成像在一个活生生的, 呼吸的动物继续。现在, 我们有我们的工具, 可以生成10倍的衍射有限分辨率的改进图像。在这篇文章中, 我们讨论的样品准备, 图像采集, 和分析, 使决议, 以20和 50 nm 的横向和轴向尺寸, 分别。
虽然本协议的重点是 Sec61β和 caV1.2 L 类型的 ca2 +通道, 但上述协议可以作为一个模板, 供研究人员在他们自己的实验室中的不同的蛋白质的图像上, 在一份显微镜。这种类型的协议的积极属性是, 它是相对简单的, 可以修改和应用于一些不同的细胞类型, 并可以很容易地适应多色成像。明显的限制是, 超分辨率系统, 配备了一个敏感的 EM CCD 相机能够分子检测, 仍然往往是令人望而却步昂贵的许多实验室。
随着以超分辨率显微镜为首选成像技术的实验室数量的增长, 对图像的采集、处理和解释需要更加一致的理解和一致。例如, 如何量化两个在衍射限制的像素中出现 colocalized 的蛋白质的接近程度, 但却在超分辨率图像/地图中实际显示几乎没有重叠？事实上, 这种情况已经出现了一些先前假设的 colocalized 蛋白, 如粘附复合蛋白蛋白和 zyxin。随着显微镜实现的分辨率不断提高, 也许蛋白质将不再被报告为 "colocalize", 而是有随机的分布模式。毕竟, 这是不可能的两个蛋白质物理占据完全相同的3维空间。这一分析难题的一些解决方案开始出现在文献中, 包括随机光学重建 microscopy-based 相对定位分析 (风暴-RLA), 据报告, 这可以量化的频率和程度重叠在两个 co-labeled 蛋白质之间, 也提供了对不重叠蛋白质之间距离的定量测量13。当在超分辨率中将一个通道与另一个信道进行比较时, 当然必须确保在两个通道之间有正确的注册表。这可以使用多色微球荧光珠和成像在每个单独的通道, 然后覆盖图像。此外, 由于 SR-物料供应处3D 显微镜也可以作为一个 TIRF 显微镜和生成超分辨率定位地图在 TIRF, 这是重要的是匹配的渗透深度之间 two-color 通道, 因为 TIRF 角度变化取决于用于激发样品的光波长。
此外, 如图 3B和图 3D所示, 根据 "阈值" 的程度, 本地化映射可能会出现极大的不同。如果检测阈值设置得过低, 则结构可能看起来比它们真正的更大, 因为其中一个包含杂散非特定标记的 "噪声" 增加的概率。反之, 如果检测阈值设置得太高, 则结构可能比实际的 "真实" 事件更小。因此, 阈值化应以理性和谨慎的态度应用。那么, 如何才能确定一个给定样本的合理检测门限呢？控件是关键。与任何免疫标记方法一样, 应该进行阳性和阴性对照, 以证明抗体的特异性。有了适当的控制, 就可以推导出一个检测门限, 只有特定的标记才能被观察到。适当的控制包括将主要抗体培养物省略的样本, 这样只能观察到二次抗体的样品。从这种控制, 二级抗体的非特异性结合可以看出。在一个准备好的样本中, 这将导致每个图像的事件计数要小得多, 并且与主和次孵育样本相比, 每个像素的平均光子数更低。然后, 可以设置图像的检测阈值, 从而消除非特定标记。在对主、次孵育样本进行成像时, 应使用相同的检测阈值, 以增强对 "噪音" 消除的信心。进一步的控制包括那些测试主要抗体的特异性。在转染的细胞中, 如果标记的蛋白质不在细胞系内表达, 那么对主要抗体特异性的简单测试就是对 untransfected 细胞进行标记。为了证明原细胞的主要抗体特异性, 标记蛋白的基因敲除是金本位。检测阈值也可以设置使用这些初级抗体控制实验。在没有目标抗原的情况下, 任何荧光发射都是非特异性的。与次要的唯一控制, 具有良好的主抗体, 应观察每个图像较少的事件, 因此, 在相同数量的帧, 每像素较低的平均光子数应该是明显的。因此, 检测阈值可以设置为一个水平, 将消除由于不相干原抗体结合的非特异性背景染色。为了完全透明, 建议作者应将图像与其阈值参数明确表述, 并可能与在线的原始数据链接。电子保管。
研究者还必须认识到, 多重二级抗体可以结合到一个单一的主抗体, 所以1:1 初级: 二级结合率不应该假设。此外, 商业二级抗体通常被共轭到多个荧光, 例如, 在本议定书中使用的二级抗体被制造商注意到被共轭到2-8 荧光。作为一个工作-在这附近, 一个荧光可以直接被共轭到一个主要抗体。然后, 分光光度法可以用来确定每一个主抗体的平均荧光数。有几个商业可用的套件来执行这个共轭过程。然而, 即使达到1:1 的化学计量, 荧光分子本身可以创造进一步的 overcounting 问题, 由于闪烁和可逆切换的荧光。在实践中, 这意味着一个荧光可能在地面和激发状态之间循环数次, 因为它会发射光子簇。这些光子可以在几个相邻的像素内检测到, 导致簇大小的高估。其他调查人员已经解决了这一问题, 选择将荧光发射集中在短时间和空间的聚集在一起16,17。这是一个有点经验的方法, 仍然不能消除相同的荧光可以循环回到黑暗状态的一个长期的可能性, 然后逆转到一个循环/发射状态再次和被判断为第二个分子。因此, 不能仅基于簇大小计算群集中的分子数。目前, 对于这些问题没有完美的解决方案, 因此, 使用超分辨率成像与另一种技术 (如逐步漂白) 可以给出每个簇的分子数量的近似估计。有关的控制措施, 以提高对集群面积测量的信心, 包括比较已知的单体蛋白 (例如, CD86) 和已知的二蛋白 (如, CTLA-4) 的簇大小, 以那些感兴趣的蛋白质的建议Fricke et al.18。
总之, 本文提出了一种简单的 immunolabeling 协议, 描述了用于超分辨率成像的固定样品的制备。此外, 还讨论了图像采集和分析中的一些常见缺陷。随着超分辨率成像变得越来越普遍, 期刊可能需要制定一套新的指导方针, 以避免对这些复杂图像/本地化地图的不当操作。超分辨率显微镜为细胞生物学家和 biophysicists 的工具箱添加了一个强大的新工具, 并且已经对我们对细胞结构和分子组织的理解产生了非同寻常的影响。
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Disclosures
作者没有竞争利益透露。
Acknowledgments
这项工作得到了从哈哈哈到 r.e.d.i (15SDG25560035) 的资助。作者想承认 Dr. 费尔南多桑塔纳使用他的徕卡 SR 3D 显微镜, 并 Dr. 约翰地狱为好心提供 FP1 抗体。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | To clean coverglass |
| #1.5 coverglass 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | To grow/process/image cells |
| 10x PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Dilute to 1x with de-ionized water |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| laminin | Sigma | 114956-81-9 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventricular myocyte culture media |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media supplement |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | Media supplement |
| 0.05% trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Cell culture solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection reagent |
| Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Cell culture |
| 100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Cell Fixation |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA or other blocking solution alternatives exist |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent to permeabilize cells |
| Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | Gift | N/A | Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Secondary antibody |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Prevents microbial growth for long term storage of samples |
| Catalase | Sigma | C40 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Photoswitching buffer ingredient |
| Tris | Sigma | T6066 | Photoswitching buffer ingredient |
| beta-Mercaptoethylamin hydrochloride | Fisher | BP2664100 | Photoswitching buffer ingredient |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoswitching buffer ingredient |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Photoswitching buffer ingredient |
| Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glass Depression slides | Neolab | 1 – 6293 | To mount samples |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | To seal coverglass |
| sec61β-mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD 3D microscope | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Washing block solution | 20 % SEAblock in PBS | ||
| Primary antibody incubation solution | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
| Secondary antibody incubation solution | 1:1000 in PBS |
References
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