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Biology

स्तनधारी कोशिकाओं में जमीन राज्य घट सुपर संकल्प इमेजिंग

Published: November 5, 2017 doi: 10.3791/56239
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Physiology and Membrane Biology, University of California School of Medicine, Davis

Summary

यह लेख एक या एक से अधिक प्लाज्मा और/या intracellular झिल्ली प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल रूपरेखा जमीन राज्य घट (GSD) स्तनधारी कोशिकाओं में सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर । यहां, हम दृश्य और सेलुलर प्रोटीन के ठहराव के लिए इस तरह के दृष्टिकोण का उपयोग करने के लाभों और विचार पर चर्चा ।

Abstract

फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और सेल जीव विज्ञान में अग्रिमों परिचित सेलुलर घटनाओं अक्सर कैसे कोशिकाओं के कार्य की हमारी समझ में नाटकीय छलांग के लिए अग्रणी कल्पना करने के लिए बढ़ाया क्षमता के साथ, संबंधित हैं । विकास और सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी की उपलब्धता काफी ~ 250-20 एनएम से ऑप्टिकल संकल्प की सीमा बढ़ा दिया है । जीव अब एक विवर्तन सीमित क्षेत्र के भीतर colocalization के संदर्भ में आणविक बातचीत का वर्णन करने के लिए सीमित हैं, बल्कि यह अब व्यक्तिगत अणुओं के गतिशील बातचीत कल्पना करने के लिए संभव है । यहां, हम निश्चित सेल इमेजिंग के लिए जमीन-राज्य घट माइक्रोस्कोपी द्वारा दृश्य और सेलुलर प्रोटीन के ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल रूपरेखा । हम दो अलग झिल्ली प्रोटीन, endoplasmic जालिका translocon, sec61β, और एक प्लाज्मा झिल्ली-स्थानीयकृत वोल्टेज-gated एल प्रकार ca2 + चैनल (caV१.२) के एक तत्व से उदाहरण प्रदान करते हैं । चर्चा विशिष्ट माइक्रोस्कोप मापदंडों, निर्धारण तरीके, फोटो स्विचन बफर निर्माण, और नुकसान और छवि प्रसंस्करण की चुनौतियों का सामना कर रहे हैं ।

Introduction

सेलुलर संकेत प्रतिक्रियाओं आंतरिक और बाह्य वातावरण बदलने के लिए एक सेलुलर प्रतिक्रिया शुरू अनुवाद । वे मानव शरीर क्रिया विज्ञान के सभी पहलुओं को विनियमित, हार्मोन और न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई के लिए नींव के रूप में सेवारत, दिल की धड़कन, दृष्टि, निषेचन, और संज्ञानात्मक समारोह. इन संकेतन कैस्केडिंग के विघटन से कैंसर, पार्किंसंस, और अल्जाइमर रोग सहित pathophysiological शर्तों के रूप में गंभीर परिणाम हो सकते हैं । दशकों के लिए, जैविक और चिकित्सा जांचकर्ताओं को सफलतापूर्वक फ्लोरोसेंट प्रोटीन, जांच का इस्तेमाल किया है, और प्राथमिक उपकरणों के रूप में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ मिलकर जैव संवेदी इन सेलुलर के सटीक स्थानिक और लौकिक संगठन को समझने के लिए संकेतों.

ऐसे epifluorescence, फोकल, या कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी के रूप में ऑप्टिकल तकनीक की ताकत है उनकी संवेदनशीलता, गति, और लाइव सेल इमेजिंग के साथ संगतता, जबकि प्रमुख सीमा है उनके विवर्तन-सीमित संकल्प, अर्थ संरचनाओं या प्रोटीन परिसरों से छोटे 200-250 एनएम हल नहीं किया जा सकता है । नियतात्मक सुपर संकल्प के सैद्धांतिक और व्यावहारिक विकास के साथ (जैसे, प्रेरित उत्सर्जन कमी माइक्रोस्कोपी (STED1), संरचित दीप्ति माइक्रोस्कोपी (सिम2) या stochastic सुपर संकल्प (उदा. , photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम3), या जमीन राज्य घट (GSD4,5)), पार्श्व और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में अक्षीय संकल्प विवर्तन बाधा से परे बढ़ाया गया है, के आदेश के लिए दसियों nanometers. इस प्रकार, अब जांचकर्ताओं को कल्पना और समझ कैसे प्रोटीन गतिशीलता और संगठन के निकट आणविक स्तर पर समारोह में अनुवाद करने के लिए अद्वितीय क्षमता है ।

जमीन राज्य कमी व्यक्तिगत अणु वापसी (GSDIM), या बस GSD के रूप में यह जाना जाता है के बाद माइक्रोस्कोपी, एक साथ fluorophores4उत्सर्जक की संख्या को कम करने के द्वारा विवर्तन सीमा को दरकिनार,5. उच्च ऊर्जा लेजर प्रकाश fluorophore-लेबल नमूना उत्तेजित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, फोटॉनों के साथ इलेक्ट्रॉनों बमबारी और संभावना वे एक ' स्पिन-फ्लिप ' से गुजरना और triplet या ' डार्क-राज्य ' से उत्तेजित राज्य4में प्रवेश करेंगे बढ़ रही है । यह प्रभावी ढंग से जमीनी राज्य को चूस रहा है, इसलिए नाम ' जमीन राज्य घट '. triplet अवस्था में, fluorophores नहीं उत्सर्जन फोटॉनों और नमूना dimmer दिखाई देता है । हालांकि, इन fluorophores stochastically जमीन राज्य के लिए वापस और कई फोटॉन उत्सर्जित करने वाली जमीन राज्य संक्रमण triplet राज्य में लौटने से पहले उत्सर्जन के माध्यम से जा सकते हैं । कम किसी भी समय उत्सर्जन fluorophores के साथ, फोटॉन व्यक्तिगत fluorophores से उत्सर्जित फटने स्थानिक और अस्थाई पड़ोसी fluorophores से अलग हो जाते हैं । फोटॉनों के फट एक गाऊसी समारोह के साथ फिट हो सकता है, जो की गणना की केन्द्रक एक स्थानीयकरण परिशुद्धता के साथ fluorophore की स्थिति के अनुरूप है कि लेंस के संख्यात्मक एपर्चर (ना) पर निर्भर है, प्रकाश की तरंग दैर्ध्य के लिए इस्तेमाल किया उत्तेजना और महत्वपूर्ण रूप से, प्रति fluorophore उत्सर्जित फोटॉनों की संख्या । GSD की एक सीमा है कि, के बाद से ही fluorophores का एक सबसेट सक्रिय रूप से किसी भी समय उत्सर्जन करता है, छवियों के हजारों कई मिनट से अधिक एकत्र किया जाना चाहिए करने के लिए एक पूरा स्थानीयकरण नक्शा का निर्माण । लंबे समय अधिग्रहण उच्च लेजर शक्ति की आवश्यकता के साथ संयुक्त, इसका मतलब है कि GSD बेहतर रहने के नमूनों के बजाय तय करने के लिए अनुकूल है ।

यह लेख, झिल्ली और endoplasmic जालिका के सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए तय नमूनों की तैयारी का वर्णन (एर)-निवासी प्रोटीन (आवश्यक उपभोग्य सामग्रियों की एक सूची और रिएजेंट के लिए सामग्री की तालिकादेखें) । इस प्रोटोकॉल के उदाहरण कैसे आसानी से आकार और एल प्रकार वोल्टेज के clustering के डिग्री-gated ca2 + चैनल (cav१.२) कार्डियक myocytes के sarcolemma में, या उपयोग के सेलुलर वितरण कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है एर, प्रदर्शन कर रहे हैं । इन सेलुलर घटकों के वितरण और संगठन को समझना अत्यंत महत्वपूर्ण है दीक्षा, अनुवाद को समझने में, और अंततः कई Ca के समारोह2 +-निर्भर संकेत कैस्केडिंग । उदाहरण के लिए, cav१.२ चैनल उत्तेजना-संकुचन युग्मन के लिए मौलिक रूप से महत्वपूर्ण हैं, जबकि रिसेप्टर से मध्यस्थता2 + रिलीज एर शायद स्तनधारी कोशिकाओं में सबसे सर्वव्यापी संकेत झरना है ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. वाशिंग ग्लास Coverslips

  1. दिन से पहले नमूना प्रसंस्करण, साफ #1 .5 ग्लास Coverslips द्वारा 1 एच के लिए 1 M समाधान KOH में sonicating । इस coverslips. पर मौजूद हो सकता है कि किसी भी फ्लोरोसेंट दूषित पदार्थों को हटा
    1. अच्छी तरह से coverslips से KOH कुल्ला de-जल के साथ ।
    2. एक बार KOH में साफ, ७०% इथेनॉल में coverslips स्टोर का उपयोग करने के लिए तैयार जब तक ।
< p class = "jove_title" > 2. कोटिंग ग्लास Coverslips

< p class = "jove_content" > नोट: इस खंड में दिए गए चरणों को दूषित होने से रोकने के लिए एक सेल कल्चर हुड में किया जाना चाहिए ।

  1. ७०% इथेनॉल समाधान और तेजी से अतिरिक्त निकालने के लिए लौ से एक व्यक्ति coverslip को दूर करने के लिए संदंश का उपयोग करें । coverslips को 6-वेल प्लेट में रखें । अगर एक संस्कृति हुड में ज्वलंत एक विकल्प नहीं है, पर विचार autoclaving de-जल और/या संस्कृति हूड में यूवी प्रकाश के तहत कम 30 min.
    2. के लिए के साथ धोने के बाद coverslips ।
  2. कोशिकाओं के आसंजन सहायता करने के लिए, कोट coverslips के साथ बाँझ ०.०१% पाली-एल-lysine के लिए 1 ज कमरे के तापमान पर.
  3. महाप्राण के पाली-L-lysine और कुल्ला बाँझ फॉस्फेट (पंजाब) खारा के साथ coverslips । हवा सूखी और फ्रिज में जगह रात भर ।
    4. अगली सुबह
  4. , रेफ्रिजरेटर से coverslips को हटा दें और laminin के ३०० & #181; L की एकाग्रता पर, ५० & #181; g/एमएल के लिए, कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए । सुनिश्चित करें कि laminin ध्यान से सीधे coverslip.
    पर रखा गया है नोट: यह laminin कदम क्योंकि-7 कोशिकाओं या HEK293 कोशिकाओं के लिए आवश्यक नहीं है, लेकिन अलग वेंट्रिकुलर myocytes के लिए आवश्यक है । संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं या ंयूरॉंस के रूप में अंय प्राथमिक कोशिकाओं कोलेजन या fibronectin लेपित coverslips के लिए बेहतर पालन कर सकते हैं ।
< p class = "jove_title" > 3. सेल की तैयारी

  1. प्रसंस्कृत कोशिकाओं
    1. बढ़ने क्योंकि-7 कोशिकाओं (या पसंदीदा सेल लाइन) 10 मिलीलीटर Dulbecco & #39 में 10 सेमी संस्कृति पकवान पर; s संशोधित ईगल्स मध्यम (DMEM) संस्कृति मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% के साथ पूरक पेनिसिलिन/streptomycin (PS) समाधान । एक सेल संस्कृति मशीन में कोशिकाओं के बढ़ने पर ३७ & #176; ग र 5% सह 2 .
    2. जब कोशिकाओं ९०% प्रवाह तक पहुंचने, उंहें 10 सेमी डिश से DMEM मीडिया aspirating और ०.०५% trypsin-EGTA समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ने से फसल । एक बार कोशिकाओं को और अलग दौर शुरू, तुरंत पूरक DMEM के साथ Trypsin बेअसर ।
      1. डिश से कोशिकाओं को हटाने के लिए एक 5 मिलीलीटर सीरम पिपेट का उपयोग करें । पिपेट डिश के आधार के खिलाफ माध्यम से कई बार किसी भी कोशिकाओं है कि अनुयाई रहने को दूर करने के लिए और homogenously संस्कृति माध्यम भर में कोशिकाओं को वितरित करने के लिए ।
    3. प्लेट कोशिकाओं पर ३५ mm संस्कृति व्यंजन अभिकर्मक के लिए ७०% प्रवाह को प्राप्त करने के लिए । डिश में मध्यम की मात्रा बनाने के लिए ताजा DMEM/FBS/PS समाधान के साथ 2 मिलीलीटर तक ।
    4. Transfect क्योंकि-7 कोशिकाएं वांछित प्लाज्मिड डीएनए का निर्माण करती हैं ( जैसे , sec61 & #946;-mCherry प्लाज्मिड), एक उपयुक्त अभिकर्मक रिएजेंट का प्रयोग और निर्माता के अनुसार & #39; s निर्देश.
      नोट: यह प्रोटीन के लिए 24-48 ज लग सकता है व्यक्त करने के लिए, प्लाज्मिड और/या अभिकर्मक का इस्तेमाल किया एजेंट के आधार पर ।
  2. वयस्क माउस वेंट्रिकुलर myocytes
    1. अलग वयस्क माउस वेंट्रिकुलर myocytes का उपयोग अच्छी तरह से स्थापित Langendorff छिड़काव विधि < सुप वर्ग = "xref" > ६ . पुनः निलंबित मध्यम १९९ में myocytes के परिणामस्वरूप गोली (M199) २.५% FBS और 1% PS.
      2. के साथ पूरक
< p class = "jove_title" > 4. चढ़ाना कोशिकाओं

  1. Transfected क्योंकि-7 कोशिकाओं
    1. महाप्राण 2 मिलीलीटर DMEM/FBS/PS समाधान ३५ mm डिश से और जोड़ें 1 एमएल Ca 2 + -मुक्त पंजाबियों । डिश से 2 min. हार्वेस्ट कोशिकाओं के लिए पकवान वापस पहले aspirating द्वारा Ca 2 + मुक्त पंजाबियों और फिर जोड़ने ०.०५% trypsin-EGTA समाधान के 1 मिलीलीटर ।
      1. एक बार कोशिकाओं को गोल और अलग, तुरंत पूरक DMEM के 1 मिलीलीटर के साथ Trypsin बेअसर शुरू करते हैं । धीरे transfected कोशिकाओं को समान रूप से 2 मिलीलीटर trypsin-EGTA-DMEM निलंबन भर में वितरित कर रहे है सुनिश्चित करने के लिए ऊपर और नीचे कई बार पिपेट ।
    2. प्लेट transfected-7 पाली पर कोशिकाओं-एल-lysine एक उचित घनत्व पर लेपित coverslips ताकि एकल कोशिकाओं visualized किया जा सकता है, और डिश की मात्रा को DMEM/FBS/PS ( जैसे के साथ 2 मिलीलीटर तक भरें, ९० & #181 जोड़ें; एल सेल सस्पेंशन को coverslip फिर जोड़ १,९१० & #181; L पूरण DMEM, भंवरी पकवान समान रूप से कोशिकाओं को वितरित करने के लिए).
      नोट: कक्षों को गिनाने की आवश्यकता नहीं है लेकिन प्रत्येक डिश में जोड़े जाने वाले कक्षों की मात्रा कक्षों के प्रवाह के आधार पर भिन्न होगी.
    3. सेल संस्कृति मशीन के लिए वापस चढ़ाया कोशिकाओं का पालन करें और ठीक करने के लिए कोशिकाओं की अनुमति देने के लिए ।
  2. वयस्क माउस वेंट्रिकुलर myocytes
    1. महाप्राण laminin और प्लेट एक उचित घनत्व पर सीधे लेपित myocytes पर coverslips ताकि व्यक्तिगत कोशिकाओं visualized किया जा सकता है । यह व्यावहारिक अलगाव से प्राप्त कोशिकाओं के घनत्व पर निर्भर करेगा ।
    2. ३७ & #176 पर एक सेल कल्चर मशीन में coverslip और जगह पर एक गुंबद में सेल निलंबन संतुलन; सी और 5% सह 2 ~ ४५ मिनट के लिए आसंजन की अनुमति है ।
< p class = "jove_title" > 5. कोशिकाओं का निर्धारण

  1. मशीन से कोशिकाओं को हटाने और ध्यान से मध्यम महाप्राण.
    1. अनुयाई कोशिकाओं को एक बार पंजाबियों के साथ कुल्ला ।
    2. व्यक्तिगत आवेदन और एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित एक निर्धारण के साथ कोशिकाओं को ठीक ।
      नोट: एक निर्धारण का चयन करते समय ध्यान में रखने के लिए एक महत्वपूर्ण कसौटी नमूने की सेलुलर संरचना का संरक्षण है, जबकि यह भी सुनिश्चित करना है कि वहां के हित के प्रतिजन में कोई गठन परिवर्तन है । 3% paraformaldehyde/0.1% glutaraldehyde (पीएफए/GA) के साथ इस प्रोटोकॉल निर्धारण के प्रयोजनों के लिए और १००% मेथनॉल के साथ निर्धारण की चर्चा की है ।
  2. पीएफए/गा निर्धारण transfected के रूप में-7 कोशिकाओं को व्यक्त Sec61 & #946;-mCherry
    1. मिश्रण १.९ मिलीलीटर 16% पीएफए और 20 & #181; L ५०% GA और जोड़ने के लिए 10 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा बनाने के लिए पंजाब.
    2. जोड़ें 1 मिलीलीटर ताजा तैयार पीएफए/गा समाधान कोशिकाओं के प्रत्येक डिश के लिए और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए फिक्स ।
    3. महाप्राण पीएफए/GA और कुल्ला कोशिकाओं 3 बार पंजाबियों के साथ ।
    4. पंजाबियों के साथ पालन कोशिकाओं को धो, 5 मिनट प्रत्येक के लिए 5 बार । एक रोटेटर पर एक मध्यम गति ( जैसे , ५० चक्र प्रति मिनट) के लिए सेट पर सभी धुलाई चरणों का पालन करें ।
    5. अगले, 1 मिलीलीटर के साथ मुक्त एल्डिहाइड समूहों को कम हौसले से तैयार ०.१% जन/डी-जल में मात्रा सोडियम borohydride ।
    6. कुल्ला कोशिकाओं को दो बार तो 5 मिनट के लिए पंजाब में प्रत्येक 3 समय धोने के लिए सोडियम borohydride और शराब के सभी निशान हटाने यह उत्पादन जब यह मुफ्त aldehydes.
      7. के साथ प्रतिक्रिया करता है
  3. मेथनॉल निर्धारण के वयस्क चूहे वेंट्रिकुलर myocytes
    1. ध्यान से 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा १००% मेथनॉल कोशिकाओं को जोड़ें । 6-वेल प्लेट को झुकाएं और मेथनॉल को पिपेट के बजाय सीधे coverslip पर साइड वॉल से घुमाएं । फिर मेथनॉल को समान रूप से धोने की अनुमति देने के लिए 6-वेल प्लेट को वापस क्षैतिज पर झुकाएं कोशिकाओं पर । 5 मिनट के लिए फिक्स at-20 & #176; C.
    2. महाप्राण के निर्धारण और कुल्ला कोशिकाओं 3 बार पंजाबियों के साथ ।
    3. पंजाबियों, 5 मिनट के लिए 5 बार एक रोटेटर पर प्रत्येक के साथ पालन कोशिकाओं धो लो ।
< p class = "jove_title" > 6. ब्लॉकिंग समाधान में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए गैर-विशिष्ट बाइंडिंग

  1. ब्लॉक अवरुद्ध (सामग्री की तालिका देखें).
    नोट: विभिन्न समाधान गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग को ब्लॉक करने के लिए उपयोग किया जा सकता है जिसमें 3% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) या गैर-प्रतिरक्षा सीरम एक ही प्रजाति से प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में.
< p class = "jove_title" > 7. डिटेक्शन

  1. प्राथमिक एंटीबॉडी मशीन
    1. महाप्राण अवरोधक समाधान । धो या कुल्ला मत करो ।
    2. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निम्नानुसार तैयार करें (step 7.1.5 देखें): प्राथमिक एंटीबॉडी को एकाग्रता से पतला करना 10 & #181; g/mL (या निर्माता & #39; s सुझाया गया एकाग्रता) एंटीबॉडी मशीन समाधान में (सामग्री की तालिका देखें ). coverslip पर इस छोटी मात्रा के संतुलन और ध्यान से शीर्ष पर प्लास्टिक आयल फिल्म का एक वर्ग सेट । यह coverslip और वाष्पीकरण के खिलाफ गार्ड पर एंटीबॉडी की छोटी मात्रा में फैलाने में मदद करता है.
    3. एक आर्द्रता कक्ष में 6 अच्छी तरह से थाली जगह और फ्रिज में रात भर गर्मी ।
      4. सुबह
    4. , आर्द्रता कक्ष से कोशिकाओं को हटा दें, ध्यान से आयल फिल्म स्क्वायर को coverslip की सतह से हटा दें और प्राथमिक एंटीबॉडी हल महाप्राण ।
    5. के साथ 3 बार कुल्ला, फिर धुलाई ब्लॉक समाधान के साथ 5 मिनट के लिए 5 बार धो ( सामग्री की तालिका देखें) रोटेटर पर ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है निम्नलिखित एंटीबॉडी, एंटी-आरएफपी माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी में प्रदर्शित छवियों के लिए < सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्रा 2       और खरगोश polyclonal FP1 < सुप वर्ग = "xref" > 7 एंटी-सीए वी १.२ एंटीबॉडी (प्रो से एक उपहार । जोहांस नरक, यूसी डेविस) में प्रदर्शित छवियों के लिए < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ३ . नमी चैंबर, एक तंग फिटिंग ढक्कन के साथ एक प्लास्टिक के खाने का डिब्बा करने का संबंध है, गीले कागज तौलिए से लाइन में काम करता है । पंजाबियों धुलाई कदम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस प्रोटोकॉल लेबल विशिष्टता में सुधार और एक पतला कदम धोने के लिए अवरुद्ध समाधान का उपयोग करके पृष्ठभूमि कम कर देता है ।
  2. माध्यमिक एंटीबॉडीं
    1. महाप्राण धुलाई समाधान और जोड़ २०० & #181; L संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान पतला 1:1000 एंटीबॉडी में समाधान । coverslip के शीर्ष पर आयल फिल्म का एक वर्ग प्लेस (कदम 7.1.2 देखें) ।
    2. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
    3. महाप्राण माध्यमिक एंटीबॉडी और कुल्ला पंजाबियों के साथ 3 बार ।
    4. धो कोशिकाओं के साथ पतला समाधान 5 मिनट के लिए 5 बार झूली कुरसी पर अवरुद्ध ।
    5. धो 3 पंजाबियों के साथ 5 मिनट के लिए बार ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल विरोधी माउस alexa ६४७ संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी और विरोधी खरगोश alexa ६४७ के उपयोग का वर्णन संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी < सबल वर्ग के लिए = "xfig" > चित्रा २ र < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ३ , क्रमशः । एकल प्रोटीन लेबलिंग के लिए, Alexa ६४७ अपने उच्च फोटॉन गिनती के कारण पसंदीदा fluorophore है (स्थानीयकरण परिशुद्धता में सुधार) और कम शुल्क चक्र (लौकिक संकल्प में सुधार) < सुप वर्ग = "xref" > ८ . कई अन्य fluorophore-संयुग्मित सेकंडरी एंटीबॉडी विकल्प जैसे अॅटॅ या Cy-रंजक उपलब्ध हैं. Dempsey एट अल. को देखें < सुप वर्ग = "xref" > 8 आणि Chozinski एट अल. < सुप क्लास = "xref" > 9 सुपर-रेजोल्यूशन इमेजिंग के लिए कई fluorophores/रंजक की उपयुक्तता के व्यापक मूल्यांकन के लिए
< p class = "jove_title" > 8. पद-निर्धारण (वैकल्पिक कदम)

  1. पतला ५० & #181; L ५०% ga 10 मिलीलीटर पंजाब में एक ०.२५% ga समाधान प्राप्त करने के लिए । इस समाधान में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए बाद फिक्स कोशिकाओं ।
  2. एक रोटेटर पर 5 मिनट के लिए 3 बार पंजाबियों के साथ धो लें ।
< p class = "jove_title" > 9. नमूनों का भंडारण

  1. स्टोर नमूनों में फ्रिज (4 & #176; सी) में एक एल्यूमीनियम पंनी लाइन में खड़ा कंटेनर इमेजिंग तक प्रकाश से बचाने के लिए ।
    2. नमूनों की दीर्घकालिक भंडारण के लिए
  2. (कई महीनों तक), बैक्टीरिया के विकास को रोकने के लिए 3 मिमी सोडियम azide युक्त पंजाब में स्टोर.
< p class = "jove_title" > 10. GSD सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग Photoswitching बफर वडा

  1. तैयार ऑक्सीजन सफ़ाई & #39; GLOX & #39; समाधान निम्नानुसार:
    1. एक १.५ एमएल microcentrifuge ट्यूब, add १२.५ & #181; L catalase (शेयर ३४ मिलीग्राम/एमएल), ३.५ मिलीग्राम ग्लुकोज oxidase, व ०.५ & #181; l 1 M Tris (pH = 8) ते ४९.५ & #181; l पंजाबस.
    2. भंवर संक्षेप में समाधान में घटकों को भंग करने के लिए तो २०,८०० पर 3 मिनट के लिए एक्स जी में केंद्रापसारक 4 & #176; C.
      नोट: GLOX जैसे ऑक्सीजन सफ़ाई समाधान photobleaching का विरोध करने के लिए पाया गया है । GLOX को एक सप्ताह तक फ्रिज में रखना चाहिए । हर बार यह प्रयोग किया जाता है केंद्रापसारक कदम दोहराने ।
  2. तैयार photoswitching-उत्प्रेरण thiol समाधान निम्नानुसार हैः
    1. तैयार १०० mM & #946;-mercaptoethylamine (मेे) पंजाब में समाधान और पीएच 8 को संशोधित करना या वैकल्पिक रूप से उपयोग & #946;-mercaptoethanol (& #946; ME). स्टोर aliquoted मेे हल फ्रीजर में (-20 & #176; ग) 1 सप् ताह तक के लिए ।
  3. तुरंत इमेजिंग से पहले, बर्फ पर thiol और ऑक्सीजन सफाई घटकों को एक साथ जोड़कर अंतिम स्विचन बफर तैयार करते हैं । के लिए ५०० & #181; L GLOX-मेे, add 5 & #181; l GLOX को ५० & #181; l मेे (pH = 8) और ४४५ & #181; l खारा बफर (२.५ एमएल 1 एम Tris पीएच = 8, २९.२२ मिलीग्राम NaCl (10 मिमी अंतिम एकाग्रता), 5 ग्राम ग्लूकोज और ४७.५ मिलीलीटर पानी) । वैकल्पिक रूप से, for GLOX-& #946; त i हल add 5 & #181; l GLOX 5 & #181; l & #946; त i व ४९० & #181; l खारा बफर.
    1. बर्फ पर समाधान रखने के लिए और कांच अवसाद स्लाइड पर नमूने माउंट करने के लिए आवश्यक के रूप में उपयोग करें ।
      नोट: Thiol युक्त समाधान जैसे & #946; मुझे या मेे प्रेरित photoswitching के cyanine आधारित रंगों जैसे alexa 647 < सुप वर्ग = "xref" > 10 या xanthene आधारित रंजक जैसे alexa ५६८. & #946; मुझे alexa ६४७ के साथ बेहतर परिणाम देता है, जबकि विदेश मंत्रालय alexa ५६८ के लिए पसंद किया जाता है या जब 2 प्रोटीन के लिए एक डबल लेबलिंग दोनों Alexa ५६८ और ६४७ का उपयोग दृष्टिकोण के साथ छवि हो रहे हैं । बफर अंलीकरण के कारण घंटे की अवधि से अधिक खराब हो जाएगा । इससे सैंपल की औसत फोटॉन काउंट में कमी आएगी । इसे रोकने के लिए, यह 2-3 ज के बाद ताजा photoswitching बफर बनाने के लिए सलाह दी जाती है या तो औसत फोटॉन गिनती में एक बूंद या समय की एक उल्लेखनीय विस्तार प्रेरित photoswitching के लिए लिया है मनाया । हाल के एक लेख एक नई इमेजिंग बफर बैल-EA जो हम अभी तक परीक्षण नहीं किया है, लेकिन कथित तौर पर कई दिनों के लिए स्थिर पीएच स्तर प्रदर्शित करता है और बहु रंग इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए GLOX से बेहतर प्रदर्शन वर्णित है < सुप वर्ग = "xref" > ११ .
< p class = "jove_title" > 11. बढ़ते नमूने

  1. माउंट coverslips लेबल कक्षों के साथ (अनुभाग 1-9 देखें) अवसाद स्लाइड पर, का उपयोग कर १०० & #181; L इमेजिंग बफ़र.
  2. एक सिलिकॉन गोंद के साथ coverslip के किनारों सील इमेजिंग बफर के तेजी से ऑक्सीकरण रोकने के लिए । कई मिनट रुको जब तक सिलिकॉन गोंद पूरी तरह से ठीक हो गया है अंयथा coverslip बहाव जब इमेजिंग होगा ।
    नोट: सिलिकॉन गोंद कठोर नहीं होगा अगर यह & #946 के साथ संपर्क में आता है; हो coverslip के किनारों शुष्क करने के लिए सिलिकॉन गोंद इमेजिंग बफर से संपर्क करने से रोकने के लिए सुनिश्चित करें ।
< p class = "jove_title" > 12. छवि अधिग्रहण

  1. < सशक्त वर्ग में उपयोग किए गए इमेजिंग पैरामीटर्स की सूची के लिए तालिका 1 देखें = "xfig" > आरेख 2 और < सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्र 3 .
    1. शुरू करने के लिए, चयनित fluorophore के आधार पर नमूना रोशन करने के लिए उपयुक्त लेजर का चयन करें । इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया SR-GSD प्रणाली उच्च शक्ति पराबैंगनीकिरण के साथ सुसज्जित है (४८८ एनएम, १.४ किलोवाट/cm 2 ; ५३२ एनएम, २.१ किलोवाट/cm 2 ; ५६१ एनएम, २.१ किलोवाट/cm 2 ६४२ एनएम, २.१ किलोवाट/सेमी 2 ) । < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ६४२ एनएम लेजर का इस्तेमाल किया ।
  2. एक उच्च एनए के साथ एक तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस का उपयोग करें । यहां इस्तेमाल किया SR-GSD प्रणाली एक एचसी PL एपीओ 160X/
    3. से सुसज्जित है
  3. ने उपयुक्त dichroic इमेजिंग क्यूब को चुना । इस प्रोटोकॉल में SR-GSD प्रणाली ४८८ एचपी-टी, ५३२ एचपी-टी, ५६८ एचपी-टी, ६४२ एचपी-टी से उत्सर्जन बैंड-पास फिल्टर के साथ 505-605 एनएम, 550-650 एनएम, और 660-760 एनएम के साथ सुसज्जित है ।
  4. 2 डी अधिग्रहण मोड का चयन करें । 10 ms (१०० हर्ट्ज) के लिए फ्रेम हस्तांतरण मोड और जोखिम समय के लिए कैमरा सेट करें । ३०० को EM लाभ सेट करें । पता लगाना थ्रेशोल्ड का चयन करें ।
    नोट: कम थ्रेसहोल्ड उच्च पृष्ठभूमि के साथ छवियों का उत्पादन. उच्च थ्रेसहोल्ड ब्याज के संकेत को फ़िल्टर कर सकते हैं । जैसे गैर-transfected कोशिकाओं या कक्षों की इमेजिंग coverslips जैसे नकारात्मक नियंत्रणों पर आधारित थ्रेशोल्ड को केवल द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ निर्धारित करें.
  5. ऑटो ईवेंट नियंत्रण पर बारी और छवियों के प्रति घटनाओं सेट करने के लिए 8.
  6. GSD-प्राप्ति टैब में पिक्सेल आकार दर्ज करें (10 एनएम या 20 एनएम पिक्सेल आकार के साथ शुरू) । सुनिश्चित करें कि & #34; हिस्टोग्राम मोड & #34; छवि प्राप्ति से पहले उच्च रिज़ॉल्यूशन छवि परिकलन विकल्प के अंतर्गत GSD उपकरण टैब में चयनित है.
  7. प्लाज्मा झिल्ली में छवि प्रोटीन के लिए, TIRF मोड का चयन करें और प्रवेश गहराई निर्धारित करने के लिए घटना कोण को संशोधित.
  8. डार्क राज्य के लिए इलेक्ट्रॉनों भेजने के लिए (पंप कहा जाता है), १००% करने के लिए लेजर तीव्रता सेट.
  9. चयन एकल अणु का पता लगाने जबकि पंप और स्वचालित रूप से प्राप्त करने के लिए सेट जब फ्रेम सहसंबंध ०.२० है ।
    10. अधिग्रहण के लिए
  10. , ५०% करने के लिए लेजर तीव्रता सेट.
  11. ६०,०००.
    करने के लिए प्राप्ति फ़्रेम की संख्या सेट करें नोट: जांचकर्ता एक नमूना इस से अधिक या कम फ़्रेम की आवश्यकता है कि मिल सकती है । fluorophore photobleaching की टिप्पणियों के आधार पर फ़्रेम गणना को संशोधित करें और जब कोई आगे इवेंट detectable हैं, तो प्राप्ति रोक ।
  12. सुरु अर्ज.
    नोट: अधिग्रहण की शुरुआत में, सभी डाई अणुओं फ्लोरोसेंट राज्य में हैं और फिर अंधेरे राज्य के लिए स्विच. जब फ़्रेम सहसंबंध ०.२० तक पहुंच जाता है, तो छवियां प्राप्त करना प्रारंभ कर देगी । जब प्रति फ़्रेम से कम 8 घटनाओं का पता लगाया है, ४०५ लेजर पर स्विच करेंगे, fluorophores को प्रोत्साहित करने के लिए अंधेरे राज्य से जमीन राज्य के लिए संक्रमण । n के एक डेटासेट के लिए छवियों को प्राप्त करते समय = x कोशिकाओं से n = y पशुओं, जैसे TIRF पैठ गहराई, पता लगाने सीमा, और प्राप्त फ्रेम की संख्या के रूप में मानकों को लगातार रखा जाना चाहिए.
< p class = "jove_title" > 13. छवि विश्लेषण

  1. प्रोटीन क्लस्टर आकार को बढ़ाता है, का उपयोग & #39; विश्लेषण कण & #39; सुविधा of ImageJ.
    नोट: इसके अलावा विश्लेषण stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी आधारित सापेक्ष स्थानीयकरण विश्लेषण (स्टॉर्म-आरएलए) या समान < सुप वर्ग = "xref" > 13 का उपयोग किया जा सकता है ।
    1. निष्पादन क्लस्टर विश्लेषण (< सशक्त वर्ग = "xfig" > आरेख 3 ) ImageJ का उपयोग निम्नानुसार:
    2. छवि फ़ाइल को खोलने के लिए विश्लेषण किया जा करने के लिए । यह एक 10 एनएम हिस्टोग्राम एकल अणु स्थानीयकरण नक्शा (खंड 12) ऊपर वर्णित इमेजिंग सॉफ्टवेयर में उत्पंन होना चाहिए ।
      3. छवि को कल्पना करने के लिए चमक और कंट्रास्ट समायोजित
    3. : छवि मेनू पर क्लिक करें, समायोजित करें, फिर चमक और इसके विपरीत का चयन. स्वत: विकल्प क्लिक करें ।
    4. छवि प्रकार को 8-बिट में बदलें: छवि मेनू का चयन करें, फिर प्रकार का चयन करें, और 8-बिट चुनें ।
    5. छवि के पैमाने पर सेट: विश्लेषण मेनू खोलें, स्केल सेट करेंक्लिक करें और निम्न पैरामीटर दर्ज: दूरी = 1, ज्ञात दूरी = 10, 1 पिक्सेल = 10 एनएम.
    6. प्राप्त किया जा करने के लिए माप का चयन करने के लिए, विश्लेषण मेनू खोलें, माप सेट का चयन करें, और क्षेत्र विकल्प के बगल में बॉक्स को चेक करें.
    7. छवि की दहलीज समायोजित करें । छवि मेनू खोलें, समायोजित करें चुनें, और फिर थ्रेशोल्ड का चयन करें, ओवर/ २५५ करने के लिए अधिकतम मान ले जाएँ, और न्यूनतम मान 1 पर ले जाएँ और लागू करेंक्लिक करें ।
    8. कणों का विश्लेषण करने के लिए, विश्लेषण मेनू खोलने के लिए, कणों का विश्लेषण का चयन करें. पिक्सेल इकाइयों का चयन करने, परिणाम प्रदर्शित करने और सारांशित करने के लिए एक चेकमार्क रखें । 4-इंफिनिटी के लिए आकार सेट (के बाद से संकल्प ~ 20 एनएम है), नंगे रूपरेखा विकल्प का चयन करें और ठीक क्लिक । सारांश फ़ाइल बनाई जाएगी जिसमें औसत क्लस्टर आकार और छवि में क्लस्टर्स की संख्या जैसे विश्लेषण विवरण शामिल होंगे ।
      नोट: सावधानी जब एक विशेष क्लस्टर के भीतर प्रोटीन की संख्या के बारे में निष्कर्ष बनाने का प्रयोग किया जाना चाहिए, स्थानीयकृत अंक की संख्या के रूप में रेखीय प्रोटीन की संख्या के साथ संबद्ध नहीं है । GSD informations रंजक कि एंटीबॉडी के लिए संयुग्मित हैं, एक लिंकेज-त्रुटि है कि epitope से फ्लोरोसेंट लेबल विस्थापन में जिसके परिणामस्वरूप & #62; 10 एनएम किसी भी दिशा में । इसके अतिरिक्त, यदि polyclonal एंटीबॉडी का उपयोग कर रहे हैं, एक से अधिक एंटीबॉडी एक प्रतिजन के लिए बाध्य कर सकते है और इस मुद्दे को भी आगे मिला, वाणिज्यिक माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित रहे हैं, औसत पर, डाई के 3-6 अणुओं तो एक fluorophore नहीं हमेशा बराबर एक प्रोटीन । लिंकेज-त्रुटि को प्राथमिक एंटीबॉडी (माध्यमिक को नष्ट करने) के लिए या एक nanobody-आधारित लेबलिंग योजना का उपयोग कर एक डाई को सीधे conjugating द्वारा कम किया जा सकता < सुप वर्ग = "xref" > १४ .

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Representative Results

परिचय में प्रलेखित के रूप में, वहाँ कई अलग सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी इमेजिंग मोडल हैं. इस प्रोटोकॉल, GSD सुपर संकल्प इमेजिंग पर केंद्रित है । प्रतिनिधि छवियां और स्थानीयकरण मैप्स चित्रा 2 और चित्रा 3में दिखाए जाते हैं ।

चित्रा 2 एक क्योंकि ईआर प्रोटीन, mCherry-Sec61β के साथ 7 सेल transfected से पता चलता है, और ऊपर वर्णित विधि का उपयोग कर संसाधित । चित्र 2a -b बी TIRF मोड (ए) में एक सुपर संकल्प माइक्रोस्कोप का उपयोग और GSD अधिग्रहण मोड (बी) का उपयोग कर लिया एर की छवियों की तुलना की अनुमति. छवियां GSD मोड में प्राप्त करते समय अक्षीय रिज़ॉल्यूशन में सुधार दिखाती हैं । यह आगे के साथ साजिश प्रोफ़ाइल में प्रदर्शन किया है, कि ImageJ, जो ब्याज के क्षेत्रों (पीली लाइन) में सामान्यीकृत तीव्रता curves के वितरण में अंतर से पता चलता है का उपयोग कर उत्पंन कर सकते हैं । इन curves एर नलिकाओं जो बहुत संकरा हो जब GSD मोड में जांच के व्यास का प्रतिनिधित्व करते हैं । GSD माइक्रोस्कोपी लगभग 20 एनएम के एक पार्श्व स्थानीयकरण सटीक है और इस तरह विवर्तन सीमा से परे संकल्प में लगभग एक दस गुना वृद्धि का प्रतिनिधित्व करता है । इस सुधार में समाधान के परिणामों में एर नलिकाओं की संरचना का एक और अधिक सटीक प्रतिनिधित्व ।

सुपर संकल्प GSD इमेजिंग द्वारा प्रस्तुत संकल्प में सुधार आगे चित्रा 3में प्रदर्शित किया जाता है, एक विरोधी सीएv१.२ एंटीबॉडी के साथ एक लेबल कार्डियक myocyte दिखा रहा है, ऊपर वर्णित के रूप में कार्रवाई की । चित्रा 3 ए में छवि TIRF सेटिंग में एक GSD सुपर संकल्प माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया गया था । सीएV१.२ चैनलों के क्लस्टर टी-tubule नेटवर्क के साथ व्यवस्थित करने के लिए देखा जा सकता है । चित्र बी एक ही सेल से पता चलता है, लेकिन इस छवि GSD मोड का उपयोग कर प्राप्त किया गया था । अक्षीय संकल्प में सुधार पैनलों जो चैनलों के एकल समूहों पर ध्यान केंद्रित में अधिक प्रमुख है (चित्र बी), जब एक तुलना एक ही रॉय के बीच किया जाता है TIRF और GSD, चैनलों के अलग समूहों का उपयोग कर images के रूप में की पहचान करने के लिए आसान कर रहे है GSD इमेजिंग द्वारा की पेशकश की समाधान में सुधार का परिणाम है । इन पैनलों भी पता लगाना थ्रेशोल्ड पिक्सेल प्रति फोटॉनों की संख्या के रूप में परिभाषित में अंतर की तुलना करें । इस पैरामीटर को सावधानी से चुना जाना चाहिए और प्रयोग की आवश्यकताओं के अनुकूल होना चाहिए । पैनल 3 डी GSD छवि ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर संसाधित किया गया था जब क्लस्टर रूपरेखा से पता चलता है, इस से छवि में प्रत्येक व्यक्ति क्लस्टर के लिए क्लस्टर क्षेत्र निर्धारित किया जा सकता है (नोट 13.1.8 ऊपर और महत्वपूर्ण विचार के लिए चर्चा अनुभाग देखें जब इस तरह के एक ठहराव प्रदर्शन) । यह जानकारी तो पैनल 3सी में आवृत्ति हिस्टोग्राम उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस विश्लेषण क्लस्टर आकार में परिवर्तन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या नियंत्रण बनाम परीक्षण की स्थिति के तहत नमूनों के बीच समूहों की संख्या (उदा., WT बनाम उत्परिवर्ती चैनल या अनुपचारित बनाम ड्रग-इलाज कोशिकाओं) । पूरक कदम वार photobleaching प्रयोगों के साथ इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित दृष्टिकोण का उपयोग करना, जांचकर्ताओं ने निर्धारित किया है कि CaV१.२ चैनल के समूहों में वितरित कर रहे हैं, औसत पर, कार्डिएक myocytes 15 में 8 चैनल .

Figure 1
चित्र 1: झिल्ली प्रोटीन की सुपर संकल्प इमेजिंग के लिए घटनाओं की समयरेखा के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । 0 दिन एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए प्रसंस्करण के पहले दिन को संदर्भित करता है । प्रोटोकॉल अनुभाग जहां विस्तृत जानकारी प्रत्येक चरण पर पाया जाता है प्रोटोकॉल में अनुभाग को संदर्भित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी शोर करने के लिए बेहतर संकेत प्रदान करता है और स्थानिक संकल्प वृद्धि हुई है. (क) छोड़ दिया है क्योंकि-7 mCherry एक्सप्रेस-Sec61β, फिक्स्ड और लेबल के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित कोशिकाओं और पारंपरिक TIRF माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged । सही, ऊपरी पैनल: एकल एर tubule । ठीक है, निचले पैनल: भूखंड प्रोफ़ाइल एर tubule (पीली लाइन) की चौड़ाई के पार ले लिया । (B) GSD सुपर-रिज़ॉल्यूशन का उपयोग करके स्थानीयकरण मानचित्र को छोड़कर (A) के रूप में एक ही कक्ष जनरेट किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: कार्डियक myocytes में Cav१.२ चैनल के सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग । (क) एक पृथक हृदय myocyte से TIRF पदचिह्न, फिक्स्ड, और विरोधी के साथ दाग-CaV१.२ एंटीबॉडी (FP1) । (ख) बाएं: सुपर संकल्प TIRF पदचिह्न के रूप में एक ही कार्डियक myocyte से (A) । सही: स्थानीयकरण मानचित्र के बढ़े हुए भाग जो विभिन्न पहचान सीमाओं के अधीन किए गए हैं. ध्यान दें कि एक खोज थ्रेशोल्ड बढ़ाता है के रूप में, CaV१.२ चैनल क्लस्टर का स्पष्ट आकार घटाएं । (C) (B) में स्थानीयकरण मानचित्र से प्राप्त क्लस्टर आकारों की आवृत्ति हिस्टोग्राम । (D) बाएं: CaV१.२ क्लस्टर्स से (B) की रूपरेखा । सही: छवि के बढ़े हुए भागों को अलग पहचान थ्रेशोल्ड के अधीन किया गया है. नोट, (B), के समान पता लगाना थ्रेशोल्ड बढ़ाता है, CaV१.२ चैनल क्लस्टर द्वारा कब्जा क्षेत्र घटाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Fluorophore इस्तेमाल किया Alexa-६४७
लेजर ६४२ एनएम
उत्सर्जन फिल्टर ६२३ एचपी-टी
लेंस 160X १.४३ न
एक्सपोज़र समय 10 ms
खोज थ्रेशोल्ड ६५
घटना कोण (प्रवेश गहराई) ६५.०४ ° (१५० एनएम)
EM लाभ ३००
#frames अधिग्रहीत 30000 – 60000
पंपिंग के लिए लेजर तीव्रता १००%
d >अधिग्रहण के लिए लेजर तीव्रता ५०%

तालिका 1: इमेजिंग पैरामीटर्स की सूची ।

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Discussion

प्रौद्योगिकियों कि विवर्तन सीमा से परे इमेजिंग की अनुमति के हाल के विस्फोट अंतरिक्ष और समय में संकेतन स्तनधारी सेल की जटिलताओं में नई खिड़कियों की पेशकश की है । इन प्रौद्योगिकियों में तूफान, STED, पाम, GSD, सिम, और उनके वेरिएंट (उदा, dSTORM, FPALM) शामिल हैं । इन तकनीकों के पीछे वैज्ञानिकों की सरलता हमें प्रकाश की विवर्तन शासी भौतिकी के कानूनों द्वारा लगाए गए सीमाओं को दरकिनार करने की अनुमति दी गई है । इस विशाल उपलब्धि के बावजूद, इन तकनीकों में से प्रत्येक के लिए सुपर संकल्प को प्राप्त करने के समझौते के कुछ प्रकार बनाता है और, जैसे, अपनी सीमाएं हैं । आदर्श स्थिति है कि कोशिका जीव और भौतिक विज्ञानियों के लिए प्रयास करते है इष्टतम संवेदनशीलता, उच्च संकल्प, और तेजी से अधिग्रहण, कोई photobleaching के साथ है । इसके अलावा, एक जानकार रहना चाहिए कि जानवरों से कोशिकाओं को हटाने के द्वारा, हम स्वाभाविक रूप से उन्हें बदलने के लिए और संभावित आणविक गतिशीलता बदल जाते हैं । इसलिए, खोज एक सुपर संकल्प प्रौद्योगिकी है कि गतिशील परमिट, लाइव सेल, एक जीवित रहने में एक अणु इमेजिंग, पशु श्वास पर चला जाता है विकसित करने के लिए । अभी के लिए, हम विवर्तन सीमित संकल्प पर 10 गुना सुधार के साथ छवियों को उत्पन्न कर सकते हैं कि हमारे निपटान में उपकरण है. इस आलेख में, हम नमूना तैयारी, छवि प्राप्ति, और विश्लेषण GSD के लिए जो क्रमशः पार्श्व और अक्षीय आयामों में 20 और ५० एनएम के लिए सक्षम रिज़ॉल्यूशन पर चर्चा करें ।

हालांकि इस प्रोटोकॉल का ध्यान Sec61β और caV१.२ एल प्रकार ca पर है2 + चैनल, प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित एक GSD माइक्रोस्कोप पर अपनी प्रयोगशालाओं में छवि अलग प्रोटीन के लिए इच्छा शोधकर्ताओं के लिए एक टेम्पलेट के रूप में सेवा कर सकते हैं. प्रोटोकॉल के इस प्रकार के सकारात्मक गुण है कि यह अपेक्षाकृत सरल है, संशोधित किया जा सकता है और विभिंन प्रकार के सेल के एक नंबर पर लागू है, और आसानी से बहु रंग इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । स्पष्ट सीमाएं है कि सुपर संकल्प प्रणालियों, एक संवेदनशील EM-एक अणु का पता लगाने में सक्षम सीसीडी कैमरा के साथ सुसज्जित है, अभी भी कई प्रयोगशालाओं के लिए नकारात्मक महंगा हो जाते हैं ।

प्रयोगशालाओं की संख्या है कि अपने पसंदीदा इमेजिंग तकनीक के रूप में सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी का उपयोग बढ़ने के रूप में, और अधिक समान समझ और समझौते छवि अधिग्रहण, प्रसंस्करण, और व्याख्या के बारे में की जरूरत है । कैसे, उदाहरण के लिए, एक विवर्तन-सीमित पिक्सेल में colocalized दिखाई दो प्रोटीन की निकटता के स्तर को बढ़ाता है, लेकिन भाप वास्तव में थोड़ा एक सुपर संकल्प छवि में सभी पर ओवरलैप प्रदर्शित करने के लिए/ वास्तव में, इस परिदृश्य पहले से ही कई पहले ग्रहण colocalized प्रोटीन, आसंजन जटिल प्रोटीन paxillin और zyxin के रूप में के लिए पैदा हो गया है । के रूप में संकल्प है कि सूक्ष्मदर्शी हमेशा बढ़ता प्राप्त करने के लिए, शायद प्रोटीन अब ' colocalize ' के लिए रिपोर्ट नहीं बल्कि गैर है, एक दूसरे के आसपास पसंदीदा स्थानीयकरण के बेतरतीब ढंग से वितरित पैटर्न होगा । सब के बाद, यह असंभव है के लिए दो प्रोटीन के लिए शारीरिक रूप से बिल्कुल ही 3 आयामी स्थान पर कब्जा । इस विश्लेषण पहेली के लिए कुछ समाधान के लिए साहित्य में उभरने शुरू कर रहे हैं, stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण सहित माइक्रोस्कोपी आधारित सापेक्ष स्थानीयकरण विश्लेषण (स्टॉर्म-आरएलए), जो कथित तौर पर ओवरलैप की आवृत्ति और डिग्री यों तो कर सकते हैं दो सह लेबल के बीच प्रोटीन और भी गैर अतिव्यापी प्रोटीन13के बीच की दूरी की मात्रात्मक माप प्रदान करते हैं । जब सुपर संकल्प में एक और एक चैनल की तुलना, यह निश्चित रूप से आप दो चैनलों के बीच सही रजिस्ट्री है सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह बहु रंग microsphere फ्लोरोसेंट मोती और प्रत्येक व्यक्ति चैनल में इमेजिंग तो छवियों ओवरले का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, के बाद से SR-GSD 3 डी माइक्रोस्कोप भी एक TIRF माइक्रोस्कोप के रूप में कार्य कर सकते हैं और TIRF में सुपर संकल्प स्थानीयकरण नक्शे उत्पन्न, यह दो रंग चैनलों के बीच पैठ गहराई से मेल करने के लिए महत्वपूर्ण है, TIRF कोण के आधार पर परिवर्तन के रूप में प्रकाश की तरंग दैर्ध्य नमूने को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया ।

इसके अलावा, के रूप में चित्र बी और चित्रा 3 डीमें चित्रित, एक स्थानीयकरण नक्शा ' थ्रेसहोल्ड ' की डिग्री के आधार पर काफी अलग दिखाई दे सकते हैं । पता लगाना थ्रेशोल्ड बहुत कम सेट है, तो संरचनाएँ वे वास्तव में प्रायिकता के रूप में हैं कि एक नकली गैर-विशिष्ट लेबलिंग ' शोर ' बढ़ाता है शामिल हैं से बड़ा होने के लिए प्रकट हो सकता है । इसके विपरीत, यदि पता लगाना थ्रेशोल्ड बहुत अधिक सेट है, तो संरचनाएं छोटी दिखाई दे सकती है क्योंकि वे वास्तव में ' रीयल ' ईवेंट से बाहर हैं । इस प्रकार, थ्रेसहोल्ड कारण और सावधानी के साथ लागू किया जाना चाहिए । तो कैसे एक दिए गए नमूने के लिए एक उचित खोज सीमा निर्धारित कर सकते हैं? नियंत्रण कुंजी हैं । किसी भी bliss-लेबलिंग दृष्टिकोण के साथ के रूप में, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी की विशिष्टता प्रदर्शित करने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए । उचित नियंत्रण के साथ, यह संभव है एक खोज थ्रेशोल्ड ऊपर जो केवल विशिष्ट लेबलिंग स्वीकार्य होना चाहिए । उपयुक्त नियंत्रण नमूने जिसमें प्राथमिक एंटीबॉडी मशीन छोड़ दिया गया है तो एक नमूना केवल द्वितीयक एंटीबॉडी के लिए प्रकट किया जा सकता है शामिल हैं । ऐसे नियंत्रण से, किसी द्वितीयक एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बाइंडिंग से यह विचार किया जा सकता है । एक अच्छी तरह से तैयार नमूना में, यह छवि प्रति एक बहुत छोटी घटना गिनती में परिणाम चाहिए, और एक कम मतलब पिक्सेल प्रति फोटॉनों की संख्या जब प्राथमिक और माध्यमिक मशीन नमूना की तुलना में । छवि का पता लगाना थ्रेशोल्ड तब सेट किया जा सकता है ताकि गैर-विशिष्ट लेबलिंग को समाप्त किया जा सके. एक ही पता लगाने दहलीज तो इस्तेमाल किया जाना चाहिए जब इमेजिंग प्राथमिक और माध्यमिक के लिए आत्मविश्वास है कि ' शोर ' सफाया कर दिया है बढ़ाने के लिए मशीन नमूना । इसके अलावा नियंत्रण उन प्राथमिक एंटीबॉडी की विशिष्टता परीक्षण शामिल हैं । transfected कोशिकाओं में, यदि लेबल प्रोटीन natively सेल लाइन में व्यक्त नहीं है, तो प्राथमिक एंटीबॉडी विशिष्टता का एक सरल परीक्षण untransfected कोशिकाओं पर लेबलिंग प्रक्रिया को पूरा करने के लिए है । प्राथमिक कोशिकाओं में प्राथमिक एंटीबॉडी विशिष्टता का प्रदर्शन करने के लिए, लेबल प्रोटीन की एक आनुवंशिक नॉकआउट सोने के मानक है । इन प्राथमिक एंटीबॉडी नियंत्रण प्रयोगों का उपयोग करके पहचान थ्रेशोल्ड्स भी सेट किए जा सकते हैं. लक्ष्य antigen के अभाव में, कोई भी प्रतिदीप्ति उत्सर्जन गैर-विशिष्ट है । माध्यमिक केवल नियंत्रण के साथ के रूप में, एक अच्छा प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ, छवि प्रति कम घटनाओं और मनाया जाना चाहिए इसलिए, फ्रेम की एक ही नंबर पर, पिक्सेल प्रति फोटॉनों की एक कम मतलब की संख्या स्पष्ट किया जाना चाहिए । खोज थ्रेशोल्ड इस प्रकार बंद-लक्ष्य प्राथमिक एंटीबॉडी बाइंडिंग के कारण गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधलान को समाप्त करेगा एक स्तर पर सेट किया जा सकता है । पूरी पारदर्शिता के लिए, यह सुझाव दिया है कि लेखकों को उनके थ्रेसहोल्ड मानकों के साथ स्पष्ट रूप से कहा और शायद एक onlin में कच्चे डेटा के लिए एक कड़ी के साथ छवियों को पेश करना चाहिएई डिपॉजिटरी.

जांचकर्ता भी जानकार रहना चाहिए कि एकाधिक द्वितीयक एंटीबॉडी एक प्राथमिक एंटीबॉडी को बांध कर सकते हैं तो एक 1:1 प्राथमिक: माध्यमिक बाध्यकारी अनुपात ग्रहण नहीं किया जाना चाहिए. इसके अलावा, वाणिज्यिक माध्यमिक एंटीबॉडी आमतौर पर कई fluorophores के लिए संयुग्मित हैं, उदाहरण के लिए, माध्यमिक इस प्रोटोकॉल में कार्यरत एंटीबॉडी 2-8 fluorophores के लिए संयुग्मित होने के लिए निर्माता द्वारा नोट कर रहे हैं. एक काम के रूप में इस के आसपास, एक fluorophore सीधे एक प्राथमिक एंटीबॉडी को संयुग्मित जा सकता है । Spectrophotometry तो प्राथमिक एंटीबॉडी प्रति fluorophores की औसत संख्या का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस विकार प्रक्रिया को करने के लिए कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट उपलब्ध हैं । हालांकि, यहां तक कि अगर एक 1:1 stoichiometry हासिल की है, fluorophore अणु ही आगे की वजह से निमिष और fluorophores के प्रतिवर्ती स्विचन समस्याओं को बढ़ा सकते हैं । व्यवहार में, इसका मतलब यह है कि एक fluorophore चक्र जमीन और उत्तेजित राज्य फोटॉनों के समूहों उत्सर्जक के बीच कई बार के रूप में यह ऐसा करता है । इन फोटॉनों कई पड़ोसी पिक्सल में पता लगाया जा सकता है और क्लस्टर आकार के अधिक अनुमान लगाने के लिए सीसा । अंय जांचकर्ताओं के लिए समय और अंतरिक्ष16,17की छोटी अवधि से अधिक संकुल फ्लोरोसेंट उत्सर्जन संयोजन का चयन करके इस मुद्दे को संबोधित किया है । यह एक कुछ अनुभवजंय दृष्टिकोण है कि अभी भी संभावना है कि एक ही fluorophore एक विस्तारित अवधि के लिए अंधेरे राज्य के लिए वापस चक्र सकता है खत्म नहीं करता है, तो एक साइकिल/उत्सर्जन राज्य एक बार फिर रिवर्स और एक दूसरे अणु के रूप में फैसला किया । इसलिए, किसी क्लस्टर में अणुओं की संख्या केवल क्लस्टर आकार पर आधारित परिकलित किया जा सकता । फिलहाल, इन मुद्दों के लिए कोई सही समाधान है और इसलिए, सुपर संकल्प इमेजिंग का उपयोग ऐसे कदम के रूप में एक और तकनीक के साथ संयोजन के रूप में वार photobleaching क्लस्टर प्रति अणुओं की संख्या का अनुमानित अनुमान दे सकते हैं । क्लस्टर क्षेत्र माप में विश्वास बढ़ाने के लिए प्रासंगिक नियंत्रण ज्ञात monomeric प्रोटीन के क्लस्टर आकार की तुलना में शामिल (उदा, CD86) और ज्ञात dimeric प्रोटीन (जैसे, CTLA-4) ब्याज के प्रोटीन के उन लोगों के लिए द्वारा सुझाए गए के रूप में Fricke एट अल. 18.

संक्षेप में, वर्तमान लेख में, एक सीधी immunolabeling प्रोटोकॉल सेट आगे सुपर संकल्प इमेजिंग के लिए निर्धारित नमूनों की तैयारी का वर्णन है । इसके अलावा, छवि अधिग्रहण और विश्लेषण में कुछ आम नुकसान पर चर्चा कर रहे हैं । के रूप में सुपर संकल्प इमेजिंग और अधिक आम हो जाता है, यह पत्रिकाओं के लिए आगे इन जटिल छवियों/स्थानीयकरण नक्शे के अनुचित हेरफेर टालना के लिए दिशा निर्देशों का एक नया सेट सेट करने के लिए आवश्यक हो सकता है । सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी सेल जीव और भौतिक विज्ञानियों के उपकरण बॉक्स के लिए एक शक्तिशाली नए उपकरण जोड़ा गया है और पहले से ही सेलुलर वास्तुकला और आणविक संगठन की हमारी समझ पर एक असाधारण प्रभाव बना दिया है ।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी हितों का खुलासा नहीं है.

Acknowledgments

यह काम आहा से R.E.D. (15SDG25560035) तक अनुदान द्वारा समर्थित था । लेखक अपने Leica SR GSD 3 डी माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए dr. फर्नांडो संतांना स्वीकार करना चाहते हैं, और डॉ जोहांस नरक कृपया FP1 एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOH Thermo Scientific P250-500 To clean coverglass
#1.5 coverglass 18 x 18 mm Marienfeld Superior 0107032) To grow/process/image cells
10x PBS Thermo Scientific BP3994 Dilute to 1x with de-ionized water
Poly-L-Lysine Sigma P4832 Aids with cell adhesion to cover glass
laminin Sigma 114956-81-9 Aids with cell adhesion to cover glass
Medium 199 Thermo Scientific 11150-059 Ventricular myocyte culture media
DMEM 11995 Gibco 11995 Cell culture media
Fetal bovine Serum (FBS) Thermo Scientific 10437028 Media supplement
Penicillin/streptomycin Sigma P4333 Media supplement
0.05% trypsin-EDTA Corning 25-052-CL Cell culture solution
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019 Transient transfection reagent
Ca2+-free PBS Gibco 1419-144 Cell culture
100 % Methanol Thermo Fisher Scientific A414-4 Cell Fixation
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Cell Fixation
Glutaraldehyde Sigma Aldrich SLBR6504V Cell Fixation
SEAblock Thermo Scientific 37527 BSA or other blocking solution alternatives exist
Triton-X 100 Sigma T8787 Detergent to permeabilize cells
Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) Gift N/A Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003)
Mouse monoclonal anti-RFP Rockland Inc. 200-301-379 Primary antibody
Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen (Thermo Scientific) A31573 Secondary antibody
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen (Thermo Scientific) A11031 Secondary antibody
Sodium azide Sigma S2002 Prevents microbial growth for long term storage of samples
Catalase Sigma C40 Photoswitching buffer ingredient
Glucose oxidase Sigma G2133 Photoswitching buffer ingredient
Tris Sigma T6066 Photoswitching buffer ingredient
beta-Mercaptoethylamin hydrochloride Fisher BP2664100 Photoswitching buffer ingredient
β-mercaptoethanol Sigma 63689 Photoswitching buffer ingredient
NaCl Fisher S271-3 Photoswitching buffer ingredient
Dextrose Fisher D14-212 Photoswitching buffer ingredient
Glass Depression slides Neolab 1 – 6293 To mount samples
Twinsil Picodent 13001000 To seal coverglass
sec61β-mCherry plasmid Addgene 49155
Leica SR GSD 3D microscope Leica
ImageJ
Washing block solution 20 % SEAblock in PBS
Primary antibody incubation solution 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS
Secondary antibody incubation solution 1:1000 in PBS

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References

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संरचनात्मक जीवविज्ञान अंक १२९ CaV१.२ फोकल माइक्रोस्कोपी endoplasmic जालिका (एर) सुपर संकल्प कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल जमीन राज्य कमी माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा किया वैयक्तिक अणु वापसी (GSDIM)
स्तनधारी कोशिकाओं में जमीन राज्य घट सुपर संकल्प इमेजिंग
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Dixon, R. E., Vivas, O., Hannigan, K. I., Dickson, E. J. Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (129), e56239, doi:10.3791/56239 (2017).

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