Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית

Published: November 5, 2017 doi: 10.3791/56239
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Physiology and Membrane Biology, University of California School of Medicine, Davis

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול איתור של אחד או יותר פלזמה ו/או חלבונים תאיים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע (GSD) בתאי יונקים. כאן, אנו נדון את היתרונות ואת השיקולים של שימוש בגישות כאלה עבור ויזואליזציה של כימות של החלבונים.

Abstract

ההתקדמות פלורסנט מיקרוסקופ ביולוגיה של התא הם אישית בקורלציה, עם משופרת היכולת לדמיין את הסלולר אירועים מובילים לעתים קרובות כדי קפיצות דרמטי בהבנתנו כיצד תאים פונקציה. פיתוח, הזמינות של מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה במידה ניכרת האריך את הגבולות של רזולוציה אופטית מ ~ 250-20 ננומטר. ביולוגים מוגבלים יותר לתיאור אינטראקציות מולקולרית במונחים של colocalization בתוך אזור עקיפה מוגבלת, אלא זה עכשיו אפשר לדמיין את האינטראקציות דינמי של מולקולות בודדות. כאן, אנחנו חלוקה לרמות עבור ויזואליזציה של כימות של החלבונים פרוטוקול על ידי מיקרוסקופ הקרקע-מצב דלדול לדימות תא קבוע. אנו מספקים דוגמאות מתוך שני חלבונים ממברנה שונים, אבן יסוד של translocon רשתית תוך-פלזמית sec61β, מותאם לשפות אחרות קרום פלזמה ממותגת מתח Ca L-סוג2 + ערוץ (CaV1.2). דנו הם פרמטרים ספציפיים מיקרוסקופ, שיטות קיבוע, מיתוג צילום מאגר ניסוח, ואת החסרונות אתגרים של עיבוד תמונה.

Introduction

תגובות איתות סלולרי לתרגם שינוי סביבות פנימיים וחיצוניים ליזום תגובה תאית. הם לווסת את כל ההיבטים של פיזיולוגיה אנושית, הגשה הקרן הורמון שחרור נוירוטרנסמיטר, פעימות הלב, חזון, הפריה, ואת התפקוד הקוגניטיבי. שיבוש cascades איתות אלה יכולות להיות השלכות חמורות בצורה של תנאים הקשורים pathophysiological כולל סרטן, פרקינסון, אלצהיימר. במשך עשורים, ביולוגי ורפואי החוקרים השתמשו בהצלחה חלבונים פלורסנט הגששים, ביולוגיים בשילוב עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ כמו הכלים הראשי כדי להבין את ארגון יכולות מדויקות מאלה הסלולר אותות.

נקודות החוזק של טכניקות אופטית כגון epifluorescence, וידאו, או מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (TIRF) גמורה הם שלהם רגישות, מהירות ותאימות עם תא חי הדמיה, אמנם המגבלה העיקרית שלהם רזולוציה מוגבלת עקיפה, משמעות מבנים או חלבון מתחמי קטן מ- 200-250 ננומטר לא יכול להיפתר. עם התפתחות דטרמיניסטית סופר-רזולוציה עיוני ומעשי (תאורה מיקרוסקופ (SIM2) או רזולוציה סופר סטוכסטי מובניםלמשלמיקרוסקופ דלדול פליטה מאולצת (STED1), (למשל , photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופ (דקל3), או מצב הקרקע דלדול (GSD4,5)), רזולוציית לרוחב ו צירית במיקרוסקופ פלורסצנטיות הוארך מעבר למכשול עקיפה, על מנת של עשרות ננומטר. לכן, חוקרים עכשיו יש את היכולת לדמיין ולהבין איך חלבון הדינמיקה והארגון מתרגמת לתפקד ברמה ליד-המולקולרית ללא תחרות.

בקרקע דלדול מיקרוסקופ ואחריו החזרה בודדים מולקולה (GSDIM), או פשוט GSD כפי שהיא מכונה, עוקף את מגבלת עקיפה על-ידי הפחתת מספר בו זמנית פליטת4,fluorophores5. אור לייזר באנרגיה גבוהה משמש כדי לרגש המדגם מתויג fluorophore, להפגיז אלקטרונים עם פוטונים, להגדיל את ההסתברות הם עוברים 'ספין-סלטה', הזן את שלישיה או "כהה-המדינה" מ- עירור4. זה יעיל מכלה את מצב הקרקע, ומכאן השם 'קרקע המדינה דלדול'. המדינה שלישיה, fluorophores פולט פוטונים, הדוגמה מופיעה דימר. עם זאת, אלה fluorophores stochastically להחזיר למצב קרקע, יכול לעבור מספר הפוטונים פולטות מעברים למצב נרגש-קרקע לפני החזרה למצב שלישיה. עם פחות fluorophores פולטות בכל זמן נתון, הנפלטים פוטון התפרצויות בודדות fluorophores להיות במרחב של חנותם ברורים ממחוז fluorophores. פרץ זה של פוטונים יכול להיות בכושר עם פונקציה לפי עקומת גאוס, centroid מחושב אשר מתאים למיקום של fluorophore עם דיוק לוקליזציה התלויים מספרי הצמצם (NA) של העדשה, אורך הגל של האור משמש עירור, ויותר חשוב, המספר של פוטונים הנפלט fluorophore. מגבלה אחת של GSD היא כי, מאז רק ערכת משנה של fluorophores פולט באופן פעיל בכל עת, אלפי תמונות יש לאסוף במשך מספר דקות כדי לבנות את מפת לוקליזציה מלאה. בזמן רכישת זמן בשילוב עם הדרישה כוח לייזר גבוהה, המשמעות GSD היא יותר מתאימה לתקן במקום דגימות בשידור חי.

מאמר זה, מתאר את הכנת דוגמאות קבועות עבור הדמיה סופר-ברזולוציה מיקרוסקופיה של הממברנה, תוך-פלזמית (ER)-תושב חלבונים (לקבלת רשימה של מתכלים הדרושים ולראות ריאגנטים טבלה של חומרים). דוגמאות איך פרוטוקול זה ניתן בקלות הותאם לכמת את גודל ואת מידת קיבוץ באשכולות של L-סוג ממותגת מתח Ca2 + ערוצים (Cav1.2) sarcolemma של תאי שריר הלב, או להשתמש כדי להמחיש את ההפצה הסלולר של חדר המיון, הם הפגינו. הבנת את התפלגות וארגון מרכיבים אלה הסלולר היא חשובה ביותר בהבנת הקבלה, תרגום, ובסופו של דבר את הפונקציה של Ca רבים2 +-מפלי איתות התלויים. לדוגמה, Cav1.2 ערוצי חשובים באופן מהותי עבור צימוד, בעוד קולטן בתיווך Ca2 + השחרור מחדר המיון הוא אולי המפל איתות ביותר בכל מקום בתאים בתרבית של עירור-התכווצות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שטיפת coverslips זכוכית דקה

  1. יום לפני עיבוד הדגימה, לנקות #1.5 coverslips זכוכית דקה על ידי sonicating בפתרון 1 מ' של קו מאובטח. פעולה זו מסירה את כל מזהמים פלורסנט שעשויים להיות נוכח על coverslips.
    1. שטפים היטב את קו מ coverslips במים מיוננים.
    2. לאחר נוקה ב KOH, אחסן את coverslips אתנול 70% עד מוכן לשימוש.

2. ציפוי coverslips זכוכית דקה

הערה: השלבים בסעיף זה צריך להתבצע בשכונה התרבות התא למניעת זיהום.

  1. להשתמש מלקחיים כדי להסיר coverslip בודדים של הפתרון אתנול 70%, להבה במהירות כדי להסיר את עודף. מקם את coverslips לתוך צלחת 6-. טוב. אם בוער בשכונה תרבות היא לא אופציה, שקול autoclaving coverslips לאחר שטיפה עם מים מיוננים ו/או עיקור מתחת UV אור בשכונה תרבות במשך לפחות 30 דקות
  2. לעזרת הידבקות של תאים, מעיל coverslips עם סטרילי 0.01% פולי-L-ליזין לשעה בטמפרטורת החדר.
  3. וארוקן את פולי-L-ליזין ולשטוף את coverslips עם סליין סטרילי פוספט buffered (PBS). אוויר יבש ומניחים במקרר למשך הלילה.
  4. בבוקר שלמחרת, להסיר את coverslips מהמקרר ולהוסיף 300 µL של laminin, על ריכוז של 50 µg/mL, במשך לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר. להבטיח כי laminin בזהירות מניחים ישירות על גבי coverslip.
    הערה: שלב זה laminin אין צורך כי-7 תאים או תאים HEK293 אך נדרשת עבור נייטרלים חדרית מבודד. שאר התאים הראשי כגון תאי השריר החלק בכלי הדם או נוירונים עשויים לדבוק כדאי קולגן או fibronectin מצופה coverslips.

3. הכנה של תאים

  1. תאים בתרבית
    1. 7-כי לגדל תאים (או שורת התאים מועדף) על צלחת תרבות 10 ס מ ב- 10 מ"ל Dulbecco ' s בינוני נשרים שונה (DMEM) תרבות בינוני בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1% פתרון פניצילין/סטרפטומיצין (PS). לגדל תאי חממה התרבות התא-CO של 37 ° C ו- 5%-2-
    2. כאשר התאים מגיעים 90% confluency, לקצור אותם מתוך קערה 10 ס מ על-ידי כ רפה בעברית התקשורת DMEM והוספת 5 מ של 0.05% טריפסין-EGTA פתרון ברגע והתאים מתחילים לאסוף ולנתק, לנטרל מיידית של טריפסין עם DMEM שהושלם.
      1. שימוש 5 מ"ל פיפטה סרולוגית כדי להסיר התאים מתוך קערה. Pipette את המדיום נגד הבסיס של המנה מספר פעמים כדי להסיר תאים שנותרו מחסידי למשל ולהפצה התאים ברחבי המדיום תרבות.
    3. צלחת תאים על 35 מ מ מנות התרבות כדי להשיג 70% confluency על תרביות תאים. להפוך את אמצעי האחסון של מדיום בצלחת עד 2 מ"ל עם פתרון DMEM/FBS/PS טריים.
      4. בונה
    4. transfect כי-7 תאים עם פלסמיד הרצוי DNA (למשל, פלסמיד sec61β-mCherry), באמצעות ריאגנט של תרביות תאים מתאים ולפי היצרן ' הוראות s.
      הערה: ייתכן שיחלפו 24-48 שעות עבור החלבון לבטא, בהתאם את פלסמיד ו/או תרביות תאים הכימית משמש.
  2. נייטרלים חדרית העכבר למבוגרים
    1. לבודד נייטרלים חדרית העכבר למבוגרים באמצעות ומבוססת Langendorff זלוף בשיטה 6. מחדש להשעות את גלולה וכתוצאה מכך נייטרלים בבינוני 199 (M199) בתוספת 2.5% FBS ו 1% PS.

4. ציפוי תאים

  1. Transfected COS-7 תאים
    1. האחות 2 מ"ל DMEM/FBS/PS פתרון מקערה 35 מ מ ולהוסיף 1 מ"ל Ca 2 +-PBS חינם. לחזור המנה החממה עבור 2 דק קציר תאים מתוך קערה על ידי כ רפה בעברית הראשון Ca 2 +-חינם PBS, ולאחר מכן הוספת 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EGTA פתרון.
      1. פעם התאים להתחיל לאסוף, לנתק מיד לנטרל את טריפסין 1 מ של DMEM שהושלם. פיפטה בעדינות לאורך מספר פעמים על מנת להבטיח התאים transfected מופצים באופן אחיד ברחבי המתלה טריפסין-EGTA-DMEM 2 מ"ל.
    2. צלחת transfected COS-7 תאים על coverslips מצופה פולי-L-ליזין-צפיפות המתאים כך תאים בודדים, ניתן לאבחן, ולמלא את אמצעי האחסון המנה עד 2 מ עם DMEM/FBS/PS (למשל להוסיף 90 התליה תא µL coverslip לאחר מכן להוסיף 1,910 µL בתוספת DMEM, מערבולת מאכל להפיץ תאים באופן שווה).
      הערה: תאים לא צריך להיספר אבל עוצמת הקול של תאים יתווספו כל מנה ישתנו בהתאם confluency של התאים.
    3. החזרה מצופה לתאים תא תרבות החממה למשך הלילה כדי לאפשר את התאים לדבוק ולשחזר.
  2. נייטרלים חדרית העכבר למבוגרים
    1. תשאף נייטרלים laminin וצלחת ישירות על גבי coverslips מצופה ב צפיפות המתאימה כך תאים בודדים, ניתן לאבחן. זה יהיה תלוי צפיפות התאים קיימא המתקבל הבידוד.
    2. לאזן התליה תא בכיפה על coverslip ועל מקומו חממה התרבות התא-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 ~ 45 דקות לאפשר אדהזיה.

5. קיבוע של תאים

  1. להסיר תאים של החממה, בזהירות תשאף המדיום.
    1. לשטוף את תאים חסיד פעם אחת עם PBS.
    2. תיקון תאים עם מקבע אופטימיזציה יישומים בודדים, נוגדנים.
      הערה: קריטריון חשוב לזכור בעת בחירת מקבע הוא שימור המבנה התאי של המדגם, תוך הקפדה גם על כי אין שינוי הסתגלותי ב אנטיגן של עניין. למטרות של הסובבים פרוטוקול 3% paraformaldehyde/0.1% גלוטראלדהיד (PFA/GA), קיבעון עם 100% מתנול הנדונה.
  2. מחברים/GA קיבוע של transfected COS-7 תאים לבטא Sec61β-mCherry
    1. לערבב 1.9 מ ל-16% מחברים, GA 50% µL 20 ולהוסיף PBS לעשות נפח סופי של 10 מ"ל.
    2. להוסיף 1 mL להתמחויות מחברים/GA לפתרון כל מנה של תאים, תיקון 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. וארוקן את התאים מחברים/GA ולשטוף 3 פעמים עם PBS.
    4. לרחוץ את התאים מודבקת עם PBS, 5 פעמים עבור 5 דקות כל אחד. לבצע את כל הצעדים כביסה מסובב להגדיר במהירות בינונית (למשל, 50 מחזורים בדקה).
    5. הבא, להפחית את הקבוצות אלדהיד חופשית עם 1 מ"ל להתמחויות 0.1% מסה/עוצמה נתרן borohydride במים מיוננים.
    6. שטיפה תאים פעמיים ואז לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד ב- PBS כדי להסיר כל עקבות של נתרן borohydride, האלכוהול הוא מייצר כאשר הוא מגיב עם aldehydes חינם-
  3. מתנול קיבוע של העכבר למבוגרים נייטרלים חדרית
    1. בזהירות להוסיף 1 מ"ל של קרח 100% מתנול תאים. להטות את הצלחת 6-ובכן, pipette של מתנול על הקיר בצד ולא ישירות על גבי את coverslip. לאחר מכן להטות את הצלחת 6-. טוב לחזור אופקי כדי לאפשר את מתנול לרחוץ באופן שווה על פני התאים. תקן עבור 5 דקות ב-20 ° C
    2. וארוקן את התאים מקבע ולשטוף 3 פעמים עם PBS.
    3. לרחוץ את התאים מודבקת עם PBS, 5 פעמים עבור 5 דקות כל ב rotator.

6. חוסם ספציפי שאינו מחייב

  1. בלוק לשעה בטמפרטורת החדר בפתרון חסימה (ראה את הטבלה של חומרים).
    הערה: פתרונות שונים עשויים לשמש לחסום מחייב שאינם ספציפיים נוגדן כולל 3% אלבומין שור (BSA) או סרום-החיסון מ מאותו המין כמו הנוגדן העיקרית.

7. זיהוי

  1. הדגירה העיקרי נוגדן
    1. וביופסיה הפתרון חסימה. אנחנו לא שוטפים או שטיפה.
    2. להכין את הפתרון נוגדן ראשוני כדלקמן (ראה שלב 7.1.5): לדלל נוגדן ראשוני כדי ריכוז של µg/מ"ל (או יצרן ' s הציע ריכוז) בפתרון הדגירה נוגדנים (ראה את הטבלה של החומרים ). לאזן את אמצעי אחסון זה קטן על coverslip ולהגדיר בזהירות ריבוע של פרפין פלסטיק הסרט למעלה. זה עוזר להפיץ נפח קטן של נוגדן מעל coverslip, מפני אידוי.
    3. למקם את הצלחת 6-ובכן בתוך תא לחות, דגירה למשך הלילה במקרר.
    4. בבוקר, להסיר התאים תא לחות, בזהירות להסיר את הסרט פרפין מרובע מפני השטח של coverslip, תשאף הפתרון העיקרי נוגדן.
    5. שטיפה 3 פעמים עם PBS, ואז לשטוף 5 פעמים במשך 5 דקות עם שטיפה בלוק פתרון (ראה טבלה של חומרים)-מסובב.
      הערה: פרוטוקול זה משתמש הנוגדנים הבאים, אנטי-RFP העכבר נוגדנים חד שבטיים לתמונות, מוצגים באיור 2 ארנב FP1 polyclonal 7 אנטי-Ca V 1.2 נוגדנים (מתנה פרופ. יוהנס גיהנום, UC דיוויס) עבור התמונות המוצגות באיור 3. לגבי החדר לחות, קופסת אוכל פלסטיק עם מכסה ההדוקות, שלאורכו מגבות נייר רטוב עבודות. PBS עשוי לשמש לניקוי צעדים, אולם פרוטוקול זה משפר את תיוג ירידה לפרטים ומפחיתה את הרקע באמצעות חסימת בתמיסה מדוללת לכביסת צעדים.
  2. נוגדנים משניים דגירה
    1. וארוקן את הפתרון כביסה ולהוסיף 200 µL מצומדת נוגדנים משניים הפתרון מדולל 1:1,000 בתמיסה הדגירה נוגדן. מניחים ריבוע של פרפין הסרט מעל coverslip (ראה שלב 7.1.2).
    2. Incubate לשעה בטמפרטורת החדר בחושך.
    3. נוגדנים משניים לשאוב ולשטוף 3 פעמים עם PBS.
    4. לרחוץ תאים עם פתרון חסימה מדולל 5 פעמים למשך 5 דקות על הנדנדה.
    5. שטיפת 3 פעמים במשך חמש דקות עם PBS.
      הערה: פרוטוקול זה המתאר את השימוש אנטי-העכבר 647 אלקסה משני נוגדן מצומדת ו אנטי-ארנב 647 אלקסה מצומדת נוגדן משני עבור איור 2 ו- איור 3, בהתאמה. חלבון יחיד תיוג, 647 אלקסה הוא fluorophore מועדף בשל שלה ספירה גבוהה פוטון (משפר את דיוק לוקליזציה), מחזור נמוך (משפר רזולוציה טמפורלית) 8. אפשרויות רבות אחרות fluorophore מצומדת נוגדנים משניים, כגון אטו או Cy-צבע, הינם זמינים. עיין דמפסי. et al. 8 ו. Chozinski et al. 9 עבור הערכות מקיף של ההתאמה של מספר fluorophores/צבעני הדמיה ברזולוציה סופר-

8. קיבוע שאחרי (שלב אופציונלי)

  1. לדלל 50 µL 50% GA ב 10 מ"ל PBS להשגת פתרון GA 0.25%. פוסט לתקן תאים עבור 10 דקות בפתרון זה בטמפרטורת החדר.
  2. לשטוף עם PBS 3 פעמים במשך 5 דקות על מסובב.

9. אחסון של דגימות

  1. לאחסן דגימות במקרר (4 ° C) אריזה מרופדת בנייר כסף אלומיניום כדי להגן מפני אור עד הדמיה-
  2. לאחסון לטווח ארוך של דגימות (עד מספר חודשים), לאחסן ב- PBS המכיל אזיד הנתרן 3 מ מ למניעת התפתחות חיידקים.

10. GSD סופר-רזולוציה הדמיה מאגר Photoswitching הכנת

  1. להכין חמצן ניקוי ' GLOX ' פתרון כדלקמן:
    1. בשפופרת microcentrifuge 1.5 mL, להוסיף קטלאז µL 12.5 (מניות 34 מ"ג/מ"ל), 3.5 מ ג גלוקוז אוקסידאז, 0.5 µl 1 מ' טריס (ה-pH = 8) כדי 49.5 µL PBS.
    2. מערבולת בקצרה כדי להמיס רכיבים בתוך תמיסת ואז צנטריפוגה ב g x 20,800 עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס
      הערה: ניקוי חמצן פתרונות כגון GLOX, התגלו להתנגד photobleaching. GLOX יש לשמור במקרר עד שבוע. חזור על השלב צנטריפוגה בכל פעם בו.
  2. להכין photoswitching בתדר פתרון תיול כדלקמן:
    1. להכין פתרון β-mercaptoethylamine (מאה) 100 מ מ ב- PBS ולשנות את ה-pH pH 8 או לחילופין שימוש β-mercaptoethanol (βME). לאחסן פתרון MEA aliquoted במקפיא (-20 ° C) במשך שבוע עד.
  3. מיד לפני הדמיה, הכנת המאגר מיתוג הסופי על קרח על-ידי הוספת תיול את ניקוי חמצן מרכיבים ביחד. עבור 500 µL GLOX-MEA, להוסיף 5 µL GLOX 50 µL MEA (ה-pH = 8) 445 חיץ מלוחים µL (2.5 מ ל 1 מ' טריס pH = 8, mg 29.22 NaCl (ריכוז סופי 10 מ מ), גלוקוז 5 g ו- 47.5 מ ל מים). לחלופין, להוסיף לפתרון GLOX-βME 5 µL GLOX, 5 µL βME, מאגר מלוחים 490 µL.
    1. לשמור את הפתרונות על קרח, להשתמש לפי הצורך כדי לטעון דגימות בשקופיות זכוכית דיכאון.
      הערה: תיול המכיל פתרונות כגון βME או MEA לגרום photoswitching של צבעי מבוססי cyanine כגון אלקסה 647 10 או מבוססי xanthene צבעים כגון אלקסה 568. ΒME מפיקה תוצאות טובות יותר עם אלקסה 647 בעוד מאה היא המועדפת עבור אלקסה 568 או כאשר 2 חלבונים הם לדימות בגישה תיוג זוגי ניצול אלקסה 568 והן 647. המאגר יחריף על פני תקופה של שעות עקב acidification. זה יוביל לירידה הרוזן פוטון הממוצע של המדגם. כדי למנוע זאת, רצוי להכין מאגר photoswitching טריים לאחר 2-3 h או אם ירידה בספירת פוטון הממוצע או סיומת הבולטים של משך הזמן photoswitching המושרה נצפית. מאמר תיאר חדש הדמיה מאגר שור-EA אשר עדיין לא בדקנו אך הדיווחים pH יציב המוצגים רמות במשך מספר ימים ומבצע טוב יותר GLOX עבור יישומי הדמיה 11 צבע רב.

11. הרכבה דוגמאות

  1. הר coverslips עם תאים עם תוויות (ראו סעיפים 1-9) על דיכאון שקופיות, באמצעות 100 µL מאגר הדמיה-
  2. לאטום את הקצוות של coverslip עם דבק סיליקון למניעת חמצון מהיר של המאגר הדמיה. חכו מספר דקות עד דבק סיליקון מלא ריפאה אחרת coverslip את אלוהים כאשר הדמיה-
    הערה: דבק סיליקון לא תחזק אם הוא בא במגע עם βME. יש להקפיד לייבש את הקצוות של coverslip כדי למנוע את דבק סיליקון פנייה אל המאגר הדמיה-

12. תמונה רכישת

  1. ראה טבלה 1 לקבלת רשימה של הדמיה הפרמטרים המשמשים איור 2 איור 3-
    1. כדי להתחיל, בחר את הלייזר המתאים כדי להאיר את הדגימה בהתאם fluorophore נבחר. מערכת SR-GSD בשימוש פרוטוקול זה מצויד עם לייזרים ובעוצמת (488 ננומטר, 1.4 KW/cm 2; 532 ננומטר, KW/ס מ 2.1 2; 561 ננומטר, 2.1 KW/cm 2 642 ננומטר, KW/ס מ 2.1 2). איור 2 משמש הלייזר nm 642.
  2. שימוש של העדשה המטרה שמן-טבילה עם הערך לא ישים גבוהה מערכת SR-GSD המשמש כאן הינו מצויד עם אפו PL HC 160 X / 1.43 נה המטרה.
  3. בחרה הקוביה המתאימה הדמיה ודיקרואיק זוהר. מערכת SR-GSD פרוטוקול זה מצויד עם HP 488-T, 532 HP-T, HP 568-T, HP 642-T עם פליטה הלהקה לעבור מסננים של 505-605 ננומטר, 550-650 nm ו- 660-760 nm.
  4. בחר את מצב 2D רכישה. הגדר את המצלמה העברת מסגרת זמן מצב וחשיפה 10 ms (100 Hz). הגדר את רווח EM 300. בחר את הסף זיהוי.
    הערה: סף נמוך להפיק תמונות רקע. סף גבוה יכול לסנן את האות של עניין. לקבוע סף בהתבסס על פקדים שליליות כגון הדמיה coverslips של תאים שאינם transfected או תאים מודגרות עם נוגדנים משניים בלבד.
  5. להפעיל אוטומטית אירוע שליטה ואירועים קבועים לכל תמונות ל- 8-
  6. הזן את גודל פיקסל בכרטיסיה GSD-רכישה (להתחיל עם 10 ננומטר או גודל פיקסל של 20 ננומטר). להבטיח כי " היסטוגרמה מצב " נבחרת הכרטיסיה כלים GSD תחת אפשרויות החישוב של התמונה ברזולוציה גבוהה לפני ייבוא תמונות.
  7. תמונה חלבונים-קרום פלזמה, לבחור את מצב TIRF ולשנות את זווית שכיחות כדי לקבוע את עומק החדירה.
  8. לשלוח אלקטרונים המדינה כהים (הנקרא שאיבה), להגדיר את עוצמת הלייזר ל- 100%.
  9. בחר גילוי מולקולה בודדת תוך שאיבה והגדר לרכוש באופן אוטומטי כאשר המתאם מסגרת הוא 0.20.
  10. עבור הרכישה, להגדיר לייזר בעוצמה על 50%.
  11. מוגדר מספר המסגרות רכישה של 60,000 דולר.
    הערה: החוקר עשוי לגלות כי מדגם דורש פחות או יותר מאשר זה. לשנות את ספירת מסגרת המבוססת על תצפיות של photobleaching fluorophore ורכישת עצור כאשר אין אירועים נוספים לזיהוי.
  12. רכישה התחל.
    הערה: בתחילת רכישה, כל מולקולות צבען נמצאות במצב פלורסנט ולאחר מכן לעבור למצב כהה. כאשר המתאם מסגרת מגיע 0.20, תמונות יתחיל לרכוש. כאשר אירועים פחות מ-8 מזוהים לכל מסגרת, תעבור הלייזר 405, עידוד fluorophores למעבר ממצב כהה של המדינה הקרקע. בעת רכישת תמונות עבור dataset של n = x תאים n = y בעלי-חיים, פרמטרים כגון TIRF עומק החדירה, זיהוי סף ומספר מסגרות רכשה צריך להישמר קבוע.

13. ניתוח תמונה

  1. כדי לכמת את גודל האשכול חלבון, השתמש ' לנתח חלקיקים ' תכונה של ImageJ.
    הערה: ניתוח נוסף ניתן לבצע באמצעות ניתוח מבוסס מיקרוסקופיה לוקאליזציה היחסי סטוכסטי שחזור אופטי (סערה-RLA) או דומים 13.
    1. לבצע ניתוח האשכולות ( איור 3) באמצעות ImageJ כדלקמן:
    2. לפתוח את קובץ התמונה כדי להיות מנותח. . זה אמור להיות 10 ננומטר היסטוגרמה מולקולה בודדת לוקליזציה מפת כפי שנוצר בתוכנת הדמיה שתוארו לעיל (סעיף 12).
    3. להתאים את הבהירות והניגודיות כדי להמחיש את התמונה: לחץ על תפריט תמונה, בחר התאם, ואז הבהירות והניגודיות. לחץ על האפשרות auto.
    4. לשנות את סוג התמונה ל- 8-bit: בחרו בתפריט ' תמונה ', ולאחר מכן בחר סוג, ובחרו 8-bit.
    5. קבע את קנה המידה של התמונה: פתח את תפריט נתח, לחץ על קנה מידה קבע והזן את הפרמטרים הבאים: מרחק = 1, ידוע מרחק = 10, 1 פיקסל = 10 ננומטר.
    6. כדי לבחור את המידות כדי להתקבל, פתח את תפריט נתח בחר הגדרת המידות, סמן את התיבה לצד האפשרות באזור.
    7. להתאים את הסף של התמונה. פתח תפריט ' תמונה ', בחר התאם ולאחר מכן בחר הסף, בחר מעל/מתחת. להעביר את הערך המקסימלי עד 255, ולעבור הערך המינימלי 1, לחץ על החל.
    8. כדי לנתח את החלקיקים, פתח את תפריט נתח, בחר נתח חלקיקים. הצב סימן ביקורת כדי לבחור יחידות פיקסל, הצגת תוצאות ולסכם. קבע את הגודל 4-אינסוף (מכיוון שרזולוציית ~ 20 ננומטר), בחר באפשרות מתאר חשופות, לחץ על אישור. ייווצר קובץ סיכום אשר יכיל את הפרטים ניתוח כגון את גודל האשכול הממוצע ואת המספר של אשכולות בתמונה.
      הערה: יש לנקוט זהירות בעת ביצוע מסקנות לגבי מספר חלבונים בתוך אשכול מסוים, כמו מספר נקודות המותאמות לשפות אחרות הוא לא לינארית מתואם עם המספר של חלבונים. GSD רגישה צבע זה הם מצומדת כדי נוגדנים, וכתוצאה מכך הצמדה-שגיאת זה מזיחה את התווית פלורסנט מ epitope על ידי > 10 ננומטר בכל כיוון. בנוסף, אם נוגדנים polyclonal משמשים, נוגדן אחד או יותר יכולים לאגד אנטיגן יחיד ולא לבלבל את הנושא המשני מסחריים, עוד יותר את הנוגדנים הם מצומדת, בממוצע, 3-6 מולקולות של צבע ולכן fluorophore אחד לא תמיד שווה חלבון אחד. תאחיזה-שגיאה יכול להיות מופחת על ידי conjugating צבע ישירות אל נוגדן ראשוני (ביטול המשני) או באמצעות מבוססי nanobody תיוג ערכת 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כפי שמתועד במבוא, ישנם רבים מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה אחרת שיטות הדמיה. פרוטוקול זה, מתמקד GSD הדמיה ברזולוציה-העל. נציג תמונות ומפות לוקליזציה מוצגים באיור 2 , איור 3.

איור 2 מציג תא COS-7 transfected עם מיון חלבונים, mCherry-Sec61β, מעובד באמצעות השיטה המתוארת לעיל. איור 2A -2B לאפשר את ההשוואה של תמונות של המיון שצולמו באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה סופר במצב TIRF (א) ושימוש GSD רכישה מצב (B). הדימויים מציגים שיפור הרזולוציה צירית כאשר רכשה במצב GSD. עוד הוכח בפרופיל עלילה המלווה, יכולה להפיק באמצעות ImageJ, המציגה את ההפרש בהפצה של העקומות בעוצמה מנורמל-תחומי עניין (קו צהוב). עקומות אלה מייצגים את קוטר בקוריאנית חולים אשר מופיעים בפני הרבה צר יותר כאשר בחן במצב GSD. GSD מיקרוסקופ יש לדיוק לוקליזציה לרוחב של 20 ננומטר ובכך מייצג כ עלייה ten-fold רזולוציה מעבר למגבלת עקיפה. שיפור זה ברזולוציה תוצאות ייצוג מדויק יותר של מבנה חדר מיון בקוריאנית.

לשיפור הרזולוציה המוצעים על ידי סופר רזולוציה GSD הדמיה נוספות הוכח איור 3, מראה myocyte לב שכותרתו עם נוגדן anti-Cav1.2, מעובד כמתואר לעיל. התמונה ב- 3A דמות צולמה באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה סופר GSD בסביבה TIRF. אשכולות של CaV1.2 ניתן לראות ערוצים כדי לארגן לאורך הרשת צנורית-t. איור 3B מציג באותו התא, אולם תמונה זו נרכשה משתמש GSD במצב. לשיפור הרזולוציה צירית בולט יותר הלוחות אשר מתמקדות אשכולות יחיד של ערוצים (איור 3B), כאשר נעשית השוואה בין רועי אותו עם תמונה באמצעות TIRF ו- GSD, אשכולות נפרדים של ערוצי קלים יותר לזהות תוצאה של השיפור ברזולוציה המוצעים על ידי GSD הדמיה. הלוחות הללו גם להשוות את ההבדל בין הסף זיהוי הגדיר את המספר של פוטונים לפיקסל. פרמטר זה חייב להיות נבחרו בקפידה ומותאמים לדרישות של הניסוי. לוח 3D מראה אשכול קווי המתאר כאשר התמונה GSD היה מעובד באמצעות תוכנת ImageJ, מזה ניתן לקבוע את אזור אשכול עבור כל אשכולות נפרדים בתמונה (ראה הערה לעיל 13.1.8 של המקטע דיונים על שיקולים חשובים בעת ביצוע כזה של כימות). מידע זה יכול לשמש לאחר מכן ליצור היסטוגרמה שכיחות בלוח 3 ג. ניתוח זה יכול לשמש כדי לבחון שינויים גודל האשכול, או מספר אשכולות בין דגימות תחת שליטה לעומת תנאי הבדיקה (למשל, WT לעומת ערוצי מוטציה או תאים שטופלו בסמים לעומת ללא טיפול). באמצעות הגישות המתוארות ב פרוטוקול זה לצד ניסויים משלימים photobleaching הדרגתיים, קבעו החוקרים כי CaV1.2 ערוצי מופצים אשכולות, בממוצע, 8 ערוצי של תאי שריר הלב15 .

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של ציר הזמן של אירועים עבור הדמיה ברזולוציה-העל של קרום חלבונים. יום 0 מתייחס ביום הראשון של עיבוד של נוגדן תיוג. המקטע פרוטוקול מתייחס הסעיף בפרוטוקול איפה נמצא מידע מפורט על כל שלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: מיקרוסקופ ברזולוציה סופר מציע שיפור אות רעש והגדילה רזולוציה מרחבית. (א) שמאלה COS-7 תאים לביטוי mCherry-Sec61β, קבוע ו מתויג כמפורט בפרוטוקול עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ TIRF קונבנציונלי. נכון, העליון פאנל: צנורית אר יחיד. נכון, התחתון לוח: מגרש פרופיל נלקח לרוחב צנורית ER (קו צהוב). מפה (B) באותו תא כמו (א) למעט ההתאמה נוצרה משתמש GSD סופר רזולוציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: הדמיה ברזולוציה-העל של Cav1.2 ערוצים של תאי שריר הלב. TIRF (א) מ- myocyte לב, מבודד קבוע, וטביעת צבעונית עם אנטי-CaV1.2 נוגדנים (FP1). (B) שמאלה: סופר רזולוציה TIRF רגל של myocyte לב אותו כמו (א). מימין: להגדיל חלקים של המפה לוקליזציה למסכת זיהוי שונים סף. שימו לב כי אחד גודלת לסף גילוי, להקטין גודל לכאורה של CaV1.2 ערוץ אשכולות. (ג) תדירות היסטוגרמה של באשכולות המתקבל המפה לוקליזציה (ב'). (ד) שמאלה: קווי מתאר של ה-CaV1.2 אשכולות מ (B). מימין: חלקים מוגדל של התמונה היה נתון כדי זיהוי שונים סף. הערה, דומה (B), ככל לסף גילוי, האזור שנכבש על ידי ירידות אשכולות CaV1.2 ערוץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Fluorophore שימוש אלקסה-647
לייזר 642 nm
מסננים פליטה HP 623-T
עדשה נה 160 X 1.43
זמן החשיפה 10 ms
זיהוי סף 65
שכיחות זווית (עומק החדירה) 65.04° (150 ננומטר)
EM רווח 300
#frames רכשה 30,000 – 60,000
לייזר עוצמת שאיבה 100%
d >עוצמת לייזר עבור רכישת 50%

טבלה 1: רשימת הדמיה פרמטרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפיצוץ האחרונות של טכנולוגיות המאפשרות הדמיה מעבר למגבלת עקיפה הציעו חלונות חדשים לתוך המורכבות של בתרבית של תאים איתות במרחב ובזמן. טכנולוגיות אלה כוללים סערה, STED, דקל, GSD, SIM, גרסאות שונות (למשל, dSTORM, FPALM). החכמה של המדענים מאחורי טכניקות אלה אפשרה לנו לעקוף את המגבלות שהוטלו על ידי חוקי הפיסיקה המסדירים בשבירת קרני האור. למרות זה הישג ענק, כל אחת מהטכניקות הללו סוג של פשרה כדי להשיג סופר- רזולוציה הנסיעה, וככזה, יש מגבלות משלו. המצב האידיאלי זה תא ביולוגים, biophysicists שואפים הוא רגישות אופטימלית ברזולוציה גבוהה, רכישת מהר, עם לא photobleaching. בנוסף, אחד צריכים להישאר מודע לסכנה כי על-ידי הסרת תאים בעלי חיים, אנחנו מטבעו ולשנות אותם ולשנות פוטנציאל דינמיקה מולקולרית. לכן, השאיפה לפתח טכנולוגיה סופר רזולוציה המאפשרת דינאמיות, לחיות תא, הדמיה מולקולה בודדת בחי, נושם חיים ממשיך. עכשיו, יש לנו כלים העומדים לרשותנו שיכולות לייצר תמונות עם שיפורים 10-fold על רזולוציית עקיפה מוגבלת. במאמר זה נדון הכנת הדוגמא, ייבוא תמונות וניתוח עבור GSD המאפשרים ברזולוציות עד 20 ו 50 ננומטר בממדים לרוחב ו צירית, בהתאמה.

למרות המוקד של פרוטוקול זה הוא על Sec61β ו- CaV1.2 L-סוג Ca2 + ערוצים, הפרוטוקול המתואר לעיל יכולים לשמש כתבנית עבור חוקרים המעוניינים התמונה חלבונים שונים במעבדות שלהם על מיקרוסקופ GSD. התכונות החיוביות של סוג זה של הפרוטוקול הם כי זה פשוט למדי, יכול להיות שונה, להחיל על מספר סוגי תאים שונים, והוא ניתן בקלות להתאים צבע רב הדמיה. המגבלות ברור הם סופר-שפתרון מערכות, מצויד with a מצלמה EM-CCD רגיש המסוגל גילוי מולקולה בודדת, עדיין נוטים להיות יקר מדי עבור מעבדות רבות.

ככל מספר מעבדות המשתמשות סופר-רזולוציה מיקרוסקופ כמו טכניקת דימות המועדפת שלהם גדלים, יותר אחיד בהבנה ובהסכמה נחוץ אודות ייבוא תמונות, עיבוד פרשנות. איך, למשל, אחד לכמת את רמת הקרבה של שני חלבונים יופיעו colocalized פיקסל עקיפה-מוגבלת אך להתברר מציגות למעשה חפיפה מועטה בכלל בסופר רזולוציה תמונה/מפה אכן, תרחיש זה כבר יצא עבור מספר ששוער חלבונים colocalized, כגון הדבקה חלבונים מורכבים paxillin ו- zyxin. ככל שהרזולוציה מיקרוסקופים להשיג תמיד מגדיל, אולי חלבונים כבר לא ידווחו על 'colocalize' אלא יש שאינה אקראית מופץ דפוסי מועדף-לוקליזציה אחד סביב השני. אחרי הכל, זה בלתי אפשרי עבור שני חלבונים לכבוש פיזית בדיוק באותו מרחב תלת-ממדי. כמה פתרונות conundrum ניתוח זו מתחילים להופיע בספרות, כולל ניתוח לוקאליזציה יחסי מבוסס מיקרוסקופיה סטוכסטי שחזור אופטי (סערה-RLA), אשר כפי שנמסר יכולים לכמת את התדירות ואת מידת החפיפה בין שני משותף עם התווית חלבונים, גם מספקים מדידות כמותיים של המרחק בין חלבונים שאינם חופפים13. בעת השוואה בין ערוץ אחד למשנהו ברזולוציה סופר, זה כמובן קריטית כדי לוודא שיש לך רישום נכונים בין שני הערוצים. זה ניתן להעריך באמצעות ננו-ספירה צבע רב חרוזים פלורסנט, הדמיה בכל אחד מהערוצים בודדות ואז שכיסה את התמונות. בנוסף, מאחר SR-GSD מיקרוסקופ 3D יכול לתפקד כמו מיקרוסקופ TIRF וליצור סופר רזולוציה לוקליזציה גם מפות ב- TIRF, חשוב להתאים את עומק החדירה בין ערוצי שני צבעים, כמו שינוי זוויות TIRF תלוי אורך הגל של אור המשמש לגרות את הדגימה.

יתר על כן, כפי שהיא מתוארת 3B איור ותלת מימד איור, מפה לוקליזציה יכולים להופיע שונה לחלוטין תלוי בדרגת 'סף'. אם סף גילוי על ערך נמוך מדי, מבנים עשוי להיראות גדולים יותר הם באמת כמו ההסתברות כי אחד כולל שאינם ספציפיים כדין תיוג של 'רעש' גדל. לעומת זאת, אם מוגדר סף גילוי גבוה מדי, ואז מבנים עשוי להיראות קטן יותר ממה שהם באמת כמו אירועים 'האמיתי' אינם נכללים. לפיכך, קביעת סף צריך להיות מיושם עם סיבה וזהירות. אז איך ניתן לקבוע סף גילוי סביר עבור מדגם נתון? פקדים הם המפתח. כמו עם כל גישה חיסונית-תיוג, פקדים חיוביים ושליליים צריכה להתבצע כדי להדגים יחודיות של נוגדנים. הפקדים המתאימים, זה אפשר להפיק סף גילוי שמעליה רק תיוג ספציפית להתייחס. הפקדים המתאימים כוללים דוגמאות שבו הדגירה נוגדן ראשוני הושמט אז יכול להיות שנצפו מדגם נחשפים רק נוגדנים משניים. מפקד כזה, הכריכה לא ספציפית של נוגדנים משניים מבחינים. במדגם ועשוי היטב, זה אמור לגרום ספירה אירוע קטן הרבה יותר לכל תמונה, כלומר מספר נמוך יותר של פוטונים לפיקסל בהשוואה הדגימה incubated ראשיים ומשניים. אז ניתן להגדיר את סף גילוי של התמונה כך שאינם ספציפיים תיוג ניתן לסלק. הסף זיהוי אותו צריך לשמש לאחר מכן כאשר הדמיה הדגימה incubated ראשיות ומשניות כדי לשפר את הביטחון העצמי הזה 'רעש' חוסלה. פקדים נוספים כוללים את אלה בדיקות יחודיות של נוגדן ראשוני. בתאים transfected, אם החלבון שכותרתו לא מתבטא באופן מקורי בשורה התא, ואז בדיקה פשוטה של יחודיות נוגדן ראשוני הוא ביצוע ההליך תיוג על תאים untransfected. כדי להדגים ירידה לפרטים נוגדן ראשוני בתאים הראשי, נוקאאוט גנטי של החלבון שכותרתו הוא תקן זהב. ניתן להגדיר זיהוי סף גם באמצעות הניסויים שליטה נוגדן ראשוני. בהיעדרו של אנטיגן מטרה, כל פליטת קרינה פלואורסצנטית הוא לא ספציפית. עם הפקדים הבלעדיים משניים, עם נוגדן ראשוני, טוב להתייחס פחות אירועים לכל תמונה, לכן, מעל מספר זהה של מסגרות, נמוך יותר מספר ממוצע של פוטונים לפיקסל צריך להיות ברור. ניתן להגדיר את סף גילוי ובכך לרמה יבטל רקע שאינם ספציפיים מכתים עקב מחייב את המטרה העיקרית נוגדן. על שקיפות מלאה, הוא הציע כי מחברים צריך להציג תמונות עם פרמטרים סף שלהם כתוב במפורש, ואולי עם קישור הנתונים הגולמיים onlinמחסן e.

החוקר גם להישאר מודע לסכנה כי מרובות משני ניתן לאגד נוגדנים נוגדן ראשוני יחיד אז לא צריך להיות הנחתי יחס 1:1 ראשי: תיכון איגוד. יתר על כן, מסחרי נוגדנים משניים הם בדרך כלל מצומדת כדי fluorophores מרובים, למשל, נוגדנים משניים המועסקים פרוטוקול זה מצוינים ע י היצרן כדי להיות מצומדת כדי fluorophores 2-8. כמו לעקוף את זה, fluorophore יכול להיות ישירות מצומדת נוגדן ראשוני. ספקטרופוטומטר יכול לשמש לאחר מכן כדי לקבוע את המספר הממוצע של fluorophores לכל נוגדן ראשוני. מספר ערכות זמינים מסחרית זמינים לביצוע הליך ההטיה. אולם, גם אם סטויכיומטריה 1:1 מושגת, מולקולת fluorophore עצמו יכול ליצור בעיות נוספות overcounting למצמץ ואת החלפת הפיך של fluorophores. בפועל, משמעות הדבר היא כי fluorophore ייתכן מחזור מספר פעמים בין הקרקע לבין עירור פולטות אשכולות של הפוטונים כפי שהיא עושה כך. פוטונים אלה עשויים להתגלות במספר הפיקסלים הסמוכים, להוביל מופרזת של גודל האשכול. חוקרים אחרים עסקו בעיה זו על-ידי בחירת לשלב ניאון פליטת מקובצים באשכולות בתקופה קצרה של זמן ומרחב,16,17. זה בגישה אמפירית במידת מה זה עדיין לא מבטל את האפשרות כי fluorophore אותה יכול מחזור למצב כהה תקופה ארוכה, אז הפוך למצב רכיבה על אופניים/פולט עוד פעם ולהישפט כ מולקולה שנייה. לכן, מספר מולקולות באשכול אין אפשרות לחשב מבוסס אך ורק על גודל האשכול. כרגע, אין פיתרון מושלם לבעיות אלה, ולכן השימוש הדמיה סופר-ברזולוציה בשיתוף עם טכניקה נוספת כגון photobleaching צעד חכם יכול לתת הערכה משוערת של מספר מולקולות לכל אשכול. פקדים רלבנטי להגברת ביטחון במדידות באזור אשכול כוללים השוואת גדלים אשכול של חלבונים monomeric ידוע (למשל, CD86), הידוע dimeric חלבונים (למשל, CTLA-4) לאלה של החלבון של עניין כפי שהוצע על ידי . פריק et al. 18.

לסיכום, במאמר הנוכחי, מוגדר פרוטוקול immunolabeling ישירה הלאה המתארת את הכנת דוגמאות קבוע עבור הדמיה ברזולוציה סופר. בנוסף, נידונות כמה מלכודות נפוצות ב ייבוא תמונות וניתוח. הדמיה ברזולוציה סופר הופך שגרתי יותר, זה עלול להפוך הכרחי עבור יומנים שנקבעו ערכה חדשה של קווים מנחים כדי למנוע מניפולציה לא הולם של מפות אלה תמונות מורכבות/לוקליזציה. מיקרוסקופ ברזולוציה סופר הוסיף כלי חדש חזק ארגז הכלים של ביולוגים תא, biophysicists, כבר עשה רושם יוצא דופן על ההבנה שלנו של אדריכלות הסלולר וארגון מולקולרית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש אינטרסים מתחרים לא לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק של AHA כדי R.E.D. (15SDG25560035). מחברים רוצה להכיר ד ר סנטנה פרננדו לשימוש של מיקרוסקופ 3D שלו לייקה SR GSD. ולעזאזל ד ר יוהנס בחביבות לספק הנוגדן FP1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOH Thermo Scientific P250-500 To clean coverglass
#1.5 coverglass 18 x 18 mm Marienfeld Superior 0107032) To grow/process/image cells
10x PBS Thermo Scientific BP3994 Dilute to 1x with de-ionized water
Poly-L-Lysine Sigma P4832 Aids with cell adhesion to cover glass
laminin Sigma 114956-81-9 Aids with cell adhesion to cover glass
Medium 199 Thermo Scientific 11150-059 Ventricular myocyte culture media
DMEM 11995 Gibco 11995 Cell culture media
Fetal bovine Serum (FBS) Thermo Scientific 10437028 Media supplement
Penicillin/streptomycin Sigma P4333 Media supplement
0.05% trypsin-EDTA Corning 25-052-CL Cell culture solution
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019 Transient transfection reagent
Ca2+-free PBS Gibco 1419-144 Cell culture
100 % Methanol Thermo Fisher Scientific A414-4 Cell Fixation
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Cell Fixation
Glutaraldehyde Sigma Aldrich SLBR6504V Cell Fixation
SEAblock Thermo Scientific 37527 BSA or other blocking solution alternatives exist
Triton-X 100 Sigma T8787 Detergent to permeabilize cells
Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) Gift N/A Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003)
Mouse monoclonal anti-RFP Rockland Inc. 200-301-379 Primary antibody
Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen (Thermo Scientific) A31573 Secondary antibody
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen (Thermo Scientific) A11031 Secondary antibody
Sodium azide Sigma S2002 Prevents microbial growth for long term storage of samples
Catalase Sigma C40 Photoswitching buffer ingredient
Glucose oxidase Sigma G2133 Photoswitching buffer ingredient
Tris Sigma T6066 Photoswitching buffer ingredient
beta-Mercaptoethylamin hydrochloride Fisher BP2664100 Photoswitching buffer ingredient
β-mercaptoethanol Sigma 63689 Photoswitching buffer ingredient
NaCl Fisher S271-3 Photoswitching buffer ingredient
Dextrose Fisher D14-212 Photoswitching buffer ingredient
Glass Depression slides Neolab 1 – 6293 To mount samples
Twinsil Picodent 13001000 To seal coverglass
sec61β-mCherry plasmid Addgene 49155
Leica SR GSD 3D microscope Leica
ImageJ
Washing block solution 20 % SEAblock in PBS
Primary antibody incubation solution 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS
Secondary antibody incubation solution 1:1000 in PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
  2. Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
  3. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  4. Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit. JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
  5. Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving. Phys Rev Lett. 98 (21), 218103 (2007).
  6. Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (58), e3302 (2011).
  7. Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase. J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).
  8. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  9. Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging. FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).
  10. Dempsey, G. T., et al. Photoswitching mechanism of cyanine dyes. J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).
  11. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
  12. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  13. Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
  14. Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies. Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).
  15. Dixon, R. E., et al. Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels. Elife. 4, (2015).
  16. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
  17. Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).
  18. Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy. Sci Rep. 5, 14072 (2015).

Tags

ביולוגיה מבנית גיליון 129 CaV1.2 מיקרוסקופיה קונפוקלית תוך-פלזמית (ER) סופר רזולוציה בסך הכל השתקפות פנימית קרינה פלואורסצנטית (TIRF) מיקרוסקופיה ערוצי סידן מתח מגודרת מיקרוסקופיה המחסור בקרקע ואחריו מולקולה בודדת להחזיר (GSDIM)
הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dixon, R. E., Vivas, O., Hannigan,… More

Dixon, R. E., Vivas, O., Hannigan, K. I., Dickson, E. J. Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (129), e56239, doi:10.3791/56239 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter