Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Транскраниальной стимуляции мозга электрической оповещения грызунов

doi: 10.3791/56242 Published: November 2, 2017

Summary

Этот протокол описывает хирургическая установка для постоянного надчерепное электрод сокет и имплантированных груди электрода в грызунов. Размещая Второй электрод в гнездо, различные типы электрических мозга транскраниальной стимуляции может быть доставлен двигательной системы оповещения животных через нетронутыми череп.

Abstract

Транскраниальной стимуляции электрическими мозга может модулировать корковой возбудимости и пластичности в организме человека и грызуны. Наиболее распространенной формой стимулирования в организме человека является постоянного тока транскраниальной стимуляции (ЦТД). Менее часто переменного тока транскраниальной стимуляции (ОДУ) или транскраниальной стимуляции случайный шум (tRNS), конкретной форме tACS с помощью электрического тока применяется случайно в течение предварительно определенный частотный диапазон, используется. Увеличение исследования стимуляции неинвазивной электрические мозга у людей, как для экспериментальных и клинических целей, принесло повышенная потребность в базовых, механистических, безопасность исследования на животных. Эта статья описывает модель для транскраниальной стимуляции электрическими мозга (tES) через нетронутыми череп ориентации двигательной системы оповещения грызунов. Протокол содержит пошаговые инструкции для хирургической установки постоянного надчерепное электрода сокета в сочетании с имплантированным счетчика электрода на груди. Размещая электрод стимуляции в гнездо надчерепное, различные электрической стимуляции типы, сопоставимые с ЦТД, ОДУ и tRNS в организме человека, могут быть доставлены. Кроме того введены практические шаги для tES оповещения грызунов. Прикладной плотности тока, длительность стимуляции и тип стимуляции могут быть выбраны экспериментальные зависимости. Обсуждаются предостережения, преимущества и недостатки этой системы, а также вопросы безопасности и переносимости.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Транскраниальная администрации электрических токов в мозг (tES) был использован на протяжении десятилетий для изучения функции мозга и изменения поведения. Совсем недавно, применяя прямые токи, или реже переменных токов (ОДУ и tRNS), неинвазивно через нетронутыми череп с использованием двух или более электродов (anode(s) и cathode(s)) приобрела научный и клинический интерес. В частности ЦТД была использована в более чем 33200 сессий в здоровых испытуемых и психоневрологических больных и возникла как безопасный и простой, экономически прикроватные приложение, с возможным терапевтический потенциал, а также долгосрочные поведенческие эффекты1. Это явно принесли увеличение потребности и научный интерес в механистической исследований, включая аспекты безопасности. Эта статья посвящена наиболее часто используемые формы стимуляции, ЦТД.

Различных видов ЦТД модулирует корковой возбудимости и синаптической пластичности. Возбудимость изменения были зарегистрированы как полярности зависимые изменения скорости спонтанного нейронов стрельбы в крыс и кошек2,3,4, или как изменения в мотор вызвала потенциальных амплитуд (MEP) в людей и мышей ( Оба увеличился после одна и снизился после cathodal ЦТД:6человека5,; 7мыши). Одна DCS увеличили синаптическую эффективность двигателя корковых или гиппокампа синапсов в vitro на несколько часов после стимуляции или долгосрочной перспективе потенцирование (LTP), когда применяется совместно с конкретных слабых синаптических ввода или когда перед пластичности вызывая стимуляции8,9,10,,1112. В соответствии, преимущества стимуляции на мотор или когнитивных подготовки успех часто выявляются только если ЦТД совместно прикладной подготовки8,13,14,15. Хотя эти предыдущие выводы обусловлены главным образом функций нейронов, следует отметить, что не нейрональные клетки (ГЛИА) может также способствовать функциональных последствий ЦТД. Например уровни Астроцитарная внутриклеточного кальция увеличилась во время одна ЦТД в оповещения мышей16. Аналогичным образом одна ЦТД в плотностях тока ниже порога для нейродегенеративные индуцированной дозы зависимой активации микроглии17. Однако модуляция взаимодействия нейронов и глии, ЦТД требует дальнейшего конкретного расследования.

Взятых вместе, животных исследования ясно передовые наше понимание модулирующее влияние ЦТД на возбудимость и пластичности. Однако есть наблюдаемый объект «обратная трансляционная разрыв» в экспоненциальный рост публикаций исследований человеческого ЦТД, в отличие от медленного и незначительное увеличение исследования основных механизмов tES в в пробирке и in vivo Животные модели. Кроме того, грызун tES модели выполняются с высокой изменчивости различных научно-исследовательских лабораторий (начиная от Трансдермальные надчерепное стимуляции), и сообщил стимуляции процедуры часто не полностью прозрачным, препятствует сопоставимости и воспроизводимость данных базовых исследований, а также интерпретации результатов.

Здесь мы подробно описать хирургические осуществление транскраниальной мозга стимуляции настройки таргетинга первичной моторной коры, которая позволяет перевод на состояние человека ЦТД при минимизации изменчивости и позволяет без повторной стимуляции препятствование поведение. Предоставляется пошаговое протокол для последующего tES оповещения крыс. Обсуждаются методологической и концептуальной аспекты безопасного применения tES оповещения грызунов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

для исследований с участием животных, соответствующих согласований (пострановые) должны быть получены до начала экспериментов. Все эксперименты на животных сообщили здесь выполняются согласно ЕС Директива 2010/63/ЕС, обновленный немецкий защиты животных закон (" Tierschutzgesetz ") июля 2013 года и обновленный немецких исследований на животных правил августа 2013 года. Животных протоколы были одобрены местными властями " Комиссия животных экспериментов регионального Совета Фрайбург " и " Комиссия животных эксперименты во Фрайбурге медицинский центр университета ".

1. Подготовка инструментария и материалов для хирургии

  1. Убедитесь, что элементы, перечисленные на рисунке 1 доступны и уже размещены для хирургии.
  2. Подготовить тонкой прямоугольной пластины платины (например, 10 x 6 x 0,15 мм), который будет служить счетчик электрода, подкожно помещен на груди и два маленьких отверстия в двух противоположных углах пластины удар.
  3. Паять изолированный кабель длиной ~ 10 см с помощью свинец олово припой в один из углов (без отверстий) Платиновые пластинки.
  4. Нанесите небольшое падение гисто акриловые клея на Паяльники совместных изоляции.

2. Подготовка грызунов для хирургии

  1. назначить номер исследование для грызунов и отметить это на подготовленный хирургии card.
  2. Весят грызунов и обратите внимание на вес на карте хирургии. Рассчитать дозу инъекции анестетиков (например, кетамина 100 мг/кг веса тела плюс Ксилазина 70 мг/кг веса тела для крыс).
  3. Вызывают анестезии впрыской внутрибрюшинного (и.п.) расчетного количества анестетиков.
    Примечание: При использовании ингаляционной анестезии вместо (например, изофлюрановая), место грызунов в камеру всасывание с непрерывным потоком ~ 4% кислорода 1-2 Л/мин в.
  4. Проверка глубины анестезии, рефлекс щепотку мыс, начиная 5 мин пост в инъекции. Если мыс щепотку рефлекс до сих пор присутствует, достичь продолжение и углубление анестезии путем инъекций 30% от первоначальной дозы.
    1. Если в любой момент времени в эксперименте возвращает мыс щепотка рефлекс, 30% начальная доза наркоза следует вводить.
    2. При использовании ингаляционной анестезии, ищите потеря постуральной рефлекс грызунов в камере индукции и проверьте глубины анестезии отсутствием мыс щепотку рефлекс. Если по-прежнему присутствуют рефлексов, продлить продолжительность в зале анестезии. На протяжении всего эксперимента, адаптировать процент изофлюрановая до глубины анестезии до достижения обслуживания концентрация ~1-1.5% изофлюрановая.
    3. Когда частота дыхания уменьшает и задыхаясь происходит, снизить процент; когда грызунов восстанавливает рефлекс щепотку ног или показывает спонтанное движение, увеличить процент ингаляционного анестетика.
  5. Как только рефлексы отсутствуют, место грызунов на стенде лаборатории или держать его в руке.
    Примечание: При использовании ингаляционной анестезии, обеспечивают дальнейшее снижение изофлюрановая потока (теперь между 2-3%), используя насадку, подключенных к ингалятору.
  6. Удаление волос на крыса ' s голова после бритья области от уха до уха и от уровня ростральной глаз просто за ушами с клипер. Затем удалить волосы на груди после бритья районе между передних конечностей от мечевидного до ключицы.
    Примечание: Держать кожу под напряжение облегчает бритья.
  7. Покрытия глаза крыс с капелькой глазную мазь для защиты роговицы.
  8. Марк крыса ' s уха по количеству назначенных исследование.
    Примечание: В зависимости от длины исследования, знак хвоста может быть достаточным, в противном случае стандартизированной выделения предпочтительно.

3. Хирургическая процедура: Грудь электродами имплантации

Примечание: этот шаг может быть пропущен, когда счетчик электрода помещается внешне на бритые груди с жилет.

  1. Место подверженных грызунов (на груди) на операционном столе.
    Примечание: При ингаляционной анестезии, держите крыса ' s морду помещены в анестезии сопла, дальнейшего сокращения концентрации изофлюрановая в 1,5-2%.
  2. Лечить бритые головы с дезинфицирующий спрей или тампоном смоченной в антисептический агент (например, этанол 70%) и пусть воздушно-сухой. Повторить два раза.
  3. Вырезать кожу с помощью скальпеля в одной линии с ростральной глаз уровня до уровня середины ушей.
    Примечание: Это позволяет для туннелирования кабеля от электродов имплантированных груди к верхней части головы и желаемого cut для размещения розетки электрод DCS.
  4. Превратить крыса в лежачем положении, таким образом, чтобы грудь подвергается.
  5. Лечить кожу груди, как описано в шаге 3.2.
  6. Поднять боковые кожи правой груди с щипцами ткани и вырезать петли с небольшой ножницами около 0,5 см медиальной от правой подмышечной впадине. Затем сделать прямо Сагиттальный разрез в черепной ориентации ножницами.
  7. Образуют подкожной мешочек, atraumatically, отключение кожу от левой основных мышцей. Сделать это, открыв неоднократно маленькие ножницы (или физиологический пропитанной ватным тампоном).
  8. Превратить животных на своей правой стороне туннеля кабель путь от левой затылочной угла открыл кожи головы вдоль шеи для выхода в грудные мешочек проникая поверхностной фасции, используя гомеостатических щипцами.
  9. Тщательно открыть гомеостатических щипцы захватить конца электрода кабель, подключенный к Платиновый электрод не позволяя резкое провода для бездомных. Пропустите кабель через туннель до тех пор, пока электрода входит сумка, ориентированные с точки пайки к левой задних конечностей грызуны. Поверните грызунов в лежачем положении.
  10. Пластина платины с синтетическими не рассасывающиеся шовный материал стерильный жгутообразный к грудной фасции на два противоположных угла отверстия (4-5 knots рекомендуются для стабильности).
  11. Аналогичным образом подключите кабель к фасции свободные узел, образуя небольшой цикл до входа в туннель ткани.
  12. Закройте кожи с 3-4 кожные швы, в зависимости от размера вырезать (же шовный материал может использоваться как для электрода и кабель).

4. Хирургическая процедура: Размещение надчерепное tES Socket

  1. место животного в стереотаксической рамы.
    Примечание: Если используя ингаляционной анестезии, ниже концентрация анестетика к потоку обслуживания изофлюрановая ~1.5-1%, скорректированы на мыс щепотку рефлекс и ритм дыхания.
  2. Лечить бритые головы, как описано в шаге 3.2.
  3. Вырезать кожу с помощью скальпеля в одной линии с ростральной глаз уровня до уровня середины ушей.
    Примечание: Если будет проведен ау электрод грудной клеткибыла выполнена ЛОР, 4.2 и 4.3 были уже выполнены.
  4. Лом от надкостницы (соединительной ткани на черепе) по бокам с скальпель и тщательно протереть от хлопка ОСП. Фиксировать соединительной ткани в 4 углах разрез с бульдог зажимы и пусть они висят боково открытыми поле хирургии.
  5. Применить 0,9% физиологического раствора для очистки поверхности костей и тканей с ватные тампоны. Затем очистите поверхность кости с 3% H 2 O 2. Избегайте контакта с ткани. Настоящим кости более тщательно очищены и незначительные кровотечения из костей будет остановлена. Кроме того остатки надкостницы, становятся видимыми. Удалите эти остатки ватным тампоном, применении умеренного давления.
    Примечание: Удаление остатков надкостницы будет увеличить адгезию и прочность tES сокета на приклеены кости.
    1. В случае не остановить кровотечение, использовать дрель кости и прикоснуться к ней для 1-3 s с небольшим давлением на кости. Эта механическая процедура будет в большинстве случаев остановить кровотечение без значительных Отопление. Никогда не используйте электрокоагуляции на кости; даже краткое приложение приведет к повреждению тканей мозга (электрокаутер должны использоваться исключительно для заживления тканей кровотечения).
  6. Как фиксация винтов улучшит соблюдение set-up, выбрать сверло, монтаж Размер винта. Место два отверстия заусенцев на двух различных костных пластин, предварительное сверление сверлом руку, а затем приложением незначительные вертикальные давления сверлом кости. Избежать непосредственной близости в желаемое положение tES сокета, как это может помешать завинчивания в электроде (например, для левой первичного двигателя корковых tES, выберите положение прямо лобового и заднего париетальной винт).
  7. В случае имплантированных счетчика электрода, burr третье отверстие, расположенное в правой задней теменная кость для будущего крепления туннелированного кабеля.
  8. Место Пластмассовые винты в отверстия заусенцев и винт до тех пор, пока первый трения ощущается. Затем выполните три дополнительных 180 ° винт поворотов. Проверьте с щипцами для стабильности винта и добавить еще один поворот, если не достаточно жесткой.
    Примечание: Для взрослых крыс, это обеспечит эпидуральной размещение винты не повредив Дура или мозга (в зависимости от конструкции резьба, поворот, что число может варьироваться). Использовать винты из нержавеющей стали также должно быть осуществимо, поскольку даже в DCS плотностях тока выше порогового уровня, нейродегенеративные, винт размещения не сделал возмущают поражения местоположение или степени ниже винты.
  9. Поворот на паяльники и подогрейте около 5 мин ветер кабеля, выход из туннеля ткани occipitally вокруг правой теменной винт и затем сократить его, оставив примерно 1 см кабель за обмотки. Тщательно полосы изоляции в конце кабеля с помощью скальпеля.
  10. Исправить наматывается кабель на винт и кости клеем cyanoacrylic.
  11. Применить небольшое количество свинец олово припой соединителя и оголенные провода счетчика электродный кабель и подключите оба коротким нажатием обеих предварительно паяных частей вместе во время трогательно паяльного жала, пока олово припой расплавится (около 2-3 сек). Удаление паяльного жала немедленно, чтобы избежать чрезмерного нагрева металла кабеля с повреждения последующих тканей.
  12. Подобрать пользовательские сделал tES электрод сокета ( рис. 1B, в красном) с щипцы изогнутые, зубчатыми наконечник и нанести тонкий слой клея cyanoacrylic в нижней кайме сокета. Для размещения над моторной коры и использование сокета диаметром 4 мм поместите точку середины розетки на 2 мм передней и боковых 2 мм от bregma. Для этой должности внутренний медиальной границы объекта Socket должен заканчиваться непосредственно на Сагиттальный шов и хвостового границы должен заканчиваться на высоте bregma. Нажмите сокета кратко на кости (большинство cyanoacrylic клеи упрочнения давлением).
    Примечание: Размещение источник света непосредственно над сокет может облегчить размещение сокет.
  13. Убедитесь, что кости в пределах области сокет является бесплатным клея (путем проверки с свет, потому что Клей отражающей). В случае клей разливов, удалить гнезда, скрести клея с скальпель и повторите шаг 4.12.
  14. После сокет на месте и области будущего стимуляции бесплатно клея, сначала уплотнение боковые границы сокета в соседние ткани с небольшую каплю клея cyanoacrylic, чтобы избежать жидкости мост, который может привести к маневровых тока в этом месте. Не применять слишком много клея, как он может поступать в области стимуляции (если это происходит, вернитесь к шагу 4.12).
    Примечание: Сохранение стимуляция зоны, свободной от клея имеет решающее значение, как сокращение области стимуляции может резко увеличить плотность тока (A/м²).
  15. Охватывает все винты с клеем cyanoacrylic.
  16. Смесь Стоматологическая акриловые двухкомпонентные цемента в небольшой силиконовой трубки или стекла. Как только он становится вязкой, применять его с Стоматологическая шпатель для герметизации оставшиеся границы сокета к кости. Избегайте любой поток стоматологических акриловые цемента в области стимуляции.
  17. Наконец охватывают весь череп, винты, счетчик электродный кабель и розетки до ⅓ гильзы с зубной акриловые цемента. Убедитесь, что цемент имеет вязкость: если слишком жидкости, он будет поступать в окружающие ткани; Если слишком трудно трудно равномерно распределить.
  18. Когда охватывает все кости и закаленные цемента, снимите зажимы бульдог; кожи просто должен касаться Жилая цемента, так что швов не требуется. (Если первоначальный разрез был выбран слишком долго и соединительной ткани или мышцы является видимым, применить шва как описано в шаге 3.12).
  19. Нанести один слой йода с ватным тампоном вокруг границы разреза кожи и подкожно вводить carprofen (5 мг/кг массы тела, растворяют в 5-7,5 мл 0,9% физиологического раствора для боли обращению и жидкости замены).
    Примечание: При использовании ингаляционной анестезии, выключите его сейчас.
  20. Место грызунов в потепление ящик для восстановления от анестезии до грызунов бодрствует и постуральной стабильности восстанавливается.
    Примечание: Проверьте животное ' s вес развития, ранение государственного и общего благополучия критерии ежедневно согласно учреждение ' s Рекомендация.

5. Транскраниальная электрическая стимуляция процедура

Примечание: рекомендуется как анестезии влияет на эффекты ТЭС, выполняя стимуляции оповещения грызунов, когда это возможно. Разрешить грызунов для восстановления для по крайней мере 5 дней (заживление раны головы и грудной клетки) до начала экспериментов. Эксперименты могут быть выполнены на более ранние моменты времени после операции при использовании электрода Внешний счетчик фиксированной с жилет, как рана груди является наиболее раздражительным; но животных нужно быть привыкли к жилет электрода на несколько дней и могут возникнуть помехи поведенческих задач.

  1. Заполнить гнезда электрод tES половину с 0,9% физиологического раствора и удалить пузырьки воздуха.
  2. Бытьносовой cathodal ЦТД сессий, всегда проверить хлорирования и при необходимости (например, блестящий серебряный поверхности), повторно хлорирование Ag/AgCl электродов. Перед началом сессий одна ЦТД удалите возможных избыточных отложений AgCl из предыдущих стимуляцию с наждачной бумагой, чтобы обеспечить хорошую проводимость во время стимуляции. Винт в tES электрод резьбовую крышку ( рис. 1B, серый кусок).
    Предупреждение: Неспособность повторно хлорирование электрода между сессиями cathodal ЦТД приведет исчерпания хлорирования во время стимуляции и токсичных накопления электрохимической реакции. Это вызовет повреждение тканей. Повторное хлорирования не требуется в течение одной сессии, если длительность стимуляции меньше 20 мин
  3. Подключите кабели к двум разъемам на голове (для стимуляции одна, одна кабель подключен к разъему на колпачок, для cathodal стимуляции, это напротив).
    Примечание: При использовании внешне размещены счетчика электрода, охватывают счетчик электрод с проводящего геля и место на грызунов ' s груди. Это проще, если предварительно электрод фиксируется в небольшой грызун жилет, который грызунов можно носить во время стимуляции.
  4. Место, грызунов в экспериментальной клетку, с кабели подключены к поворотным выше клетки, что позволяет для свободного движения.
  5. Включите стимулятор и настроить параметры стимуляции (стимуляция интенсивность, продолжительность, рампы вверх и вниз время).
  6. , Когда не используете устройство коммерчески доступных стимуляции с безопасности закрыта и отключения сигнализации, включают один метр в цепи постоянного тока проверить.
    Примечание: С этой настройки, стимуляции может применяться во время работы или обучения поведенческих задач.
  7. Проверить признаки стресса или дискомфорт грызуна во время стимуляции.
  8. После окончания стимуляции, отсоедините кабели, открутите электрода на голове и чистой и сухой сокет с ватным тампоном. Возвращение грызунов в домашних условиях или продолжите поведенческие процедуры при желании.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Реализации описанных ловушка для надежной неоднократные tES оповещения грызунов легко интегрируются в механистической эксперименты, доза реакция исследований или экспериментов, включая поведенческих задач. На сегодняшний день, сопоставимости данных из исследования на животных с использованием (неинвазивный) tES препятствует изменчивость tES стимуляции механизмов между лабораториями и различия в параметрах стимуляции (например, применяемые при различных плотностях тока непомерно высокие уровни по сравнению с человека приложения). Следовательно информативность исследования животных в области tES ограничен. Эта статья представляет set-up tES, который легко стандартизировать в лаборатории путем реализации размещение «активный» электрода на кости выше целевых коры (здесь, выше первичной моторной коры (M1)) с saline как предпочтительным проводящих Средний и Счетчик электрода помещается на груди (внешне или имплантированные).

Учитывая небольшой размер грызунов, размещение электродов выше целевых коры на грызунов кожи может привести к чрезмерной маневровые, особенно при борьбе с электрода помещается в непосредственной близости от, например, в области шеи (для примеров текущего моделирования см. рис. 3 (принята от ссылку1)). Кроме того стабильность и электродом контакт является менее надежным и грызунов более раздражает повторные электрода размещение на волосистой части головы при использовании трансдермального применения. Фиксации установки непостоянных могут также препятствовать выполнения свободно грызунов. В противоположность этому грызуны быстро адаптироваться к этой постоянно настоящей имплантированных set-up.

Оценка эквивалент стимуляции интенсивности по сравнению с параметрами стимуляции человека трудно, так как модели можно только принимать во внимание ограниченное количество факторов, и грызуны pachygyric (см. ссылку1 для оценки масштабирования фактор). Таким образом сбор данных доза реакция, включая токи низкой интенсивности может быть наиболее информативным. Использованием представленные хирургическая установка в исследовании доза реакция на наркотизированных крысах, дозозависимый микроглии активации, опередив периода стимуляции (24 ч после стимуляции) была продемонстрирована и неотделимые от нейродегенеративные, происходит на высоком интенсивность DCS (рис. 4; принята ссылка17). Микроглии активации, оцениваются морфологические изменения, сначала произошло на 31,8 A/м² (рис. 4 c), в то время как первые признаки нейродегенеративные были обнаружены в 47,8 A/м². В этих экспериментах анестезии четко влияет величина реагирования на РС, как процент срезы мозга с fluorojade C (FJC) положительных вырождающихся нейронов в оповещения крыс было выше на 47,8 A/м² (Рисунок 4A). Как порог для ≥ 24 h прочного микроглии активации находится недалеко от поражения порог, но значительно выше интенсивности, которые способствуют физиологических когнитивных и пластиковые процессов в организме человека, такой активации может скорее указывают на pre-lesional воспаление индуцированных DCS. Следовательно поведенческих или молекулярные эффекты DCS на этих высоких интенсивностей ожидается механистически отличаться по сравнению с низкой интенсивности воздействия (см. схему, суммирующий эффекты и интенсивности ЦТД экспериментов на рис. 5).

Figure 1
Рисунок 1: материалы для хирургии и техническую схему tES сокета и электрод крышка исполнимых (A) 1. Ватные тампоны, 2. дезинфицирующее, 3. Стереотаксическая рама, 4. паяльник, 5. анальгетик (например, carprofen), 6. & 7. Анестетики (например, Ксилазина & кетамин), 8. шприц, 9. машинку, 10. ухо панчер, 11. глазная мазь (например, bepanthene), 12. свинец олово припой, 13. Двухкомпонентная стоматологического цемента о акриловые (DAC), 14. йод, 15. 3% H2O2, 16. 0,9% физиологического раствора, 17. Синтетические плетеные не рассасывающиеся шовные (например, Mersilene 4-0), 18. сверла, 19. cyanoacrylic клей, 20. бульдог зажимы 21. гомеостатических щипцы, 22. Щипцы изогнутые, зубчатыми подсказка, 23. Пинцет прямой, острый наконечник, 24. Пинцет прямой, ткани, 25. Стоматологическая шпатель, 26. скальпель, 27. ножницы, 28. ручная дрель, 29. отвертки, 30. мотором дрель, 31. женщины разъемы, 32. tES сокет, 33. Площадь Платиновый электрод, придает кабель, пайка совместное покрыты histoacrylic клея, 34. Винты пластиковые. (B) tES розетка (красный) для фиксации на грызунов черепа с внутренним диаметром 4 мм; электрод единицы (серый) построен колпачок и внутренний штамп с центральным отверстием, оставляя место для кабеля Ag/Cl диск электрода, который приклеивается к нижней части штампа. Это обеспечивает максимальную стабильность структуры и избежания провод перерывы на чувствительные точки провода электрод соединения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: крысы оснащены tES set-up. Крыса на левой стороне оснащен внешне фиксированной счетчика электрода на бритые груди. Резиновый электрод углерода пошита в нижней части жилета. Крыса на право имеет имплантированные груди электрода с кабелем, туннель в голову. Разъем прилагается к кабелю (хвостовой) фиксируется в стоматологической акриловые построен цементовозы, за разъем для tES электрода (Ростральные). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: моделирование текущего распределения в двух разных грызунов tES фотомонтажи. Элементную модели прогнозирования мозга текущего потока в двух моделях крыс с надчерепное ЦТД фотомонтажи, модифицированные с разрешением1. С помощью этих моделей, предсказал порог плотности тока мозга побудить корковых поражениях был 17,0 A/м² для монтажа, используемые Fritsch, и др. 8 (A) и 6.3 A/м ² для монтажа на Рохана, et al. 21 (B), соответствующие электрические поля 61, и 23 В/м, соответственно. Обратите внимание на расхождения в структуре текущего потока двух разных композиция. В (A) применяется более высокой плотности тока за более короткое время, что приводит к более низкую плотность заряда, чем в (B). Самое главное размещение счетчика электрода (шеи и грудной клетки) может иметь дополнительное влияние на возникающий ток мозга. Таким образом для интерпретации данных, грызунов, необходим Спецификация электродов размером, размещение (оба электродов), применяется тока и длительности стимуляции. Обратите внимание, что фактический ток в мозге крыс можно оценить только с помощью этих вычислительных моделей. Цветовая шкала Указывает плотность тока от нуля до 11,6 A/м² и выше. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: доза ответ воздействия DCS на микроглии активации и нейродегенеративные в срезах головного мозга, полученных после различных доз одна ЦТД, применяется для первичной моторной коры. Этот показатель изменяется от17 резюме выводов иммуногистохимического исследования ЦТД доза реакция. (A) связь междуморфологически активированного микроглии оценены анти CD11b/c окрашивание (рейтинг см. ниже) и нейродегенеративные показал FJC позитивность. Ломтики мотор коры мозга крысы были оценены ослепленный следователя либо как анти CD11b/c и FJC окрашивание негативные, как анти CD11b/c положительное только (обнаружение активации определяется морфологическими), или как анти CD11b/c и FJC положительных. Обратите внимание, что микроглии активации предшествовало появление нейродегенеративные. (B) представитель корональных разделы левый мотор коры мозга ломтиками (на или вблизи +1.56 мм от bregma) от крыс различной интенсивности одна ЦТД, применяется для первичной моторной коры. В наркотизированных крыс, никаких признаков нейродегенеративные произошло на 31,8 A/м², в то время как несколько вырождающихся нейронов присутствовали на 47,8 A/м² и нейрональных ущерб, увеличена с увеличением дозы. Из отметить, одна DCS в 47,8 A/м² в оповещения крыс увеличение доли ломтики с нейродегенеративные. Линейки для всех разделов: 500 мкм. Увеличение входного линейки шкалы для всех разделов: 20 µm. (C) гистологические образец изображения рейтинга микроглии активации в анти CD11b/c иммуногистохимии, от 0 (не активирована) до 4 (сильно активированный ), 1-4 были оценены как «позитивный». Масштаб баров = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: схема, иллюстрирующая связь в настоящее время используется грызунов ЦТД плотностях тока по сравнению с человека приложение: пороговые значения для воспаления, нейродегенеративные и модуляции физиологических процессов в стимуляции длительностью до 30 мин В настоящее время используемый грызунов DCS плотностях тока диапазон от 1,3 до 143 A/м² с большинством исследований с использованием более чем на 20 А/м ², при плотностях тока в большинстве исследований человека от 0,3 до 0,8 A/м²1,14. Параметры человека стимуляции являются по крайней мере один порядок величины ниже порога для нейродегенеративные1. Порог для нейродегенеративные значительно выше под наркозом, когда корковой возбудимости подавлено17. Прочного микроглии активации начинается ниже, но близко к интенсивности, вызывая повреждения нейронов17. Расследование модулируя эффекты DCS на физиологические процессы головного мозга при более высокой интенсивности ниже порога поражения, вероятно, отличается от диссертации, видели при очень низкой интенсивности (сопоставимы с человека приложения). Точный перевод параметров стимуляции между видами проводится расследование. Оценкам препятствуют пассивной факторы, как размер и анатомии (борозд и Извилин), но и возможных различных чувствительности к электрическим полям нейронов и глии сетей различных видов (не известно, приведет ли к тому же же тока физиологический эффект). Таким образом наиболее информативных дизайн исследования является тестирование tES эффекты образом дозы реагирования, включая очень низкой текущей интенсивности. Схема основана на данных из7,12,16,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 (максимальной стимуляции продолжительностью 30 минут за сеанс, данные являются от болезней животных моделей исключены). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот протокол описывает типичные материалы и процедурные шаги для хирургического реализации постоянного tES настройки, а также для последующей стимуляции оповещения грызунов. В ходе подготовки грызунов, которые tES эксперимент, некоторые методологические аспекты (безопасность и переносимость tES, параметр результат), а также концептуальные аспекты (сопоставимость с человеческого состояния, ожидаемого воздействия на конкретной мозга стимуляции район) должны быть приняты во внимание. С методологической точки зрения хирургические set-up черепной tES сокета с электродом счетчик имплантированных груди является выгодным для продольных исследований так как он позволяет для применения в оповещения, свободно перемещающихся грызунов. Привыкания грызунов в кабельных соединений и постоянные настройки необходима, но потом, это позволяет tES даже в сочетании с поведенческих задач. Кроме того дискомфорт во время стимуляции грызунов является скорее всего ниже с этой настройки, по сравнению с носить счетчика электрода, зашитые в жилет, так как движения не ограничены в бывшей дела и ткани контакт имплантированных электрода во время обеспечивается стимуляция.

Set-up представленных tES был использован для экспериментов длительностью до 3 месяцев, без каких-либо электродный кабель разрыва, материальная нестабильность или инфекции. Таким образом, скорее всего, что настройки также подходит для экспериментов дольше этого периода.

Это монтаж стимуляции надчерепное предотвращает чрезмерное маневровых через кожных структур, который скорее всего происходит в большей степени на грызунах, учитывая связь между электродами размер тела (см. рис. 3 и ссылка1). Имплантированные настройки для стимуляции надчерепное грызунов позволяет высокую практичность для экспериментов в свободно перемещающихся животных, четкое определение расположения электродов и надежность текущей доставки. Хотя эти факторы представляют собой основные преимущества для стандартизации экспериментов, несоответствие трансдермальных стимуляции людей или грызунов (например, ссылки32,33) следует иметь в виду. Однако для перевода результатов, фактическое количество текущих, достигая мозга (плотность тока мозга), независимо от прохода через различных тканей, имеет большое значение34. Размещение счетчика электрода обычно определяет направление и распространение текущего потока1. Таким образом для поляризации нейронов, размещение счетчика электрода на груди (dorsoventral направление текущего потока) могут быть более эффективными по сравнению с размещения в шею (rostrocaudal направление текущего потока).

Исследования, касающиеся основных механизмов tES или его влияние на поведение должно всякий раз, когда это осуществимо выполняться оповещение грызунов, так как анестезии значительно взаимодействует с (патолого)-физиологические процессы, включая активность нейронов35 ,36 и пластичности36,37и может подавить или изменять tES эффективность17(и наши Неопубликованные наблюдения) или вред1,17. Наоборот результаты, полученные на наркотизированных грызунов не позволяют прямой вывод предупреждения состояния, потенциально препятствует вперед перевод для исследования на людях. Пример различий ЦТД, применяется к моторной коры наркотизированных крыс и оповещения крыс показано в разделе представитель результаты. ЦТД, применяются в равной степени высоких плотностях тока индуцированной большей скоростью микроглии активации и нейродегенеративные оповещения крыс, по сравнению с17наркотизированных крыс. Хотя эти выводы являются частью эксперимента доза ответ в котором ЦТД эффекты на Микроглия и нейродегенеративные произошло при высокой интенсивности (не рекомендуется для использования в mechanistical или поведенческих исследований), что это соблазн предполагают, что на низких ЦТД текущей плотности, же утечки результатов будет происходить в зависимости от бдительности грызунов.

Наконец еще одним преимуществом предоставленных протокола является сокращение возможных источников ошибок. Устранение неполадок стратегии и важные шаги были освещены в протоколе. К ним относятся выбор соответствующей плотности тока для конкретных исследований (как обсуждалось выше), необходимость подготовки tES электродов перед каждой стимуляции и тщательно и повторяется проверка для надежной проводимости. Что касается подготовки электрода хлорирование электрода до cathodal стимуляции (то есть, катод над районом корковых целевой) абсолютно необходимо поскольку исчерпание хлорирования во время стимуляции приведет к токсичных накопления Электрохимические реакции и вторично причиной повреждения тканей. В нашем опыте исчерпание хлорирование не происходит в течение первых 20 минут стимуляции. Наоборот перед повторной стимуляции одна, Ag/Cl осаждения на аноде должны быть удалены во избежание прекращения стимуляции. Проводимость является критической точкой, которые касаются не только электрода подготовку, но и практические стимуляции сессии грызунов, а также качества хирургической имплантации tES сокета. Закрытие сокета tES окружающим череп и ткани должны обеспечиваться во время хирургических процедур для правильной оценки плотности тока. Маневровых вдоль прилегающих тканей приводит к завышению тока применяется к мозгу с одной стороны и может изменить физиологические результаты, основанные на искажение текущего направления потока. С другой стороны, сокращение площади стимуляции — либо путем осаждения Ag/Cl (см. выше) или покрытия области стимуляции во время tES сокета имплантации (например, на акриловый клей цементный или histoacrylic) — может привести к недооценке прикладной плотность тока и стимуляции через сокращение площади может привести к повреждения тканей путем простого плотностях тока непреднамеренно высокий пик. И наконец проводящей среды, например, засоленные, должна быть оптимально распределен на стимуляции площади для дальнейшего стимулирования. В ходе текущего эксперимента, изменены проводимости могут стать заметными в следующем: неожиданное поведение грызунов (признаки стресса, переменной производительности на выполнение конкретной задачи), изменения в текущей доставки отображаются на ампер метр электрических цепи, или полная потеря непрерывности стимуляции. В этом случае электроды должны быть очищены от осаждения и стимуляции области должны быть проверены снова на любой мусор. Кабельные соединения, размещение tES электрода в соответствующие розетки и проводящей среды следует проверить и заменить при появлении неблагополучных. Если tES доставки согласуется, полученные данные (например, поведение, гистология) этой конкретной сессии может потребоваться исключить из анализа.

Установить порог для нейродегенеративные оповещения крыс (наших неопубликованных данных) cathodal и одна сессий являются безопасным и хорошо переносится оповещения грызунов, при использовании до 20 мин непрерывной стимуляции при интенсивности ниже 31.8 A/м² (эквивалент до 0,4 МА с электродом транскраниальной диаметром 4 мм) и при соблюдении рекомендаций, изложенных в настоящем Протоколе. Однако, выбирая нижней интенсивности ближе к параметрам человеческого стимуляции (0,3-1.6 A/м²) или предпочтительно доза преSE эксперименты, рекомендуется максимально информативный характер полученных данных и содействовать вперед перевод результатов человека приложение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана немецкого фонда научных исследований (DFG RE 2740/3-1). Мы благодарим Фрэнк Huethe и Томас Günther для собственного производства на заказ tES set-up и DC-стимулятор.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Softasept N B. Braun Melsungen AG,
Melsungen, Deutschland
3887138 antiseptic agent
Ethanol 70 % Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland T913.1
arched tip forceps FST Fine science tools, Heidelberg, Deutschland 11071-10
Iris Forceps, 10cm, Straight, Serrated World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA 15914
Scalpel Handle #3, 13cm World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA 500236
Standard Scalpel Blade #10 World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA 500239
Zelletten cellulose swabs Lohmann und Rauscher, Neuwied, Deutschland 13349 5 x 4 cm 
Isoflurane AbbVie Deutschland GmbH & Co N01AB06
Iris Scissors, 11.5cm, Straight World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA 501758 small scissors
cotton swab/cotton buds Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland EH12.1 Rotilabo
Kelly Hemostatic Forceps, 14cm, Straight World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA 501241 surgical clamp
electrode plate (platinum) custom made Wissenschaftliche Werkstatt Neurozentrum Uniklinik Freiburg, Deutschland 10x6 mm, 0.15 mm thickness
insulated copper strands (~1 mm diameter) Reichelt elektronik GmbH & Co. KG, Sande, Germany LITZE BL electrode cable
Weller EC 2002 M soldering station Weller Tools GmbH, Besigheim, Germany EC2002M1D
Iso-Core EL 0,5 mm FELDER GMBH Löttechnik, Oberhausen, Deutschland 20970510 lead free solder
MERSILENE Polyester Fiber Suture Johnson & Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany R871H nonabsorbable braided suture, 4-0
Histoacryl B. Braun Melsungen AG,
Melsungen, Deutschland
9381104 cyanoacrylate
Ketamin 10% Medistar GmbH, Germany n/a anesthetics
Rompun 2% (Xylazine) Bayer GmbH, Germany n/a anesthetics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bikson, M., et al. Safety of Transcranial Direct Current Stimulation: Evidence Based Update 2016. Brain Stimul. 9, (5), 641-661 (2016).
  2. Bindman, L. J., Lippold, O. C., Redfearn, J. W. The action of brief polarizing currents on the cerebral cortex of the rat (1) during current flow and (2) in the production of long-lasting after-effects. J Physiol. 172, 369-382 (1964).
  3. Gartside, I. B. Mechanisms of sustained increases of firing rate of neurones in the rat cerebral cortex after polarization: role of protein synthesis. Nature. 220, (5165), 382-383 (1968).
  4. Purpura, D. P., McMurtry, J. G. Intracellular activities and potential changes during polarization of motor cortex. Neurophysiol. 28, (1), 166-185 (1965).
  5. Nitsche, M., Paulus, W. Excitability changes induced in the human motor cortex by weak transcranial direct current stimulation. J Physiol. 527, (Pt 3), 633-639 (2000).
  6. Nitsche, M. A., Paulus, W. Sustained excitability elevations induced by transcranial DC motor cortex stimulation in humans. Neurology. 57, (10), 1899-1901 (2001).
  7. Cambiaghi, M., et al. Brain transcranial direct current stimulation modulates motor excitability in mice. Eur J Neuro. 31, (4), 704-709 (2010).
  8. Fritsch, B., et al. Direct current stimulation promotes BDNF-dependent synaptic plasticity: potential implications for motor learning. Neuron. 66, (2), 198-204 (2010).
  9. Ranieri, F., et al. Modulation of LTP at rat hippocampal CA3-CA1 synapses by direct current stimulation. J Neurophysiol. 107, (7), 1868-1880 (2012).
  10. Kronberg, G., Bridi, M., Abel, T., Bikson, M., Parra, L. C. Direct Current Stimulation Modulates LTP and LTD: Activity Dependence and Dendritic Effects. Brain Stimul. 10, (November), 51-58 (2016).
  11. Sun, Y., et al. Direct current stimulation induces mGluR5-dependent neocortical plasticity. Ann Neurol. 80, (2), 233-246 (2016).
  12. Podda, M. V., et al. Anodal transcranial direct current stimulation boosts synaptic plasticity and memory in mice via epigenetic regulation of Bdnf expression. Sci Rep. 6, 22180 (2016).
  13. Reis, J., Fritsch, B. Modulation of motor performance and motor learning by transcranial direct current stimulation. Curr opin Neurology. 24, (6), 590-596 (2011).
  14. Buch, E. R., et al. Effects of tDCS on motor learning and memory formation a consensus and critical position paper. Clin Neurophysiol. 128, (4), 589-603 (2017).
  15. Reis, J., Fischer, J. T., Prichard, G., Weiller, C., Cohen, L. G., Fritsch, B. Time- but not sleep-dependent consolidation of tDCS-enhanced visuomotor skills. Cerebral cortex. 25, (1), 109-117 (2015).
  16. Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Comm. 7, 11100 (2016).
  17. Gellner, A. -K., Reis, J., Fritsch, B. Glia: A Neglected Player in Non-invasive Direct Current Brain Stimulation. Front Cell Neurosci. 10, 188 (2016).
  18. Takano, Y., Yokawa, T., Masuda, A., Niimi, J., Tanaka, S., Hironaka, N. A rat model for measuring the effectiveness of transcranial direct current stimulation using fMRI. Neurosci Lett. 491, (1), 40-43 (2011).
  19. Islam, N., Moriwaki, A., Hattori, Y., Hori, Y. Anodal polarization induces protein kinase C gamma (PKC gamma)-like immunoreactivity in the rat cerebral cortex. Neurosci Res. 21, 169-172 (1994).
  20. Islam, N., Aftabuddin, M., Moriwaki, A., Hattori, Y., Hori, Y. Increase in the calcium level following anodal polarization in the rat brain. Brain Res. 684, (2), 206-208 (1995).
  21. Rohan, J. G., Carhuatanta, K. A., McInturf, S. M., Miklasevich, M. K., Jankord, R. Modulating Hippocampal Plasticity with In Vivo Brain Stimulation. J Neurosci. 35, (37), 12824-12832 (2015).
  22. Wachter, D., et al. Transcranial direct current stimulation induces polarity-specific changes of cortical blood perfusion in the rat. Exp Neurol. 227, (2), 322-327 (2011).
  23. Koo, H., et al. After-effects of anodal transcranial direct current stimulation on the excitability of the motor cortex in rats. Rest Neurol Neurosci. 34, (5), 859-868 (2016).
  24. Liebetanz, D., et al. After-effects of transcranial direct current stimulation (tDCS) on cortical spreading depression. Neurosci Lett. 398, (1-2), 85-90 (2006).
  25. Fregni, F., et al. Effects of transcranial direct current stimulation coupled with repetitive electrical stimulation on cortical spreading depression. Exp Neurol. 204, (1), 462-466 (2007).
  26. Cambiaghi, M., et al. Flash visual evoked potentials in mice can be modulated by transcranial direct current stimulation. Neurosci. 185, 161-165 (2011).
  27. Dockery, C. A., Liebetanz, D., Birbaumer, N., Malinowska, M., Wesierska, M. J. Cumulative benefits of frontal transcranial direct current stimulation on visuospatial working memory training and skill learning in rats. Neurobiol Learn Mem. 96, (3), 452-460 (2011).
  28. Faraji, J., Gomez-Palacio-Schjetnan, A., Luczak, A., Metz, G. A. Beyond the silence: Bilateral somatosensory stimulation enhances skilled movement quality and neural density in intact behaving rats. Behav Brain Res. 253, 78-89 (2013).
  29. Pikhovych, A., et al. Transcranial Direct Current Stimulation Modulates Neurogenesis and Microglia Activation in the Mouse Brain. Stem Cells In. 1-10 (2016).
  30. Rueger, M. A., et al. Multi-session transcranial direct current stimulation (tDCS) elicits inflammatory and regenerative processes in the rat brain. PloS one. 7, (8), e43776 (2012).
  31. Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats. Clinical Neurophysiol. 120, (6), 1161-1167 (2009).
  32. Yoon, K. J., Oh, B. -M., Kim, D. -Y. Functional improvement and neuroplastic effects of anodal transcranial direct current stimulation (tDCS) delivered 1 day vs. 1 week after cerebral ischemia in rats. Brain Res. 1452, 61-72 (2012).
  33. Spezia Adachi, L. N., et al. Exogenously induced brain activation regulates neuronal activity by top-down modulation: conceptualized model for electrical brain stimulation. Exp Brain Res. 233, (5), 1377-1389 (2015).
  34. Jackson, M. P., et al. Safety parameter considerations of anodal transcranial Direct Current Stimulation in rats. Brain, behavior, and immunity. (2017).
  35. Ordek, G., Groth, J. D., Sahin, M. Differential effects of ketamine/xylazine anesthesia on the cerebral and cerebellar cortical activities in the rat. J Neurophysiol. 109, (5), 1435-1443 (2013).
  36. Sykes, M., et al. Differences in Motor Evoked Potentials Induced in Rats by Transcranial Magnetic Stimulation under Two Separate Anesthetics: Implications for Plasticity Studies. Front Neural Circ. 10, 80 (2016).
  37. Zhang, D. X., Levy, W. B. Ketamine blocks the induction of LTP at the lateral entorhinal cortex-dentate gyrus synapses. Brain Res. 593, (1), 124-127 (1992).
Транскраниальной стимуляции мозга электрической оповещения грызунов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fritsch, B., Gellner, A. K., Reis, J. Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents. J. Vis. Exp. (129), e56242, doi:10.3791/56242 (2017).More

Fritsch, B., Gellner, A. K., Reis, J. Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents. J. Vis. Exp. (129), e56242, doi:10.3791/56242 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter