Summary
이 문서는 하나 이상의 플라즈마 포유류 세포에 있는 바닥 상태 고갈 (GSD) 슈퍼 해상도 현미경을 사용 하 여 세포 막 단백질의 검출에 대 한 프로토콜을 설명. 여기, 우리 토론 혜택과 시각화 및 세포 단백질의 정량화에 대 한 이러한 접근을 사용 하 여 고려 사항.
Abstract
형광 현미경 검사 법 및 세포 생물학에서 발전은 밀접 하 게 연관는 향상 된 셀룰러 이벤트 자주 하는 방법에 대 한 우리의 이해에 극적인 도약 선도 시각화 하는 기능 세포 기능. 개발 및 슈퍼 해상도 현미경의 상당 하 게 확장 했다 광학 해상도의 한계 ~ 250-20에서 nm. 생물학은 colocalization 회절 제한 된 지역 내에서 분자 상호 작용을 설명 하는 제한 된 더 이상, 오히려 그것은 이제 개별 분자의 동적 상호 작용을 시각화 수 있습니다. 여기, 우리 바닥 상태 고갈 고정된 셀 이미징에 대 한 현미경 검사 법에 의해 시각화 및 세포 단백질의 정량화에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 두 개의 서로 다른 막 단백질, 바인딩과 그물 translocon, sec61β, 그리고 원형질 막 지역화 전압 개폐 L 유형 캘리포니아2 + 채널 (CaV1.2)의 요소에서 예제를 제공합니다. 논의 특정 현미경 매개 변수, 고정 방법, 사진 스위칭 버퍼 정립, 그리고 함정 및 이미지 처리의 과제.
Introduction
셀룰러 신호 반응 번역 세포질 응답을 시작 하는 내부 및 외부 환경 변화. 그들은 인간의 생리, 호르몬 및 신경 전달 물질 방출, 심장 박동, 시각, 수정, 및 인지 기능에 대 한 기초로 제공의 모든 측면을 통제 한다. 이러한 신호 폭포의 병 태 생리 조건 암, 알 츠 하이 머 병, 파 킨 슨 병, 등의 형태로 심각한 결과 가질 수 있습니다. 수십 년 동안, 생물학과 의학 조사자 이용 형광 단백질, 프로브, 바이오 센서는 형광 현미경 기본 도구로 결합 세포 이들의 정확한 공간과 일시적인 조직 이해 하 신호입니다.
Epifluorescence, confocal, 또는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 등의 광학 기술의 힘은 그들의 감도, 속도, 및 라이브 셀 이미징, 주요 한계는 호환 그들의 회절 제한 된 해상도, 의미 구조 또는 200-250 nm 보다 작은 단백질 복합물은 확인할 수 없습니다. 결정적 슈퍼 해상도의 이론적이 고 실용적인 개발 (예를 들면, 자극된 방출 소모 현미경 (호텔 위치1), 구조화 조명 현미경 (SIM2) 또는 확률론 슈퍼 해상도 (예: , photoactivated 지역화 현미경 (팜3), 또는 바닥 상태 고갈 (GSD4,5)), 측면 및 축 해상도 형광 현미경 검사 법의 순서를 회절 방 벽을 넘어 확장 되었습니다 나노미터의 수 만입니다. 따라서, 조사자는 지금 시각화 하 고 단백질 역학과 조직 근처 분자 수준에서 기능을 변환 하는 방법을 이해 탁월한 기능이 있다.
바닥 상태 고갈 현미경 개별 분자 반환 뒤 (GSDIM), 또는 단순히 GSD로 알려져 있다 circumvents 회절 제한 fluorophores4,5를 동시에 방출의 수를 줄임으로써. 높은 에너지 레이저 빛 fluorophore 분류 샘플, 광자와 전자를 폭격 하 고 확률 그들은 ' 스핀 플립 '을 받게 되며4상태 삼중 항 또는 ' 어두운 상태 '를 입력 증가 자극 하는 데 사용 됩니다. 이 효과적으로 접지 상태를 고갈 시킨다, 그러므로 이름 '그라운드 상태 고갈'. Triplet 상태에 fluorophores 광자를 방출 하지 않는 하 고 샘플 주차 나타납니다. 그러나, 이러한 fluorophores 확률론 바닥 상태를 반환 하 고 triplet 상태에 반환 하기 전에 접지 흥분 상태 전환을 방출 하는 여러 광자를 통해 갈 수 있다. 적은 fluorophores 방출 어떤 주어진된 시간에, 함께 포 톤 버스트 fluorophores 이웃 공간 및 일시적으로 구분 되는 개별 fluorophores에서 방출. 광자의 버스트 가우스 기능, 렌즈, 사용 하는 빛의 파장의 수 가늠 구멍 (NA)에 종속 되는 지역화 정밀 fluorophore의 위치에 해당 하는 계산된 중심으로 들어갈 수 있는 여기 고 결정적인, fluorophore 당 방출 된 광자의 수. GSD에의 한 제한, fluorophores의 하위 집합만 적극적으로 언제 든 지 방출, 이후 이미지 수천을 수집 해야 합니다 완전 한 현지화 지도를 만들려고 몇 분 동안 이다. 높은 레이저 전원 요구와 함께 긴 수집 시간 GSD 라이브 샘플 보다 고정에 적합 한 더 나은 의미 합니다.
이 문서에서는 설명 합니다 막 및 바인딩과 그물 (ER)의 슈퍼 해상도 현미경 이미징에 대 한 고정된 샘플의 준비-상주 단백질 (필요한 소모품 및 시 약 참조 테이블의 재료의 목록)에 대 한. 어떻게이 프로토콜 쉽게 계량 크기와 L 유형 전압-문이 캘리포니아2 + 채널 (Cav1.2) 심장 myocytes의 sarcolemma에서의 클러스터링의 정도에 적응 하거나 수는 응급실의 세포 분포를 시각화 하는 데 사용의 예 시연 됩니다. 개시, 번역, 그리고 궁극적으로 많은 캘리포니아2 +의 기능 이해에 매우 중요 하다는 유통 및 이러한 세포 구성 성분의 이해-종속 신호 폭포. 예를 들어 Cav1.2 채널은 흥분 수축 연결, 수용 체-중재 Ca2 + 출시는 응급실에서 아마도 포유류 세포에서 가장 유비 쿼터 스 신호 폭포는 근본적으로 중요 합니다.
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Protocol
1. 세척 유리 Coverslips
- 샘플 처리 하기 전에 하루 1 시간에 대 한 코의 1 M 솔루션에서 sonicating 여 #1.5 유리 coverslips를 청소. 이것은 coverslips에 있을 수 있는 어떤 형광 오염 물질을 제거 합니다.
- 드 이온된 수와 coverslips에서 코를 철저 하 게 린스.
- 일단 코에 청소, 70% 에탄올 사용 하 여 준비까지 있는 coverslips 저장.
2. 코팅 유리 Coverslips
참고:이 섹션의 단계는 오염을 방지 하기 위해 셀 문화 후드에서 수행 되어야 합니다.
- 집게를 사용 하 여 개별 coverslip 70% 에탄올 솔루션에서 제거 하 고 신속 하 게 과잉을 제거 하는 화 염. 장소 6 잘 플레이트에 coverslips. 없으면 문화 후드에 불타는 옵션, 고려 압력가 마로 소독은 coverslips 드 이온된 수 또는 적어도 30 분에 대 한 문화 후드에 자외선에서 살 균 세 정 후
- 세포의 접착을 투입, 살 균 0.01% 폴 리-L-리 신 실 온에서 1 h와 coverslips 코트.
- 폴 리-L-리 신을 발음 하 고 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS)와 coverslips를 헹 굴. 건조 한 공기 및 냉장고에서 밤새 껏 두기.
- 다음날 아침 냉장고에서 있는 coverslips를 제거 하 고 실 온에서 30 분 이상 50 µ g/mL의 농도에서 laminin의 300 µ L을 추가. laminin는 coverslip에 직접 배치 신중 하 게.
참고:이 laminin 단계 HEK293 세포 또는 COS-7 셀에 대 한 필요 하지 않습니다 하지만 격리 된 심 실 myocytes 필요. 다른 1 차 셀 혈관 평활 근 세포 또는 뉴런을 준수 수 있습니다와 같은 더 나은 콜라겐 또는 fibronectin 코팅 coverslips.
3. 셀의 준비
- 경작된 한 세포
- 성장 COS-7 셀 (또는 선호 셀 라인) 10 mL Dulbecco에서에서 10 cm 문화 접시에 ' s 수정 이글스 매체 (DMEM) 문화 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 보완 페니실린/스 (PS) 솔루션입니다. 37 ° C, 5% CO 2 셀 문화 인큐베이터에서 셀 성장.
- 셀 도달 90% confluency DMEM 미디어를 발음 하 고 0.05% trypsin EGTA 솔루션의 5 mL을 추가 하 여 10 cm 접시에서 그들을 수확. 일단 셀 모아 분리를 시작, 즉시 보충된 DMEM과 트립 신을 무력화.
접시에서 셀을 제거 하려면
- 사용 5 mL 혈 청 학적인 피 펫. 남아 있는 모든 셀을 제거 하려면 여러 번 접시의 베이스에 대 한 매체를 플라스틱 부착 homogenously 문화 매체를 통해 세포를 배포 하 고.
- 세포 transfection에 대 한 70 %confluency 달성 하기 위해 35mm 문화 요리에 접시. 접시에 매체의 볼륨을 확인까지 2 mL 신선한 DMEM/FBS/PS 솔루션.
- 원하는 플라스 미드 DNA와 transfect COS-7 셀 구조 (예를들면, 플라스 미드 sec61β-mCherry), 적절 한 transfection 시 약을 사용 하 고 제조 업체에 따라 ' s 지침.
참고: 플라스 미드 또는 transfection 시 약 사용에 따라 표현 하는 단백질에 대 한 24-48 시간 걸릴 수 있습니다.
- 성인 마우스 심 실 myocytes
- 성인 마우스 심 실 myocytes 확고 Langendorff 관류 방법 6을 사용 하 여 분리. 다시 중간 199 (M199) ps. 2.5 %FBS 1% 보충에 myocytes의 결과 펠 릿을 중단
4. 셀을 도금
- 페 COS-7 셀
- 2 mL DMEM/FBS/PS 솔루션에서 35mm 요리 발음 및 캘리포니아 2 + 1 mL를 추가-무료 PBS. 접시 2 분에 대 한 보육을 수확 셀에서에서 반환 접시 첫 발음 Ca 2 + 여-무료 PBS와 다음 0.05% trypsin EGTA 솔루션의 1 mL을 추가.
- 한 번
- 셀 모아 및 분리, 즉시 보충된 DMEM 1 mL와 트립 신을 무력화 하기 시작 합니다. 부드럽게 transfected 세포는 2 mL의 트립 신 EGTA DMEM 서 스 펜 션 전체에 고르게 분포 되도록 여러 번 위아래 플라스틱.
- 접시 페 폴 리-L-리 신 코팅된 coverslips는 적절 한 밀도 COS-7 셀을 단일 셀 구상 될 수 있다, 접시 볼륨을 작성 DMEM/FBS/PS와 함께 최대 2 mL (예를 들어는 coverslip 90 µ L 셀 서 스 펜 션 추가 1910 µ L 보충 DMEM 추가, 접시를 균등 하 게 세포 소용돌이).
참고: 셀 계산에 필요 하지 않지만 각 접시에 추가 될 셀의 셀의 confluency에 따라 달라 집니다. - 반환 도금 셀 문화 인큐베이터 하룻밤 준수 및 복구를 셀 수 있도록 셀.
- 2 mL DMEM/FBS/PS 솔루션에서 35mm 요리 발음 및 캘리포니아 2 + 1 mL를 추가-무료 PBS. 접시 2 분에 대 한 보육을 수확 셀에서에서 반환 접시 첫 발음 Ca 2 + 여-무료 PBS와 다음 0.05% trypsin EGTA 솔루션의 1 mL을 추가.
- 성인 마우스 심 실 myocytes
- 개별 셀을 시각화 수 있도록 적절 한 밀도에 코팅 된 coverslips에 직접 laminin 및 플레이트 myocytes를 발음. 이 격리에서 얻은 실행 가능한 세포의 밀도에 따라 달라 집니다.
- Coverslip 그리고 접착을 허용 하도록 ~ 45 분에 대 한 37 ° C, 5% CO 2 셀 문화 인큐베이터에서 장소에 돔에 세포 현 탁 액을 균형.
5. 셀의 고정
- 인큐베이터에서 셀을 제거 하 고 신중 하 게 매체를 발음.
- PBS 한번 부착 셀 린스.
- 개별 응용 프로그램 및 항 체에 최적화 된 고정 제와 수정 셀.
참고:는 정착 액을 선택할 때 염두에 두어야 하는 중요 한 기준 또한 관심의 항 원에 구조적 변화는 하면서 샘플의 세포질 구조의 보존 이다. 3 %paraformaldehyde/0.1% (PFA/조지아)와 프로토콜 고정이 고 100% 정착의 목적을 위해 메탄올 설명.
- Transfected COS-7의 PFA/조지아 고정 세포를 표현 하는 Sec61β-mCherry
- 혼합 1.9 mL 16 %PFA 20 µ L 50%가 추가 10 mL의 최종 볼륨을 만들기 위해 PBS.
- 추가 1 mL는 갓 실 온에서 10 분에 대 한 세포와 수정 각 접시 PFA/조지아 솔루션을 준비.
- PFA/조지아와 린스 셀 3 회 PBS 발음.
- 씻어 5 시간 5 분 대 한 PBS, 준수 셀. 적당 한 속도 (예를 들어, 분 당 사이클 50)으로 설정 하는 회전에 모든 세척 단계를 수행 하십시오.
- 다음, 갓 드 온수에 0.1% 질량/볼륨 나트륨 borohydride 준비 1 mL와 함께 무료 알데하이드 그룹을 줄일.
- 린스 세포 3 번 5 분 각 나트륨 borohydride와 알코올 무료 알 데히드와 반응 하는 때 생산의 모든 흔적을 제거 하는 PBS에 대 한 두 번 다음 세척.
- 성인 마우스 심 실 myocytes의 메탄올 고정
- 신중 하 게 셀에 얼음 처럼 차가운 100% 메탄올의 1 mL을 추가. 6 잘 플레이트 기울기와 사이드 벽 보다는 coverslip에 직접 메탄올 플라스틱. 다음 균등 하 게 씻어 메탄올 수 있도록 수평을 다시 6 잘 플레이트를 기울기 이상의 셀. -20 ° c.에 5 분에 대 한 수정
- 정착 액과 린스 셀 3 회 PBS 발음.
- PBS, 5 번 5 분 각는 회전에 대 한 준수 셀 세척.
6. 비 특정 바인딩 차단
- 블록 차단 솔루션에 실 온에서 1 h (재료의 표 참조).
참고: 다양 한 솔루션은 3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 또는 비 면역 혈 청 1 차 항 체로 동일한 종에서를 포함 하 여 일반적인 항 체 바인딩 차단 하 사용할 수 있습니다.
7. 탐지
- 1 차적인 항 체 외피
- Aspirate 차단 솔루션. 세척 하지 또는 린스.
- 준비 다음과 같이 (단계 7.1.5 참조) 주요 항 체 솔루션: 10 µ g/mL의 농도를 1 차적인 항 체 희석 (또는 제조 업체 ' s 제안 농도) 항 체 외피 솔루션에서 (재료의 테이블 참조 ). coverslip에이 작은 볼륨 밸런스 하 고 신중 하 게 위에 플라스틱 파라핀 영화의 사각형을 설정 합니다. 이 coverslip 통해 항 체의 작은 볼륨을 확산 하는 데 도움이 하 고 증발 방지.
- 습도 챔버에 6-잘 접시를 놓고 냉장고에서 밤새 품 어.
- 아침에는 습기에서 셀을 제거, 신중 하 게 평방 파라핀 영화는 coverslip의 표면에서 제거 하 고 기본 항 체 솔루션 발음.
- 린스 3 회 PBS, 다음 씻어 5 시간 5 분 동안 세척 블록 솔루션 (재료의 표 참조)는 회전에.
참고:이 프로토콜 사용 하 여 다음 항 체, 이미지에 대 한 안티-RFP 마우스 단일 클론 항 체 그림 2에 표시 되 고 polyclonal FP1 7 안티-Ca V 1.2 토끼 항 체 (교수에서 선물. 요하네스 지옥, UC 데이비스) 그림 3에 표시 된 이미지에 대 한. 습도 챔버에 관해서는 꽉 끼는 뚜껑 플라스틱 도시락 줄지어 젖은 종이 수건 작품. 그러나이 프로토콜 라벨 특이성을 향상 하 고 세척 단계에 대 한 희석된 차단 솔루션을 사용 하 여 배경 감소 단계, 세척에 대 한 PBS를 사용할 수 있습니다.
- 이차 항 체 외피
- 세척 솔루션을 발음 하 고 200 µ L 활용 된 이차 항 체 희석 솔루션 1:1,000 항 체 외피 솔루션에 추가. 장소는 coverslip 위에 파라핀 영화의 광장 (7.1.2 단계 참조).
- 어둠 속에서 실 온에서 1 h 품.
- Aspirate 이차 항 체와 PBS로 3 회 린스.
- 로커에 5 분에 대 한 5 배 희석 차단 솔루션 셀 세척.
- 세척 PBS 가진 5 분 동안 3 번.
참고:이 프로토콜 각각 그림 2 및 그림 3, 반대로 마우스 알 렉 사 647 활용된 2 차 항 체와 반대로 토끼 알 렉 사 647 활용 된 이차 항 체의 사용 설명. 단일 단백질 라벨에 대 한 알 렉 사 647입니다 때문에 그것의 높은 광자 수 (지역화 정밀도 향상) 및 낮은 듀티 사이클 (임시 해상도 향상) 선호 fluorophore 8. 거 또는 Cy-염료, 같은 많은 다른 fluorophore 활용 된 이차 항 체 옵션 사용할 수 있습니다. 뎀시 그 외 참조 8, Chozinski 외. 9 슈퍼 해상도 이미징에 대 한 여러 fluorophores/염료의 적합성의 포괄적인 평가.
8. -고정 (선택 사항)
- 희석 50 µ L 50%가 10 ml PBS 0.25%가 솔루션을 얻을. 후 실 온에서이 솔루션의 10 분에 대 한 셀을 수정.
- 는 회전자에 5 분 동안 3 회 PBS로 세척.
9. 샘플의 스토리지
- 냉장고 (4 ° C)에 샘플 영상까지 빛 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일 줄지어 컨테이너에 저장.
- (몇 개월)까지 샘플의 장기 저장용, 세균성 성장을 방지 하기 위해 3 m m 나트륨 아 지 드를 포함 하는 PBS에 저장.
10. GSD 슈퍼 해상도 이미징 Photoswitching 버퍼 준비
- 산소 청소 준비 ' GLOX ' 다음과 같이 솔루션:
- 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 12.5 µ L catalase (주식 34 mg/mL), 3.5 mg 추가 포도 당 산화 효소, 및 0.5 µ 1 M l 트리 스 (pH = 8) 49.5 µ L PBS에.
- 솔루션으로 구성 요소를 분해 후 4 시 3 분 20,800 x g에서 원심을 짧게 소용돌이 ° c.
참고: GLOX, 산소 청소 솔루션 photobleaching를 발견 되었습니다. GLOX 최대 1 주 동안 냉장고에서 유지 한다. 반복 분리기 단계 때마다 사용 됩니다.
- 다음과 같이 준비 photoswitching 유도 thiol 솔루션:
- PBS에서 100 m m β-mercaptoethylamine (MEA) 솔루션을 준비 하 고 pH 8 또는 양자 택일로 사용 하 여 β-mercaptoethanol (βME)에 pH를 수정. 1 주까지 동안 냉장고 (-20 ° C)에서 aliquoted MEA 솔루션 저장.
- 이미징, 직전 얼음에 최종 스위칭 버퍼는 thiol 추가 하 여 준비 및 산소 청소 구성 요소를 함께. 500 µ L에 대 한 GLOX-MEA, 50 µ L MEA에 5 µ L GLOX를 추가 (pH = 8)과 445 µ L 염 분 버퍼 (2.5 mL 1 M Tris pH = 8, 29.22 mg NaCl (10mm 최종 농도), 5 g 포도 당 및 47.5 물). 또는, GLOX-βME 솔루션 5 µ L GLOX 5 µ L βME, 490 µ L 염 분 버퍼에 추가.
- 얼음에 솔루션을 유지 하 고 필요에 따라를 사용 하 여 유리 우울증 슬라이드에 샘플을 탑재.
참고: βME 또는 MEA Thiol 포함 솔루션 photoswitching 알 렉 사 647 10 등 cyanine 기반 염료 또는 알 렉 사 568 같은 xanthene 기반 염료의 유도. MEA는 알 렉 사 568 또는 때 2 단백질 알 렉 사 568 및 647 이중 라벨 방식으로 이미지를 위한 선호 하는 반면 βME 알 렉 사 647와 더 나은 결과 생성 합니다. 버퍼의 산성화 때문에 시간 동안 저하 됩니다. 이 샘플의 평균 광자 수에 있는 감소를 이어질 것입니다. 이 방지 하려면 그것은 후 2-3 h 또는 평균 광자 수에 드롭 또는 유도 photoswitching로 이동 하는 시간의 주목할 만한 확장 관찰은 신선한 photoswitching 버퍼를 확인 하는 것이 좋습니다. 최근 기사 설명 우리는 아직 테스트 하지는 하지만 보도 전시 안정적인 산도 몇 일 동안 레벨 그리고 GLOX 멀티 컬러 이미징 응용 프로그램 11 보다 더 뛰어난 새로운 이미징 버퍼 황소 EA.
- 얼음에 솔루션을 유지 하 고 필요에 따라를 사용 하 여 유리 우울증 슬라이드에 샘플을 탑재.
11. 샘플 장착
- 우울증에 (섹션 1-9 참조) 레이블이 셀 마운트 coverslips 슬라이드, 100 µ L를 사용 하 여 이미지 버퍼.
- 인감 이미지 버퍼의 급속 한 산화를 방지 하기 위해 실리콘 접착제 coverslip의 가장자리. 잠깐 몇 분까지 실리콘 접착제는 완전히 완 치 달리는 coverslip 이미징 때 드리프트 것.
참고: 실리콘 접착제 βME의 접촉으로 오는 경우 강하게 하지 것입니다. 실리콘 접착제 이미징 버퍼를 접촉 하지 않도록 coverslip의 가장자리를 건조 해야.
12. 이미지 수집
- 이미징 그림 2 및 그림 3에 사용 된 매개 변수 목록에 대 한 표 1을 참조 하십시오.
- Fluorophore 선택에 따라 샘플을 밝히는 적절 한 레이저를 선택 하려면
- . 이 프로토콜에 사용 된 SR-GSD 시스템은 고 출력 레이저를 갖추고 (488 nm, 1.4 KW/cm 2, 532 nm, 2.1 KW/cm 2, 561 nm, 2.1 KW/cm 2 642 nm, 2.1 KW/cm 2). 642 nm 레이저를 사용 하는 그림 2.
참고: 낮은 임계값 높은 배경 이미지를 생산. 높은 임계값 관심의 신호 필터링 수 있습니다. 비 페 셀 또는 셀만 이차 항 체와 incubated의 coverslips 이미징 등 부정적인 컨트롤에 따라 임계값을 결정.
참고: 탐정 샘플에서는 프레임 이것 보다 더 찾을 수 있습니다. 더 이벤트 감지 때 fluorophore photobleaching와 수집의 관측에 따라 프레임 수를 수정.
참고: 수집의 시작 부분에 모든 염료 분자 형광 상태에 있으며 다음 어두운 상태로 전환. 프레임 상관 관계에는 0.20에 도달 하면, 이미지 획득 시작 됩니다. 프레임 당 미만 8 이벤트를 탐지할 때 405 레이저는 바닥 상태에 어두운 상태에서 전환 fluorophores 격려에, 전환 됩니다. N의 데이터 집합에 대 한 이미지를 취득 하는 경우 = n에서 셀 x TIRF 침투 깊이, 검출 임계값 및 프레임 인수 수가 일정 유지 한다와 같은 y 동물, 매개 변수를 =.
13. 분석 이미지
- 단백질 클러스터 크기 척도를 사용 하 여는 ' 입자 분석 ' ImageJ의 기능.
참고: 추가 분석 수행할 수 있습니다 확률론 광학 재건 상대 지역화 현미경 기반 분석 (스톰-RLA) 또는 유사한 13를 사용 하 여.- 클러스터 분석 ( 그림 3) ImageJ를 사용 하 여 다음과 같이 수행:
- 분석 이미지 파일을 엽니다. (섹션 12) 위에서 설명한 이미징 소프트웨어에 생성이 10 nm 히스토그램 단일 분자 지역화 지도 해야한다.
- 이미지를 시각화에 명암과 밝기 조정: 이미지 메뉴 선택에서 클릭을 다음 밝기 및 대비 조정. 자동 옵션을 클릭 합니다.
- 8 비트 이미지 형식을 변경: 이미지 메뉴를 선택 하 고 다음 유형을 선택 하 고 8 비트 선택 하십시오.
- 이미지의 축척 설정: 분석 메뉴를 열고 설정된 규모를 클릭 하 고 다음 매개 변수를 입력: 거리 = 1, 알려진 거리 = 10, 1 픽셀 = 10 nm.
- 얻을 수 측정을 선택 하려면 분석 메뉴를 열고 설정된 측정, 선택한 영역 옵션 옆에 확인란을.
- 는 이미지의 임계값을 조정합니다. 오픈 이미지 메뉴, 선택 조정, 선택한 다음 임계값 보다 높거나 선택 합니다. 255, 최대 값을 이동 하 고 1을 클릭 하 여 최소값 적용 이동.
- 입자를 분석 하려면 분석 메뉴를 열고, 분석 입자를 선택. 픽셀 단위를 선택 하 고, 결과 표시 하 고 요약 하 여를 배치 합니다. 4-무한대 크기 설정 (해상도 이기 때문에 ~ 20 nm), 맨 손으로 윤곽선 옵션을 선택 하 고 확인을 클릭 합니다. 평균 클러스터 크기와 이미지에 클러스터의 수와 같은 분석 정보를 포함 하는 요약 파일을 만들 수 것입니다.
참고: 주의 해야 행사 때 지역화 된 점의 수로 특정 클러스터 내에서 단백질의 수에 대 한 결론을 만드는 선형 상관 하지 수 단백질의. GSD localizes 염료 항 체를 활용 하 여 피토 프에서 형광 라벨을 배 수량 링크 오류 > 10 nm 어떤 방향으로. 또한, polyclonal 항 체를 사용 하는 경우 하나 이상의 항 체는 하나의 항 원에 바인딩할 수 있습니다와 혼동 문제 더욱, 상업 2 차 항 체 평균, 3-6 한 fluorophore 항상 동일 하지 않습니다 그래서 염료의 분자에, 활용은 한 단백질입니다. 1 차적인 항 체 (이차 제거)에 직접 염료를 변화 하거나 nanobody 기반 라벨링 제도 14를 사용 하 여 연결 오류를 줄일 수 있습니다.
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Representative Results
소개에 명시 된 여러 다른 슈퍼 해상도 현미경 이미징 형식 있습니다. 이 프로토콜은 GSD 슈퍼 해상도 영상에 집중 한다. 대표 이미지와 지역화 지도 그림 2 및 그림 3에 나와 있습니다.
그림 2 와 ER 단백질, mCherry-Sec61β, 위에서 설명한 메서드를 사용 하 여 처리 페 COS-7 셀을 보여 줍니다. 그림 2A -2B TIRF 모드 (A)에서 슈퍼 해상도 현미경을 사용 하 고 GSD 획득 모드 (B)를 사용 하 여 응급실의 이미지의 비교를 허용. 이미지 축 해상도 GSD 모드에서 취득 하는 경우에 향상을 보여줍니다. 이것은 더 동반 플롯 프로필, 관심 (노란색 선) 분야에서 표준화 된 강도 곡선의 분포에 차이 보여줍니다 ImageJ를 사용 하 여 생성 될 수 있는 시연. 이러한 커브는 GSD 모드에서 검사 하는 경우에 훨씬 더 좁은 것 처럼 응급실 tubules의 직경을 나타냅니다. GSD 현미경 검사 법은 약 20 nm와 따라서 나타냅니다의 측면 지역화 정밀 해상도 회절 한계 저쪽에 약 ten-fold 증가. ER tubules의 구조 더 정확한 표현에 확인 결과에이 개선.
GSD 영상 그림 3위에서 설명한 대로 안티-캘리포니아v1.2 항 체로 레이블이 지정 된 심장 myocyte를 보여주는 입증은 슈퍼 해상도에서 제공 하는 해상도에 개선. 그림 3A 에서 이미지 TIRF 설정에서 GSD 슈퍼 해상도 현미경을 사용 하 여 찍은. 클러스터 CaV1.2의 채널 t 관 네트워크에 따라 정리를 볼 수 있습니다. 그러나 그림 3B GSD 모드를 사용 하 여이 이미지 획득 하는 동일한 셀을 보여 줍니다. 축 해상도 향상은 더 채널 (그림 3B), 단일 클러스터에 있는 초점 TIRF GSD를 사용 하 여 몇 군데 같은 투자 수익 사이 비교 하면 채널의 별도 클러스터는으로 식별 하기 위해 쉽게 패널에서 눈에 띄는 GSD 영상 제공 해상도에 개선의 결과. 이 패널은 또한 픽셀 당 광자의 수로 정의 검출 임계값에 차이 비교 합니다. 이 매개 변수는 신중 하 게 선택한 고 실험의 요구에 적응 해야 합니다. 패널 3D 클러스터 개요 GSD 이미지 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 처리 된 경우,이 이미지에서 각 개별 클러스터에 대 한 클러스터 영역을 확인할 수 있습니다 (참고 위의 13.1.8 및 중요 한 고려 사항에 대 한 토론 섹션 참조 때 수행 하는 등 정량화). 이 정보는 다음 패널 3 C에 주파수 히스토그램을 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 분석 샘플 테스트 조건 (예:, WT vs 돌연변이 채널 또는 마약 치료 세포 치료 대) 대 통제 사이 클러스터 수 또는 클러스터 크기에 변화를 검사를 사용할 수 있습니다. 조사 확인 상호 보완적인 단계별 photobleaching 실험과 함께이 프로토콜에서 설명 하는 방법을 사용 하 여, 해당 CaV1.2 채널 평균, 클러스터에 배포 됩니다, 심장 myocytes15에서에서 8 채널 .
그림 1: 막 단백질의 슈퍼 해상도 이미징에 대 한 이벤트의 타임 라인의 도식 대표. 0 항 체 라벨에 대 한 처리의 첫날을 말합니다. 프로토콜 섹션 자세한 내용은 각 단계에서 발견 되는 프로토콜 섹션을 가리킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 슈퍼 해상도 현미경 잡음 신호를 개선 하 고 공간 해상도 증가 제공 합니다. (A) 왼쪽 COS-7 세포 표현 mCherry-Sec61β, 고정 및 프로토콜에 설명 된 대로 표시 및 종래의 TIRF 현미경을 사용 하 여 몇 군데. 오른쪽, 위쪽 패널: 단일 어 관. 오른쪽, 낮은 패널: 응급실 관 (노란색 선)의 너비에 걸쳐 찍은 프로필 플롯. (B) 지역화를 제외 하 고 (A) 동일한 셀 지도 GSD 슈퍼 해상도 사용 하 여 생성 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 심장 myocytes에서 Cav1.2 채널의 이미지를 초고 해상도입니다. 절연된 심장 myocyte에서 (A) TIRF 발자국 고정, 그리고 안티-CaV1.2 항 체 (FP1) 물. (B) 왼쪽: (A)와 같이 같은 심장 myocyte에서 슈퍼 해상도 TIRF 발자국. 오른쪽: 다른 감지 임계값을 복종 된 지역화 지도 부분 확대. 한 검출 임계값 증가, CaV1.2 채널 클러스터의 명백한 크기 감소는 note. (C) 클러스터 크기의 주파수 히스토그램 (B)에서 지역화 지도에서 가져온. (D) 왼쪽: (B)에서 클러스터 CaV1.2의 윤곽선. 오른쪽: 이미지의 확대 부분 다른 감지 임계값을 받게 되었습니다. 주, (B), 검출 임계값 증가 비슷한, CaV1.2 채널 클러스터 감소에 의해 점령 지역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| Fluorophore 사용 | 알 렉 사-647 |
| 레이저 | 642 nm |
| 배기 필터 | 623 HP-T |
| 렌즈 | 160 X 1.43 없음 |
| 노출 시간 | 10 ms |
| 검색 임계값 | 65 |
| 발생률 각도 (관통) | 65.04 ° (150 nm) |
| 그들 이득 | 300 |
| #frames 인수 | 30000-60000 |
| 양수에 대 한 레이저 강도 | 100% |
표 1: 매개 변수를 이미징의 목록입니다.
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Discussion
회절 한계를 넘어 이미지를 허용 하는 기술의 최근 폭발 공간과 시간에서 신호 하는 포유류 세포의 복잡성에 새로운 윈도우를 제공 했다. 이러한 기술에는 폭풍, 호텔 위치, 팜, GSD, 시뮬레이션, 및 그들의 이체 (예를 들어, dSTORM, FPALM) 포함 됩니다. 이러한 기술 뒤에 과학자의 독창성 빛의 회절을 경 세 하는 물리학의 법칙에 의해 부과 된 한계를 우회 하 것을 허용 했다. 이 거 대 한 성취에도 불구 하 고 이러한 기술 각각을 슈퍼 해상도 달성 하기 위해 타협의 어떤 종류 하 게 있으며, 따라서, 한계가 있습니다. 세포 생물학과 biophysicists 노력에 대 한 이상적인 상황 최적의 감도, 높은 해상도 빠른 인수, 아니 photobleaching입니다. 또한, 하나는 동물에서 세포를 제거 하 여 우리가 본질적으로 그들을 변경 하 고 잠재적으로 분자 역학을 변경 인식 하 고 있어야 합니다. 따라서, 수 동적, 수퍼 해상도 기술 개발 퀘스트 라이브 셀, 생활, 동물 호흡에서 단일 분자 이미징에 갑니다. 지금, 우리는 회절 제한 된 해상도에 사진 개선 이미지를 생성할 수 있는 우리의 처분에 도구를 있다. 이 문서에서는, 샘플 준비, 이미지 수집 및 분석 GSD 있도록 해상도 측면 및 축 차원에서 20, 50 nm로 각각에 대 한 논의 우리.
이 프로토콜은 Sec61β 및 CaV1.2 L 유형 캘리포니아2 + 채널, 비록 위에서 설명한 프로토콜 연구원 GSD 현미경에 그들의 자신의 실험실에서 이미지 다른 단백질 들에 대 한 템플릿으로 사용할 수 있습니다. 프로토콜의이 유형의 긍정적인 특성은 그것은 상대적으로 간단 하, 수 수정 및 다른 세포 유형의 숫자에 적용 하 고 멀티 컬러 이미징에 쉽게 적용할 수 있습니다. 분명 한계는 그 슈퍼 해상도 시스템, 단일 분자 검출 수 있는 민감한 EM-CCD 카메라와 여전히 엄청나게 비싼 경향이 많은 실험실에 대 한.
그들의 기본 이미징 기술로 슈퍼 해상도 현미경을 사용 하는 실험실의 수 성장, 더 균일 한 이해와 합의 이미지 수집, 처리, 해석에 대 한 필요 하다. 어떻게, 하나 예를 들어 colocalized 회절 제한 픽셀에 나타나지만 실제로 전혀 슈퍼 해상도 이미지/지도에서 작은 오버랩을 표시를 발산 하는 두 단백질의 근접의 수준을 계량 합니까? 실제로,이 경우 이미 이전 가정 접착 복잡 한 단백질 paxillin 및 zyxin 같은 colocalized 단백질에 생겨났다. 해상도 현미경 달성 하지 변함없이 증가, 아마도 단백질 더 이상 보고 됩니다 'colocalize' 오히려 서로 주위 선호 지역화의 패턴 비 무작위로 배포 하 하. 모든 후, 그것은 불가능 대 두 단백질을 물리적으로 정확 하 게 같은 3 차원 공간을 차지 합니다. 몇 가지 솔루션을이 분석 수수께끼는 확률적 광학 재건 현미경 기반 상대 지역화 분석 (스톰-RLA), 소문에 하면 주파수와 오버랩의 정도 계량 수를 포함 하 여 문학에 등장 하기 시작 2 사이 공동 단백질 분류 하 고 또한 겹치지 단백질13사이의 거리의 정량적 측정을 제공 합니다. 슈퍼 해상도에서 다른 한 채널을 비교할 때 두 채널 사이 올바른 레지스트리 사용 해야 하는 중요 한 과정입니다. 이 멀티 컬러 스피어 형광 구슬을 사용 하 여 각 개별 채널에 영상 그리고 이미지 오버레이 평가할 수 있습니다. 또한, SR-GSD 3D 현미경 또한 TIRF 현미경으로 작동 하 고 슈퍼 해상도 지역화 생성 TIRF에 지도,이 중요 TIRF 각도 변화에 따라 두 색 채널 간의 침투 깊이 일치 하는 샘플을 자극 하는 데 사용 하는 빛 파장
또한, 그림 3B 와 그림 3D에서 같이, 지역화 지도 '임계 처리'의 정도 따라 크게 다른 나타날 수 있습니다. 검색 임계값을 너무 낮게 설정 구조 보다 그들이 진정으로 한 스 퓨 리 어스 일반적인 라벨 '잡음'의 포함 하는 확률으로는 더 크게 나타날 수 있습니다. 반대로, 검출 임계값을 너무 높게 설정 하는 경우 다음 구조 보다 그들이 진정으로 '진짜' 이벤트 제외는 작은 나타날 수 있습니다. 따라서, 임계 처리 이유 및 주의 적용 되어야 한다. 주어진된 샘플에 대 한 합리적인 검출 임계값은 어떻게 결정 될 수 있다? 컨트롤은 키입니다. 으로 어떤 면역 라벨 방식으로 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 수행 되어야 한다 항 체의 특이성을 설명 하기 위해. 적절 한 컨트롤과 파생 검출 임계값 보다 특정 라벨만 관찰 해야 가능 하다. 적절 한 컨트롤에 있는 1 차적인 항 체 외피 생략 되었습니다만 이차 항 체에 노출 샘플 관찰 될 수 있다 그래서 샘플 포함 됩니다. 이러한 컨트롤에서 이차 항 체의 비 특정 바인딩을 분별 수 있습니다. 잘 준비 된 샘플에서이 이미지, 그리고 기본 및 보조 incubated 샘플에 비해 픽셀 당 광자의 낮은 평균 수 당 훨씬 작은 이벤트 수 될 해야 합니다. 이미지의 검출 임계값 일반적인 라벨을 제거할 수 있도록 설정할 수 있습니다. 동일한 검출 임계값 이미징 자신감 향상을 기본 및 보조 incubated 샘플 '소음'을 제거 하는 때에 다음 사용 해야 합니다. 추가 컨트롤 기본 항 체의 특이성을 테스트 포함 됩니다. Transfected 세포에 레이블이 단백질 셀 라인에 기본적으로 표시 되지 다음 주 항 체 특이성의 간단한 테스트 경우 untransfected 세포에 라벨링 절차를 수행 하려면. 1 차 셀에서 1 차적인 항 체 특이성을 보여 레이블이 단백질의 유전자 녹아웃 골드 표준입니다. 또한 이러한 기본 항 체 제어 실험을 사용 하 여 감지 임계값에 설정할 수 있습니다. 대상 항 원의 부재, 모든 형광 방출은 일반적인입니다. 좋은 기본 항 체와 보조만 컨트롤과 이미지 당 적은 이벤트를 관찰 해야 하 고 따라서 같은 수 프레임의 낮은 픽셀 당 광자의 수 의미는 분명 하 게 해야 합니다. 검색 임계값 따라서 일반적인 배경에서 대상 1 차 항 체 바인딩 인해 얼룩 제거 하는 수준으로 설정할 수 있습니다. 완전 한 투명성에 대 한 그들의 임계 처리 매개 변수를 명확 하 게 명시와 아마도 한 onlin에 원시 데이터에 대 한 링크와 함께 작가 이미지를 선물 해야 한다 건의 된다e 공탁입니다.
탐정은 또한 인식 하 고 그래서 1:1 차: 2 차 바인딩 비율을 가정해 야 여러 2 차 항 체는 단일 기본 항 체에 바인딩할 수 있어야 합니다. 또한, 상업 2 차 항 체는 일반적으로 여러 fluorophores에 활용 된, 예를 들어이 프로토콜에 2 차 항 체는 지적 2-8 fluorophores에 활용 하는 제조 업체에 의해. 해결 방법으로, fluorophore는 직접 기본 항 체에 활용 될 수 있습니다. 분 광 광도 법 다음 fluorophores 기본 항 체 당 평균 수를 확인할 사용할 수 있습니다. 여러 상용 키트가 활용 프로세스를 수행할 수 있습니다. 그러나, 경우에 1:1 산출할 달성, fluorophore 분자 자체 깜박 하 고 되돌릴 수 fluorophores의 전환 때문에 추가 overcounting 문제를 만들 수 있습니다. 실제로,이 fluorophore 지상과 흥분된 상태 그것이 그렇게 클러스터 광자의 방출 사이 여러 번 주기 수 있습니다 의미 합니다. 이러한 광자 여러 인접 한 픽셀에 검색 될 수 있습니다 고 클러스터 크기의과. 다른 조사자는 형광 방출 시간 및 공간16,17의 짧은 기간 동안 클러스터를 결합 하 여 선택 하 여이 문제를 언급. 이것은 여전히 같은 fluorophore 수 어두운 상태로 오랜된 기간, 다음 자전거/발광 상태를 반전에 대 한 한 번 더 하 고 두 번째 분자로 판단 하는 가능성을 제거 하지 않습니다 다소 경험적 접근. 따라서, 클러스터에 있는 분자의 수 없습니다 수 기준으로 계산 클러스터 크기에. 순간, 이러한 문제에 더 완벽 한 솔루션 이며, 따라서, 단계별 photobleaching 같은 다른 기술 함께에서 슈퍼 해상도 이미지를 사용 하 여 클러스터 당 분자의 수의 대략적인 견적을 줄 수 있습니다. 클러스터 영역 측정에 신뢰를 높이기 위해 관련 컨트롤 제안으로 관심사의 단백질의 알려진된 단위체 단백질 (예를 들어, CD86) 및 알려진된 dimeric 단백질 (예를 들어, CTLA-4)의 클러스터 크기를 비교를 포함 Fricke 외. 18.
요약 하자면, 현재 문서에서 간단한 immunolabeling 프로토콜 앞 슈퍼 해상도 이미징에 대 한 고정된 샘플의 준비를 설명 설정 됩니다. 또한, 이미지 수집 및 분석에 몇 가지 일반적인 함정을 설명 합니다. 슈퍼 해상도 영상 더 일반화 되면서, 그것을 막기 위해 이러한 복잡 한 이미지/지역화 지도의 부적절 한 조작 지침의 새로운 집합을 저널에 필요한 될 수 있습니다. 슈퍼 해상도 현미경 세포 생물학과 biophysicists의 도구 상자에 강력한 새로운 도구를 추가 하 고 세포 구조 및 분자 조직에 대 한 우리의 이해에 특별 한 영향을 이미 했다.
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Disclosures
저자는 공개 없습니다 경쟁 관심사 있다.
Acknowledgments
이 작업은 R.E.D. (15SDG25560035)에 AHA에서 교부 금에 의해 지원 되었다. 저자 박사 페르난도 산타나 그의 Leica SR GSD 3D 현미경의 사용을 위해 친절 하 게 제공 FP1 항 체에 대 한 박사 요하네스 지옥 인정 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | To clean coverglass |
| #1.5 coverglass 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | To grow/process/image cells |
| 10x PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Dilute to 1x with de-ionized water |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| laminin | Sigma | 114956-81-9 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventricular myocyte culture media |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media supplement |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | Media supplement |
| 0.05% trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Cell culture solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection reagent |
| Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Cell culture |
| 100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Cell Fixation |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA or other blocking solution alternatives exist |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent to permeabilize cells |
| Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | Gift | N/A | Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Secondary antibody |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Prevents microbial growth for long term storage of samples |
| Catalase | Sigma | C40 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Photoswitching buffer ingredient |
| Tris | Sigma | T6066 | Photoswitching buffer ingredient |
| beta-Mercaptoethylamin hydrochloride | Fisher | BP2664100 | Photoswitching buffer ingredient |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoswitching buffer ingredient |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Photoswitching buffer ingredient |
| Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glass Depression slides | Neolab | 1 – 6293 | To mount samples |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | To seal coverglass |
| sec61β-mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD 3D microscope | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Washing block solution | 20 % SEAblock in PBS | ||
| Primary antibody incubation solution | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
| Secondary antibody incubation solution | 1:1000 in PBS |
References
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit. JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
- Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving. Phys Rev Lett. 98 (21), 218103 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (58), e3302 (2011).
- Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase. J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging. FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).
- Dempsey, G. T., et al. Photoswitching mechanism of cyanine dyes. J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
- Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
- Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies. Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).
- Dixon, R. E., et al. Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels. Elife. 4, (2015).
- Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).
- Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy. Sci Rep. 5, 14072 (2015).
