Summary
Este artigo descreve um protocolo para a detecção de um ou mais plasma e/ou proteínas de membrana intracelular usando microscopia de super-resolução depleção do estado fundamental (GSD) em células de mamíferos. Aqui, vamos discutir os benefícios e as considerações do uso de tais abordagens para a visualização e a quantificação de proteínas celulares.
Abstract
Avanços na fluorescente microscopia e biologia celular são intimamente correlacionados, com a maior capacidade de Visualizar eventos celulares, muitas vezes levando a saltos dramáticos na nossa compreensão de como as células função. O desenvolvimento e a disponibilidade de microscopia de super-resolução ampliou consideravelmente os limites de resolução óptica de ~ 250-20 nm. Os biólogos não estão mais limitados para descrever interações moleculares em termos de colocalization dentro de uma área de difração limitada, prefiro agora é possível visualizar as interações dinâmicas de moléculas individuais. Aqui, nós esboçamos um protocolo para a visualização e a quantificação de proteínas celulares por microscopia de depleção do estado fundamental para a imagem latente de celular fixo. Nós fornecemos exemplos de duas proteínas de membrana diferentes, um elemento de um membrana plasmática-localizada voltagem-dependente tipo L Ca2 + canal (CaV1.2), o retículo endoplasmático translocon e sec61β. Discutidos são os parâmetros específicos do microscópio, métodos de fixação, foto-interruptor formulação da reserva e armadilhas e desafios de processamento de imagem.
Introduction
Reações de sinalização celulares traduzem mudando ambientes internos e externos para iniciar uma resposta celular. Eles regulam todos os aspectos da fisiologia humana, servindo como base para o hormônio e liberação de neurotransmissores, o batimento cardíaco, visão, fertilização e função cognitiva. Interrupção destas cascatas de sinalização pode ter consequências graves na forma das condições fisiopatológicas, incluindo a doença de Alzheimer, Parkinson e câncer. Durante décadas, biológicos e médicos investigadores usaram com sucesso proteínas fluorescentes, sondas e biosensores juntamente com microscopia de fluorescência, como as principais ferramentas para compreender a organização espacial e temporal precisa desses celulares sinais.
Os pontos fortes de técnicas ópticas como epifluorescência, confocal, ou microscopia de fluorescência (TIRF) de reflexão interna total são sua sensibilidade, velocidade e compatibilidade com imagens de células vivas, enquanto a principal limitação é a sua resolução de difração limitada, estruturas de significado ou complexos de proteínas menores que 200-250 nm não podem ser resolvidos. Com o desenvolvimento teórico e prático de super-resolução determinístico (estruturado, por exemplo, emissão estimulada depleção microscopia (STED1), microscopia de iluminação (SIM2) ou estocástica Super-resolução (por exemplo, , fotoativados localização microscopia (PALM3), ou estado fundamental depleção (GSD4,5)), resolução axial e lateral em microscopia de fluorescência foi estendida para além da barreira de difração, a ordem de dezenas de nanômetros. Assim, os investigadores agora têm a capacidade incomparável de Visualizar e compreender como a organização e dinâmica da proteína se traduz em função ao nível molecular perto.
Microscopia de depleção estado fundamental individual molécula de retorno (GSDIM), ou simplesmente GSD como é conhecido, contorna o limite de difração, reduzindo o número de simultaneamente emitindo fluorophores4,5. Luz de laser de alta energia é usada para excitar a amostra com rótulo fluoróforo, bombardeando elétrons com fótons e aumentando a probabilidade de eles passam por um 'spin-flip' e insira o triplet ou 'escuro ' estado do estado excitado4. Isso efetivamente esgota o estado da terra, daí o nome 'terrestres depleção do estado'. No estado triplete, fluorophores não emitem fótons e a amostra aparece mais não ofuscante. No entanto, estes fluorophores estocàstica retornar para o estado do solo e pode passar por vários fótons emitindo as transições de estado excitado-terra antes de retornar ao estado tripleto. Com menos fluorophores emitindo em um determinado momento, rajadas de fótons emitidos a partir fluorophores individuais tornam-se espacial e temporalmente distintas das vizinhas fluorophores. A explosão de fótons pode ser cabido com uma função gaussiana, o centroide calculado que corresponde à posição do fluoróforo com uma precisão de localização que é dependente da abertura numérica (NA) da lente, o comprimento de onda da luz usada para excitação e crucialmente, o número de fótons emitidos por fluoróforo. Uma limitação do GSD é que, uma vez que apenas um subconjunto de fluorophores ativamente emite a qualquer momento, milhares de imagens devem ser recolhidas ao longo de vários minutos para construir um mapa de localização completa. O tempo de aquisição tempo combinado com a exigência de laser de alta potência, significa que a GSD é mais adequado para fixo ao invés de amostras vivas.
Neste artigo, descreve a preparação de amostras fixas para imagem de microscopia de super-resolução de membrana e o retículo endoplasmático (ER)-proteínas residentes (para uma lista de reagentes ver a Tabela de materiaise consumíveis necessários). Exemplos de como este protocolo pode ser facilmente adaptado para quantificar o tamanho e o grau de agrupamento do tipo L voltagem Ca2 + canais (Cav1.2) no sarcolema dos miócitos, ou usado para visualizar a distribuição celular de emergência, são demonstradas. Compreender a distribuição e a organização desses componentes celulares é criticamente importante na compreensão da iniciação, tradução e, finalmente, a função de muitos Ca2 +-dependentes cascatas de sinalização. Por exemplo, canais de Cav1.2 são fundamentalmente importantes para a excitação-contração, acoplamento, enquanto mediada Ca2 + lançamento da emergência é talvez a mais ubíqua cascata de sinalização em células de mamíferos.
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Protocol
1. lavar as lamelas de vidro
- o dia antes do processamento da amostra, limpar as lamelas de vidro #1.5 pelo sonicating em uma solução 1 M de KOH por 1h. Isso remove qualquer fluorescentes contaminantes que possam estar presentes nas lamelas.
- Enxaguar o KOH das lamelas com água desionizada.
- Uma vez que limpou em KOH, armazenar as lamelas em etanol a 70% até estar pronto para usar.
2. As lamelas de vidro revestimento
Nota: as etapas nesta seção devem ser executadas em uma capa de cultura de células para evitar a contaminação.
- Use a pinça para remover um módulo individual de solução de etanol a 70% e chama rapidamente para remover o excesso. Lugar de lamelas em uma placa de 6. Se em chamas em um capuz de cultura não é uma opção, considere autoclave as lamelas após enxaguar com água desionizada e/ou esterilização sob a luz do bairro de cultura pelo menos 30 min. de UV
- Para auxiliar a adesão das células, revestir as lamelas com 0.01% poli-L-lisina do estéril por 1h à temperatura ambiente.
- Aspire o poli-L-lisina e enxágue as lamelas com soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS). Secar ao ar e coloque no frigorífico durante a noite.
- Na manhã seguinte, retire as lamelas da geladeira e adicione 300 µ l de laminina, em uma concentração de 50 µ g/mL, pelo menos 30 min à temperatura ambiente. Certifique-se de que a laminina é cuidadosamente colocada diretamente no sentido do lamela.
Nota: Este passo de laminina não é necessário para células COS-7 ou células HEK293 mas é necessário para miócitos ventriculares isolados. Outras células primárias tais como células de músculo liso vascular ou neurônios podem aderir melhor ao colágeno ou fibronectina revestido lamelas.
3. Preparação de células
- pilhas cultivadas
- COS-7 crescer células (ou linha celular preferido) em um prato de cultura de 10 cm em 10 mL Dulbecco ' s modificado águias médio (DMEM) cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% solução de penicilina/estreptomicina (PS). Crescem as células em uma incubadora de cultura celular em 37 ° C e 5% de CO 2.
- Quando as células atingem 90% confluência, colhê-las do prato 10cm por aspiração a mídia DMEM e adicionar 5 mL da solução de EGTA-tripsina 0,05%. Uma vez que as células começam a reunir e separar, neutralize imediatamente a tripsina com DMEM completada.
- Uso uma 5 mL pipeta sorológica para remover as células do prato. Pipetar o meio contra a base do prato várias vezes para remover quaisquer células que permanecem aderentes e homogênea, distribuir as células em todo o meio de cultura.
- Células em pratos de cultura 35mm para alcançar a confluência de 70% para transfeccao da placa. Tornar o volume de meio no prato de 2 mL com solução fresca DMEM/FBS/PS. Construções
- células COS-7 transfect com o ADN do plasmídeo desejado (por exemplo, sec61β-mCherry do plasmídeo), usando um reagente de transfeccao apropriado e de acordo com o fabricante ' instruções de s.
Nota: Pode demorar 24 a 48 h para a proteína expressar, dependendo o plasmídeo e/ou o reagente de transfeccao usado.
- Rato adulto miócitos ventriculares
- isolar o rato adulto miócitos ventriculares usando o bem-estabelecida Langendorff perfusão método 6. Ressuspender o sedimento resultante de miócitos em meio 199 (M199) suplementado com 2,5% FBS e 1% de PS.
4. Chapeamento de células
- células transfectadas COS-7
- aspirar 2 mL de solução DMEM/FBS/PS de prato de 35 mm e adicione 1 mL de Ca 2 +-livre de PBS. Devolver o prato incubadora para 2 min. células de colheita do prato aspirando primeiro o Ca 2 +-livre PBS e em seguida, adicionar 1 mL de solução de EGTA-tripsina 0,05%.
- , Uma vez que as células começam a reunir e separar, neutralizar imediatamente a tripsina com 1 mL de DMEM completada. Pipetar delicadamente acima e para baixo várias vezes para garantir que as células transfectadas estão distribuídas uniformemente através da suspensão de tripsina-EGTA-DMEM de 2 mL.
- Placa transfectadas células COS-7 em lamelas revestidas de poli-L-lisina em uma densidade adequada para que células individuais podem ser visualizadas e preencher o volume do prato com DMEM/FBS/PS até 2 mL (por exemplo, adicionar a suspensão de células 90 µ l a lamela Adicione 1.910 µ l completado DMEM, redemoinho prato para distribuir células uniformemente).
Nota: As células não precisam ser contados, mas o volume das células para ser adicionado a cada prato variam de acordo com a confluência das células. - Retorno chapeado de células para a incubadora de cultura de células durante a noite para permitir que as células de aderir e recuperar.
- aspirar 2 mL de solução DMEM/FBS/PS de prato de 35 mm e adicione 1 mL de Ca 2 +-livre de PBS. Devolver o prato incubadora para 2 min. células de colheita do prato aspirando primeiro o Ca 2 +-livre PBS e em seguida, adicionar 1 mL de solução de EGTA-tripsina 0,05%.
- Rato adulto miócitos ventriculares
- Aspire miócitos laminina e placa diretamente sobre as lamelas revestidos em uma densidade adequada para que as células individuais podem ser visualizadas. Isso vai depender da densidade das células viáveis, obtidos a partir do isolamento.
- Equilibrar a suspensão de células em uma cúpula sobre o local em uma incubadora de cultura celular em 37 ° C e 5% CO 2 para ~ 45 min permitir a adesão e a lamela.
5. Fixação de células
- remover células da incubadora e Aspire cuidadosamente com o meio.
- Enxaguar as células aderentes uma vez com PBS.
- Células de reparo com um fixador otimizado para a aplicação individual e anticorpos.
Nota: Um critério importante para manter em mente ao selecionar um fixador é a preservação da estrutura celular da amostra, garantindo também que não há alteração conformacional no antígeno de interesse. Para efeitos da fixação deste protocolo 3% paraformaldehyde/0.1% glutaraldeído (PFA/GA) e fixação com 100% metanol é discutido.
- PFA/GA fixação de transfected COS-7 células expressando Sec61β-mCherry
- misturar 1,9 mL 16% PFA e 20 µ l 50% GA e adicionar PBS para tornar um volume final de 10 mL.
- Adicionar 1 mL recentemente preparada solução PFA/GA para cada prato de células e correção durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Aspirar as células PFA/GA e lave 3 vezes com PBS.
- Lavar as células aderidas com PBS, 5 vezes por 5 min cada. Executar todas as etapas de lavagem em rotacao definido como uma velocidade moderada (por exemplo, 50 ciclos por minuto).
- Em seguida, reduzir os grupos aldeído livre com 1 mL preparadas de borohidreto de sódio 0,1% em massa/volume em água deionizada.
- Células de enxaguar duas vezes em seguida lavagem 3 vezes durante 5 min em PBS para remover todos os vestígios de borohidreto de sódio e o álcool produz quando reage com aldeídos livre.
- Fixação de metanol de rato adulto miócitos ventriculares
- cuidadosamente, adicione 1 mL de gelado 100% de metanol para as células. Inclinar a placa de 6 e pipetar o metanol contra a parede lateral, em vez de diretamente no sentido do lamela. Em seguida, incline a placa de 6 para horizontal para permitir que o metanol lavar uniformemente sobre as células. Correção para min 5 a-20 ° C.
- Aspirar as células fixador e lavagem 3 vezes com PBS.
- Lavar as células aderidas com PBS, 5 vezes por 5 min em rotacao.
6. Bloqueio de ligação não-específica
- bloco por 1h à temperatura da solução de bloqueio (veja a Tabela de materiais).
Nota: Várias soluções podem ser usadas para bloquear a ligação de anticorpos inespecíficos, incluindo 3% albumina de soro bovino (BSA) ou soro não imune da mesma espécie que o anticorpo primário.
7. Deteção
- incubação do anticorpo primário
- aspirar a solução do bloqueio. Não lavar ou enxaguar.
- Preparar a solução de anticorpo primário como segue (ver passo 7.1.5): diluir o anticorpo primário a uma concentração de 10 µ g/mL (ou fabricante ' s sugeriu concentração) da solução de incubação do anticorpo (consulte a tabela de materiais ). Equilibrar este pequeno volume na lamela e definir cuidadosamente um quadrado de filme plástico parafina no topo. Isso ajuda a espalhar o pequeno volume de anticorpo sobre a lamela e protege contra a evaporação.
- Colocar a placa de 6-poços em uma câmara de umidade e incubar durante uma noite na geladeira.
- Da manhã, remover as células da câmara de umidade, cuidadosamente remova a película de parafina quadrada da superfície da lamela e aspirar a solução de anticorpo primário.
- Lavar 3 vezes com PBS, e depois lavar 5 vezes por 5 min com bloco de solução de lavagem (ver Tabela de materiais) sobre o rotator.
Nota: Este protocolo usa os seguintes anticorpos, anti-RFP anticorpo monoclonal de rato para imagens exibidas na Figura 2 e FP1 policlonal anti-Ca 7 V 1.2 de coelho anticorpo (um presente do Prof. Inferno de Johannes, UC Davis) para imagens exibidas na Figura 3. Com relação à câmara de umidade, uma lancheira de plástico com uma tampa tight-fitting, forrada com toalhas de papel molhadas obras. PBS pode ser utilizado para a lavagem de passos, no entanto, este protocolo melhora a especificidade rotulagem e reduz o fundo usando uma solução diluída de bloqueio para as etapas de lavagem.
- Incubação do anticorpo secundário
- aspirar a solução de lavagem e adicionar 200 µ l de conjugado anticorpo secundário 1:1,000 de solução diluída em solução de incubação do anticorpo. Coloque um quadrado de película de parafina em cima a lamela (consulte a etapa 7.1.2).
- Incubar por 1h à temperatura ambiente no escuro.
- Anticorpo secundário aspirado e lavar 3 vezes com PBS.
- Lavar as células com solução diluída de bloqueio 5 vezes por 5 min no roqueiro.
- Lavagem 3 vezes por 5 min com PBS.
Nota: Este protocolo descreve o uso de anticorpo secundário conjugado de anti-rato 647 Alexa e anticorpo secundário conjugado de anti-coelho 647 Alexa para Figura 2 e Figura 3, respectivamente. Para a rotulagem só proteína, 647 Alexa é o fluoróforo preferido devido a sua contagem de fótons de alta (melhora a precisão de localização) e ciclo de trabalho de baixa (melhora a resolução temporal) 8. Muitas outras opções de fluoróforo conjugado anticorpo secundário, como Atto ou Cy-corantes, estão disponíveis. Referir-se a Dempsey et al 8 e Chozinski et al. 9 avaliações abrangentes da aptidão de vários fluorophores/corantes para a imagem latente de super-resolução.
8. Pós-fixação (etapa opcional)
- diluir 50 µ l 50% GA em 10 mL de PBS para obter uma solução de GA de 0,25%. Fixar as células durante 10 minutos nesta solução à temperatura ambiente.
- Lavagem com PBS 3 vezes por 5 min em rotacao.
9. Armazenamento de amostras
- armazenar amostras no frigorífico (4 ° C) em um recipiente de forrada de folha de alumínio para proteger da luz até imagens.
- Para o armazenamento de longo prazo das amostras (até diversos meses), armazenar em PBS contendo azida sódica 3 mM para evitar o crescimento bacteriano.
10. GSD Super-resolução Imaging Photoswitching Buffer preparação
- preparar a eliminação de oxigênio ' GLOX ' solução da seguinte maneira:
- em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, adicione 12,5 da catalase de µ l (estoque 34 mg/mL), 3,5 mg glicose oxidase e 0,5 µ l 1 M Tris (pH = 8) para 49,5 µ l PBS.
- Vortex brevemente para dissolver os componentes em solução e centrifugar a 20.800 x g, durante 3 min a 4 ° C.
Nota: soluções de eliminação de oxigênio como GLOX, foram encontrados para se opor fotobranqueamento. GLOX deve ser mantida na geladeira por uma semana. Repita a etapa de centrifugação cada vez que é usado.
- Solução de tiol preparar o photoswitching de indução como segue:
- preparar a solução de β-mercaptoethylamine (MEA) 100mm em PBS e modificar o pH pH 8 ou, alternativamente, uso de β-mercaptoetanol (βME). Armazenar a solução MEA aliquotada no freezer (-20 ° C) por até 1 semana.
- Imediatamente antes de imagem, prepare o buffer de comutação final no gelo, acrescentando o tiol e eliminação de oxigênio componentes juntos. Para 500 µ l GLOX-MEA, adicione 5 µ l GLOX a 50 µ l de MEA (pH = 8) e 445 µ l tampão salino (pH de Tris 2,5 mL 1 M = 8, 29,22 mg NaCl (concentração final de 10 mM), 5 g glicose e 47,5 mL de água). Como alternativa, para solução de GLOX-βME adicionar 5 µ l GLOX 5 µ l βME e tampão salino de 490 µ l.
- Manter as soluções no gelo e usar conforme necessário para montar amostras em lâminas de vidro depressão.
Nota: Soluções contendo Thiol, como βME ou MEA induzem photoswitching de corantes baseados em cianina como Alexa 647 10 ou corantes xanteno-baseados tais como Alexa 568. ΒME que produz melhores resultados com Alexa 647 enquanto MEA é preferido para Alexa 568 ou quando 2 proteínas são para ser fotografada com uma dupla abordagem rotulagem utilizando tanto Alexa 568 e 647. A reserva irá deteriorar-se durante um período de horas devido a acidificação. Isto levará a uma redução na contagem de fótons média da amostra. Para evitar isso, é aconselhável fazer reserva de photoswitching fresco após 2-3 h ou se uma queda na contagem de fótons média ou uma notável extensão de tempo despendido para photoswitching induzido é observado. Um recente artigo descrito um buffer de imagem novo Ox-EA que nós ainda não testei mas alegadamente pH estável exposições níveis por vários dias e executa melhor que GLOX para multi cor de aplicações de imagens 11.
- Manter as soluções no gelo e usar conforme necessário para montar amostras em lâminas de vidro depressão.
11. Amostras de montagem
- Monte de lamelas com pilhas etiquetadas (consulte as seções 1-9), na depressão slides, usando 100 µ l tampão de imagem.
- Selar as bordas da lamela com uma cola de silicone para evitar oxidação rápida do buffer de imagem. Espere alguns minutos até que a cola de silicone totalmente curado, caso contrário, a lamela vai derrapar quando imagem.
Nota: Cola de Silicone não endurecerá se ele entra em contato com βME. Não se esqueça de secar as bordas da lamela para evitar que a cola de silicone em contato com o buffer de imagem.
12. Aquisição de imagem
- Ver tabela 1 para obter uma lista de imagens, parâmetros usados na Figura 2 e Figura 3.
- Para começar, selecione o laser adequado para iluminar a amostra dependendo o fluoróforo selecionado. O sistema de SR-GSD utilizado neste protocolo é equipado com lasers de alta potência (488 nm, 1.4 KW/cm 2; 532 nm, 2,1 KW/cm 2; 561 nm, 2,1 KW/cm 2 642 nm, 2,1 KW/cm 2). Figura 2 usado o laser de nm 642.
- Usar uma lente objetiva de imersão de óleo com uma alta NA. O sistema de SR-GSD usado aqui é equipado com um HC PL APO 160 X / 1,43 objectivo at.
- Escolheu o cubo de imagem apropriado dicroicos. O sistema SR-GSD neste protocolo é equipado com 488 HP-T, T, HP-532 HP 568-T, HP 642-T com filtros passa-banda de emissão de 505-605 nm, 550-650 nm e 660-760 nm.
- Selecione o modo de aquisição 2D. Configurar a câmera para quadro-transferência modo e tempo de exposicao de 10 ms (100 Hz). Defina o ganho EM 300. Selecione a deteccao de threshold.
Nota: Baixos limiares produzem imagens com fundo elevado. Limiares elevados podem filtrar o sinal de interesse. Determinar o limiar baseado em controles negativos como lamelas de células não-transfectadas ou células incubadas com anticorpo secundário apenas de imagem. - Ativar auto controle de evento e definidos eventos por imagens para 8.
- Digite o tamanho do pixel na aba GSD-aquisição (começar com 10 nm ou tamanho de pixel 20 nm). Certifique-se de que " modo de histograma " está selecionada na guia ferramentas GSD sob as opções de cálculo de imagem de alta resolução antes de aquisição de imagem.
- De proteínas na membrana plasmática de imagem, selecione o modo TIRF e modificar o ângulo de incidência para determinar a profundidade de penetração.
- Para enviar elétrons para o estado escuro (chamado de bombeamento), defina a intensidade do laser para 100%.
- Selecionar deteção única molécula durante o bombeamento e conjunto para adquirir automaticamente quando a correlação do frame é 0,20.
- Para aquisição, definir a intensidade do laser para 50%.
- Definir o número de quadros-aquisição de 60.000.
Nota: O investigador pode achar que uma amostra requer mais ou menos do que isso. Modificar a contagem de quadro, baseada em observações de fluoróforo fotobranqueamento e paragem de aquisição, quando não há mais eventos são detectáveis. - Iniciar aquisição.
Nota: No início da aquisição, todas as moléculas do corante são no estado fluorescente e alterne para o estado escuro. Quando a correlação do frame atinge 0.20, imagens vão começar a ser adquirida. Quando menos de 8 eventos são detectados por quadro, o laser 405 irá acender, incentivando fluorophores a transição do estado escuro para o estado fundamental. Aquando da aquisição de imagens para um conjunto de dados de n = x células de n = y animais, parâmetros, tais como TIRF profundidade de penetração, deteccao de threshold e número de quadros adquiridos devem ser mantidos constantes.
13. Análise de imagem
- para quantificar o tamanho do cluster de proteína, use o ' analisar partículas ' característica do ImageJ.
Nota: Uma análise mais aprofundada pode ser realizada usando a análise de localização relativa baseado em microscopia de reconstrução óptica estocástico (tempestade-RLA) ou similares 13.- Executar a análise de cluster ( Figura 3) usando o ImageJ como segue:
- abrir o arquivo de imagem para ser analisado. Este deve ser um mapa de localização de molécula de histograma de 10 nm, conforme gerado no software de imagem descrito acima (seção 12).
- Ajustar o brilho e o contraste para visualizar a imagem: clique no menu imagem, selecione ajustar, em seguida, brilho e contraste. Clique na opção auto.
- Mudar o tipo de imagem de 8 bits: selecione o menu de imagem, em seguida, selecione tipo e escolher 8 bits.
- Definir a escala da imagem: Abra o analyze menu, clique em definir escala e insira os seguintes parâmetros: distância = 1, conhecido distância = 10, 1 pixel = 10 nm.
- Para selecionar as medições a serem obtidos, abra o menu analyze, selecione o conjunto de medições e marque a caixa ao lado a opção área de.
- Ajustar o limite da imagem. Abrir o menu de imagem, selecione ajustar e selecione limiar, selecione acima/abaixo. Mover o valor máximo de 255 e mover o valor mínimo para 1 e clique em aplicar.
- Para analisar as partículas, abra o analyze menu, selecione analisar partículas. Coloque uma marca de seleção para selecionar unidades de pixel, exibir os resultados e resumir. Definir o tamanho de 4-infinito (desde que a resolução é ~ 20 nm), selecione a opção contornos desencapado e clique okey. Será criado um arquivo de resumo que conterá os detalhes da análise tais como o tamanho do cluster média e o número de clusters na imagem.
Nota: Cuidado deve ser exercitado quando fazer conclusões sobre o número de proteínas dentro de um cluster específico, como o número de pontos localizados não é linearmente correlacionado com o número de proteínas. GSD localiza corantes que são conjugados com anticorpos, resultando em um erro de ligação impregnam a etiqueta fluorescente do epítopo por > 10 nm em qualquer direção. Além disso, se os anticorpos policlonais são usados, mais de um anticorpo pode se ligar a um antígeno único e para confundir o questão ainda mais, comercial secundário anticorpos são conjugados para, em média, 3-6 moléculas de corante para que um fluoróforo não é sempre igual uma proteína. Erro de ligação pode ser reduzido por conjugar uma tintura diretamente ao anticorpo primário (eliminando o secundário) ou usando um nanobody com base em esquema etiquetando 14.
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Representative Results
Conforme documentado na introdução, há muitos microscopia de super-resolução diferentes modalidades de imagem. Este protocolo, centra-se na imagem de super-resolução GSD. Imagens representativas e mapas de localização são mostrados na Figura 2 e Figura 3.
A Figura 2 mostra uma célula de COS-7 transfectada com o ER proteína, mCherry-Sec61β e processado usando o método descrito acima. Figura 2A -2B permitir a comparação de imagens do re tirada usando um microscópio de super-resolução no modo TIRF (A) e usando o modo de aquisição de GSD (B). As imagens mostram uma melhoria na resolução axial quando adquiridos no modo GSD. Isso é demonstrado mais no perfil de trama de acompanhamento, que pode ser gerado usando o ImageJ, que mostra a diferença na distribuição das curvas de intensidade normalizada para as áreas de interesse (linha amarela). Estas curvas representam o diâmetro dos túbulos ER que parecem ser muito mais estreito quando examinado no modo GSD. Microscopia GSD tem uma precisão de localização lateral de aproximadamente 20 nm e, portanto, representa aproximadamente um aumento de dez vezes na resolução além do limite de difração. Esta melhoria na resolução resulta em uma representação mais precisa da estrutura dos túbulos ER.
A melhoria na resolução oferecida pela super-resolução imagem GSD ainda mais é demonstrada na Figura 3, mostrando um miócito cardíaco rotulado com um anticorpo anti-Cav1.2, processado conforme descrito acima. A imagem na Figura 3A foi tirada usando um microscópio de super-resolução GSD em configuração TIRF. Clusters de CaV1.2 canais podem ser vistos a organizar junto à rede do túbulo-t. Figura 3B mostra a mesma cela, no entanto, esta imagem foi adquirida usando o modo de GSD. A melhoria na resolução axial é mais proeminente nos painéis que incidem sobre clusters única de canais (Figura 3B), quando é feita uma comparação entre o ROI mesmo fotografado usando TIRF e GSD, clusters separados dos canais são mais fáceis de identificar como um resultado da melhoria na resolução oferecida pela imagem latente de GSD. Estes painéis também comparam a diferença da deteccao de threshold definido como o número de fótons por pixel. Este parâmetro deve ser escolhido com cuidado e adaptado às exigências do experimento. Painel 3D mostra contornos de cluster quando a imagem GSD foi processada usando software ImageJ, a partir desta área de cluster para cada cluster individual da imagem pode ser determinada (ver nota 13.1.8 acima e a seção de discussão para considerações importantes ao realizar tal uma quantificação). Esta informação, então, pode ser usada para gerar o histograma de frequência em painel 3C. Esta análise pode ser usada para examinar as alterações no tamanho do cluster, ou o número de clusters entre amostras sob controle versus condições de teste (por exemplo, canais de mutante WT vs ou vs não tratada tratada com drogas células). Usando as abordagens descritas neste protocolo juntamente com experiências complementares fotobranqueamento passo a passo, os investigadores determinaram que CaV1.2 canais são distribuídos em grupos de, em média, 8 canais em miócitos15 .
Figura 1: representação esquemática do cronograma de eventos para a imagem latente de super-resolução de proteínas de membrana. Dia 0 refere-se ao primeiro dia de processamento para a rotulagem de anticorpo. A seção de protocolo refere-se à seção no protocolo onde encontra-se informações detalhadas sobre cada etapa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: microscopia de super-resolução oferece melhorou o sinal para ruído e aumento da resolução espacial. (A) esquerda COS-7 células expressando mCherry-Sec61β, fixo e rotulados conforme descrito no protocolo e fotografada usando microscopia TIRF convencional. Painel superior direito: único túbulo de ER. Painel inferior, direito: traçar perfil tomado em toda a largura do túbulo ER (linha amarela). (B) mesma célula como (A), exceto a localização mapa foi gerado usando a Super-resolução GSD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem latente de super-resolução de canais de Cav1.2 em miócitos. (A) TIRF pegada de um miócito cardíaco isolado, fixo e corados com anti-CaV1.2 anticorpo (FP1). (B) esquerda: pegada de super-resolução TIRF partir o miócito cardíaco mesmo como em (A). Direita: ampliado partes do mapa de localização que foram sujeitas a limites de deteção diferentes. Note que como um aumenta o limite de deteção, diminuir o tamanho aparente de CaV1.2 canal clusters. (C) histograma de frequência de tamanhos de cluster obtidos a partir do mapa de localização em (B). (D) esquerda: contornos do CaV1.2 clusters de (B). Direita: alargadas porções da imagem foram submetidas a limites de deteção diferentes. Nota, semelhante a (B), à medida que aumenta o limite de deteção, a área ocupada pela CaV1.2 canal aglomerados diminui. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Fluoróforo usado | Alexa-647 |
| Laser | 642 nm |
| Filtros de emissão | HP-T 623 |
| Lente | 160 X 1,43 AT |
| Tempo de exposição | 10 ms |
| Soleira de detecção | 65 |
| Ângulo de incidência (profundidade de penetração) | 65,04 ° (150 nm) |
| Ganho EM | 300 |
| #frames adquiridos | 30.000 – 60.000 |
| Intensidade do laser para bombear | 100% |
Tabela 1: Lista de parâmetros de imagem.
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Discussion
A recente explosão de tecnologias que permitem a geração de imagens para além do limite de difração ofereceram novas janelas para as complexidades da pilha mamífera sinalização no espaço e no tempo. Essas tecnologias incluem tempestade, STED, PALM, GSD, SIM e suas variantes (por exemplo, dSTORM, FPALM). A engenhosidade dos cientistas por trás destas técnicas permitiu-nos contornar as limitações impostas pelas leis da física que regem a difração de luz. Apesar desta grande realização, cada uma destas técnicas faz algum tipo de compromisso para alcançar a Super-resolução e, como tal, tem suas limitações. A situação ideal que biophysicists e biólogos da célula se esforçam para é ótima sensibilidade, alta resolução e rápida aquisição, com nenhum fotobranqueamento. Além disso, deve ficar ciente que removendo células de animais, inerentemente mudá-los e potencialmente alterar a dinâmica molecular. Portanto, a busca para desenvolver uma tecnologia de super-resolução que permite dinâmico, vivo celular, passa imagem de molécula em um animal vivo. Por agora, temos ferramentas à nossa disposição que pode gerar imagens com 10 vezes melhorias na resolução de difração limitada. Neste artigo, discutimos a preparação da amostra, aquisição de imagem e análise de GSD que permitem resoluções de até 20 a 50 nm nas dimensões laterais e axiais, respectivamente.
Embora o foco do presente protocolo é Sec61β e CaV1,2 L-tipo Ca2 + canais, o protocolo descrito acima pode servir como um modelo para pesquisadores que desejam proteínas diferentes de imagem em seus laboratórios em um microscópio GSD. Os atributos positivos deste tipo de protocolo são que é relativamente simples, pode ser modificado e aplicado a um número de diferentes tipos de células e pode ser facilmente adaptado para multi cor imagem. As limitações óbvias são aquele super-resolução sistemas, equipados com uma câmera de EM-CCD sensível capaz de detecção de único-molécula, ainda tendem a ser proibitivo para muitos laboratórios.
Como cresce o número de laboratórios que usam microscopia Super-resolução como sua técnica de imagem preferida, mais de acordo e entendimento uniforme é necessário sobre aquisição de imagens, processamento e interpretação. Como, por exemplo, um quantificar o nível de proximidade de duas proteínas que aparecem colocalized em um pixel de difração limitada mas transpire para realmente mostrar sobreposição a todos em um mapa de imagem/resolução super? Com efeito, este cenário já surgiu para vários anteriormente adotada colocalized proteínas, tais como a adesão proteínas complexas paxillin e zyxin. Como a resolução que microscópios invariavelmente possam aumentar, talvez proteínas já não Informaremos à 'colocalize' mas sim para ter não aleatoriamente distribuídos padrões de localização preferencial ao redor do outro. Afinal, é impossível para duas proteínas fisicamente ocupar exatamente o mesmo espaço 3-dimensional. Algumas soluções para este dilema de análise estão começando a surgir na literatura, incluindo análise de localização relativa baseado em microscopia reconstrução óptica estocástico (tempestade-RLA), que supostamente pode quantificar a frequência e o grau de sobreposição entre dois co rotulado proteínas e também fornecer medidas quantitativas da distância entre não-sobreposição de proteínas13. Ao comparar um canal para outro em Super-resolução, claro é fundamental para garantir que você tenha registro correto entre os dois canais. Isto pode ser avaliado usando microesfera multi cor fluorescente grânulos e imagem latente em cada canal individual, em seguida, sobrepondo as imagens. Além disso, desde que o SR-GSD microscópio 3D também pode funcionar como um microscópio TIRF e localização de super-resolução de gerar mapas em TIRF, é importante coincidir com a profundidade de penetração entre os canais de duas cores, como mudança de ângulos TIRF dependendo do comprimento de onda da luz usada para excitar a amostra.
Além disso, conforme representado na Figura 3B e 3D figura, um mapa de localização pode aparecer vastamente diferente dependendo do grau de 'limite'. Se o limite de deteção é definido muito baixo, estruturas podem parecer ser maior do que realmente são como a probabilidade que um inclui espúrias específico rotulagem de 'ruído' aumenta. Por outro lado, se o limite de deteção é definido muito alto, então estruturas podem aparecer menores do que realmente são como 'reais' eventos estão excluídos. Assim, deve aplicar-se a limiarização com razão e cautela. Então, como é que um limite de deteção razoável para uma determinada amostra pode ser determinado? Controles são fundamentais. Como com qualquer abordagem imuno-rotulagem, controles positivos e negativos devem ser realizados para demonstrar a especificidade dos anticorpos. Com controlos adequados, é possível derivar um limite de deteção acima do qual só a rotulagem específicos deve ser observado. Controlos adequados incluem amostras em que a incubação do anticorpo primário foi omitida para que uma amostra exposta apenas ao anticorpo secundário pode ser observada. De um controle, a ligação não específica de um anticorpo secundário pode ser discernida. Em uma amostra bem preparada, isto deve resultar em uma contagem de eventos muito menor por imagem e um menor número médio de fótons por pixel quando comparado à amostra incubada primária e secundária. O limite de deteção da imagem então pode ser definido para que a rotulagem não específicos pode ser eliminado. O mesmo limite de deteção então deve ser usado quando a amostra incubada primária e secundária para melhorar a confiança de imagem esse 'barulho' é eliminada. Controles adicionais incluem os testes a especificidade do anticorpo primário. Em células transfectadas, se a proteína rotulada não é nativamente expressa em linhagem celular, então um simples teste da especificidade do anticorpo primário é realizar o procedimento de etiquetagem em células untransfected. Para demonstrar a especificidade do anticorpo primário em células primárias, um nocaute genético da proteína etiquetado é o padrão ouro. Limites de deteção também podem ser definidos usando estas experiências de controle do anticorpo primário. Na ausência do antígeno alvo, qualquer emissão de fluorescência é específico. Como com os únicos controles secundários, com um bom anticorpo primário, menos eventos por imagem devem ser observados e, portanto, sobre o mesmo número de frames, uma menor significa número de fótons por pixel deve ser evidente. A deteccao de threshold, portanto, pode ser definido como um nível que vai eliminar o fundo específico, coloração devido a ligação do anticorpo primário fora do alvo. Para a completa transparência, sugere-se que os autores devem apresentar imagens com seus parâmetros de limiarização claramente e, talvez, com um link para os dados brutos em uma onlindepositário e.
O investigador também deve ficar ciente que vários anticorpos secundários podem vincular a um único anticorpo primário para que uma relação de vinculação de 1:1. primário: secundário não deve ser assumida. Além disso, anticorpos secundários comerciais são comumente conjugados para fluorophores múltiplas, por exemplo, os anticorpos secundários empregados no presente protocolo são anotados pelo fabricante a ser conjugado a 2-8 fluorophores. Como uma forma de contornar isto, um fluoróforo pode diretamente ser conjugado com um anticorpo primário. Espectrofotometria, em seguida, pode ser usada para determinar o número médio de fluorophores por anticorpo primário. Vários kits disponíveis comercialmente estão disponíveis para executar este processo de conjugação. No entanto, mesmo se uma estequiometria 1:1 é alcançada, a molécula de fluoróforo próprio pode criar problemas mais overcounting devido a piscar e comutação reversível de fluorophores. Na prática, isto significa que um fluoróforo pode ciclo várias vezes entre o solo e o estado excitado, emitindo clusters de fótons como ele faz isso. Estes fótons podem ser detectados em vários pixels vizinhos e levam a superestimação do tamanho do cluster. Outros investigadores abordaram esta questão ao optar por combinar fluorescentes emissões em cluster durante curtos períodos de tempo e espaço de16,17. Esta é uma abordagem um tanto empírica que ainda não elimina a possibilidade de que a mesmo fluoróforo poderia ciclo volta ao estado escuro por um período prolongado e, em seguida, reverter para um estado de ciclismo/emitindo mais uma vez e ser julgado como uma segunda molécula. Portanto, o número de moléculas em um cluster não pode ser calculado com base unicamente sobre o tamanho do cluster. No momento, não há nenhuma solução perfeita para estas questões e, portanto, o uso da imagem de super-resolução em conjunto com outra técnica como passo a passo fotobranqueamento pode dar uma estimativa aproximada do número de moléculas por cluster. Controles relevantes para aumentar a confiança nas medições de área cluster incluem comparar tamanhos de cluster de proteínas monoméricas conhecidas (por exemplo, CD86) e proteínas dimérica conhecidas (por exemplo, CTLA-4) para aqueles da proteína de interesse, como sugerido por Fricke et al 18.
Em resumo, no presente artigo, um protocolo simples immunolabeling é definido para trás, descrevendo a preparação de amostras fixas para a imagem latente de super-resolução. Além disso, algumas armadilhas comuns na aquisição de imagens e análise são discutidas. Como imagem de super-resolução torna-se mais comum, pode tornar-se necessário para revistas, estabelecer um novo conjunto de orientações para evitar a manipulação inadequada desses mapas de imagens complexas/localização. Microscopia de super-resolução adicionou uma nova ferramenta poderosa para a caixa de ferramentas dos biólogos celulares e biophysicists e já fez um impacto extraordinário na nossa compreensão da arquitetura celular e organização molecular.
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Disclosures
Os autores têm sem interesses concorrentes para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma concessão da AHA a R.E.D (15SDG25560035). Autores gostaria de reconhecer o Dr. Fernando Santana para uso do microscópio Leica SR GSD 3D e Dr. Johannes Hell para gentilmente fornecendo o anticorpo FP1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | To clean coverglass |
| #1.5 coverglass 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | To grow/process/image cells |
| 10x PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Dilute to 1x with de-ionized water |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| laminin | Sigma | 114956-81-9 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventricular myocyte culture media |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media supplement |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | Media supplement |
| 0.05% trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Cell culture solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection reagent |
| Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Cell culture |
| 100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Cell Fixation |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA or other blocking solution alternatives exist |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent to permeabilize cells |
| Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | Gift | N/A | Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Secondary antibody |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Prevents microbial growth for long term storage of samples |
| Catalase | Sigma | C40 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Photoswitching buffer ingredient |
| Tris | Sigma | T6066 | Photoswitching buffer ingredient |
| beta-Mercaptoethylamin hydrochloride | Fisher | BP2664100 | Photoswitching buffer ingredient |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoswitching buffer ingredient |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Photoswitching buffer ingredient |
| Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glass Depression slides | Neolab | 1 – 6293 | To mount samples |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | To seal coverglass |
| sec61β-mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD 3D microscope | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Washing block solution | 20 % SEAblock in PBS | ||
| Primary antibody incubation solution | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
| Secondary antibody incubation solution | 1:1000 in PBS |
References
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