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Neuroscience

警告齧歯動物で経頭蓋脳の電気的刺激

Published: November 2, 2017 doi: 10.3791/56242

Summary

このプロトコルでは、恒久的な帽状電極ソケットと齧歯動物に注入された胸電極の手術のセットアップについて説明します。ソケットに 2 つ目の電極を付けてそのまま頭蓋骨を介して警告動物のモーター システムを経頭蓋脳の電気的刺激の種類を配信できます。

Abstract

経頭蓋脳の電気的刺激は、大脳皮質興奮性、人間および齧歯動物の可塑性に調節することが。人間の刺激の最も一般的な形式は、経頭蓋直流電流刺激 (tDCS) です。頻度の少ない経頭蓋交流電流刺激 (tACS) または頭蓋雑音刺激 (tRNS)、事前定義された周波数範囲内でランダムに適用される電流を用いて tACS の特定のフォームが使用されます。実験的および臨床的目的の両方の人間の脳の非侵襲的電気的刺激の研究の増加動物の基礎、メカニズム、安全性研究のための高められた必要性をもたらした。ターゲット警告齧歯動物でモーターのシステムそのまま頭蓋骨を介して経頭蓋電気刺激 (tES) のモデルを説明します。プロトコルは、胸に注入されたカウンター電極と組み合わせて永久帽状電極ソケットの手術のセットアップの手順を説明します。帽状のソケットに刺激電極を配置すること、によって人間の tRNS、tACS、Tdc に匹敵する異なる電気刺激などを配信できます。また、アラートの齧歯動物の tES の実用的な手順を紹介しています。応用電流密度、刺激時間、および刺激の種類を実験のニーズに応じて選択できます。注意点、利点、およびこの設定の欠点は、安全性と忍容性の面だけでなく、議論が。

Introduction

脳の機能を研究し、動作を変更する、(tES) の脳に電流の経頭蓋管理は何十年も使用されています。もっと最近、適用する直接電流、または頻度の低い交流電流 (tACS、tRNS) そのまま頭蓋骨を非侵襲的で 2 つ以上の電極の使用 (anode(s) と cathode(s)) は、科学的・臨床的関心を得ています。特に、tDCS 健常者と脳神経疾患を持つ患者でより 33,200 セッションで使用されている、安全かつ簡単に、治療可能性と長期的な費用対効果のベッドサイド アプリケーションが浮上して1の行動の影響。これは明らかに高められた必要性と安全性の側面を含む機構の研究の科学的関心をもたらした。この記事は、刺激、tDCS の最もよく使用されるフォームに焦点を当てください。

種を渡って tDCS は皮質興奮性とシナプス可塑性を変調します。興奮性の変化は、ラットおよび猫2,3,4、神経の自発発火率の極性依存性の変化として、または人間とマウス (運動誘発電位 (MEP) 振幅の変化として報告されています。両方は anodal と減少した後, tDCS 後増加: 人間5,6;マウス7)。Anodal DC モーター皮質のシナプス伝達効率の増加または海馬シナプス体外数時間刺激または長い長期増強 (LTP) 後に、共同可塑性の前に与えられたり、特定の弱いシナプス入力とを適用刺激8,9,1011,12を誘導します。に従って、運動や認知トレーニングの成功に刺激の利点は、しばしば明らかにのみかどうか tDCS は共同訓練8,13,14,15を適用します。これらの前の調査結果は、主に神経細胞の機能に帰因する間、こと非神経細胞 (グリア細胞) tDCS の機能効果にまた貢献するかもしれない注意必要があります。たとえば、アラート マウス16anodal tDCS にアストロ サイトの細胞内カルシウム濃度が増加しました。同様に、神経変性のしきい値電流密度で anodal tDCS はミクログリア17の線量依存アクティベーションを誘発しました。ただし、tDCS によるニューロン ・ グリア相互作用の変調はさらに具体的な調査必要があります。

撮影一緒に、動物の研究は明らかに興奮性と可塑性に Tdc の変調効果への理解を高度な。ただし、遅いと対照をなして人間 tDCS 研究の出版物の急激な増加との in vitroおよびin vivo での tES の基になるメカニズムの調査でマイナーな増加は「逆トランスレーショナルリサーチ ギャップ」観測動物モデル。また、tES の齧歯動物モデルが高い可変性 (帽状刺激する経皮からまで)、研究所全体で実行され、報告された刺激プロシージャは完全に透明な比較可能性を妨げて、頻繁にしないと注目の結果の解釈と同様、基礎研究データ。

ここでは、我々 は詳細にターゲットの可変性を最小限に抑えながら人間 tDCS 条件に翻訳をでき、繰り返し刺激することがなく、一次運動野、経頭蓋脳刺激セットアップの外科の実装を記述します。行動を妨げます。警告ラットにおける後続の tES のステップバイ ステップのプロトコルを提供しています。アラートの齧歯動物の tES の安全なアプリケーションの方法論的・概念的な側面を説明します。

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Protocol

動物を含む研究、実験を開始する前に関連する (国別) の承認を受けなければなりません。EU ディレクティブ 2010/63/EU は、更新されたドイツの動物保護法によるとここで報告されるすべての動物実験を行った (" Tierschutzgesetz ") 2013 年 7 月および 2013 年 8 月の更新されたドイツの動物実験規制。動物のプロトコルは、地方自治体によって承認されている " フライブルクの地域協議会の動物実験委員会 "、" 医療センター フライブルク大学の動物実験委員会 ".

1 計測の準備と手術材料

  1. 図 1 に掲げる利用可能で手術のためすでに配置されているを確認してください。
  2. シンの長方形プラチナ プレートの準備 (例えば 10 × 6 × 0.15 mm)、胸の皮下配置カウンター電極として、パンチ プレートの 2 つの正反対のコーナーで 2 つの小さな穴が
  3. プラチナ プレート (穴なしのコーナーの 1 つに鉛フリー錫のはんだを使用した 〜 10 cm の長さの絶縁ケーブルをはんだ付けします
  4. 分離のはんだ付け継手に関する病理組織アクリル接着剤の小滴を適用します

2。げっ歯類の手術に備えて

  1. 齧歯類の研究数を代入し、準備手術でこれを注意してくださいカード
  2. 、齧歯動物の重量を量る術カードの重量に注意します。(例えば、 ケタミン 100 mg/kg 体重とラットのキシラジン 70 mg/kg 体重) の注射麻酔薬の投与量を計算します
  3. 。 麻酔薬の計算額の腹腔注入による
  4. 誘発麻酔
    。 注: 代わりに吸入麻酔を使用する場合 (例えば イソフルラン) ~ 4 %1 2 L/分の酸素の連続的な流れに誘導の商工会議所に齧歯類
  5. チェック開始 5 分つま先ピンチ反射によって麻酔深度ポスト噴射。つま先ピンチ反射がまだ存在する場合に達すると初期投与量の 30% の注射による麻酔の深化と延長
    1. 麻酔の初期投与量の 30% を注入する必要があります実験で任意の時点でつま先ピンチ反射が返された場合です
    2. 。 吸入麻酔を使用する場合
    3. 誘導室で齧歯動物の姿勢反射の損失をしつま先ピンチ反射の欠如によって麻酔の深さを確認します。反射がまだ存在する場合は、麻酔室に期間を延長します。~1-1.5% イソフルランの維持濃度に到達するまで適応イソフルラン麻酔の深さの割合を全体の実験中です
    4. 減少を呼吸とあえぎの周波数が発生すると、齧歯類つま先ピンチ反射を回復または自発的な動きを示しています; 割合を下げる、吸入麻酔薬の割合を増やします
  6. 反射がないとすぐに研究室のベンチに齧歯類を配置または手でそれを保持します
    。 注: 吸入麻酔を使用している場合は、噴霧器に接続されているノズルを使用して (今 2-3%) の間継続的な削減イソフルラン フローを提供。
  7. はラットに髪を削除 ' s 頭エリアを耳から耳まで削って、および、クリッパーでは、耳のすぐ後ろに吻側の目のレベルの間。鎖骨まで剣から前肢の間の領域を削って、胸の毛を削除します
    。 注: 張力の下で肌を保つ、シェービングが容易になります
  8. 角膜を保護するために眼軟膏のドロップでラットの目をカバーします
  9. マーク ラット ' 割り当てられた研究数に応じて s 耳
    。 注: 研究の長さにもよります尾マークは十分な可能性があります、それ以外の場合、標準化された使途が望ましい

3。手術: 胸部電極注入

注: 外部からベストと剃毛胸に対向電極を配置する場合、この手順をスキップできます

  1. 場所 (胸元) 齧歯動物なりやすい操作テーブルの上です
    。 注: 場合吸入麻酔ラットを維持 ' s 鼻がさらに 1.5-2% のイソフルラン麻酔濃度を減らす麻酔ノズルに配置します
  2. 消毒消毒スプレーまたは、空気乾燥が防腐剤 (例えば、 エタノール 70%) に浸した綿棒で坊主の頭皮です。2 回繰り返します
  3. 中間の耳レベルに吻側の目線から 1行でメスで皮膚をカットします
    。 注: これは頭のてっぺんに向かって注入胸部電極から接続ケーブルのトンネルし、も DC 電極ソケット配置の希望カット
  4. 胸を露出するように仰臥位にラットを有効にします
  5. 3.2 で説明されているように胸の皮膚を消毒します
  6. は、ティッシュ鉗子で右胸の横の皮膚を昇格および右腋窩から内側約 0.5 cm の小さなハサミでボタンホールをカットします。はさみで頭蓋の姿勢でまっすぐ矢状切口を行います
  7. は、atraumatically 左大胸筋から皮膚の切断によって皮下の袋を形成します。そう繰り返し小さなはさみを開くことによって (または生理食塩水浸した綿棒).
  8. トンネルの恒常性の鉗子を用いた浅筋膜を貫通して胸のポーチに終了する首に沿って開かれた頭皮の後頭部左からケーブルのパスを右側を下に動物を有効にします
  9. は、慎重に浮遊する鋭い線をさせず白金電極に接続されている電極ケーブルの端をつかむため恒常性の鉗子を開きます。電極にポーチ、齧歯動物の左後肢に向けてはんだ付けのポイントに入るまでは、トンネルを通ってケーブルを引き出します。腹臥位に戻って、齧歯動物を有効にします
  10. 角穴 (4-5 ノットは安定性のため推奨) に反対 2 で胸筋筋膜に無菌合成編組非吸収性縫合糸でプラチナ プレートを修正します
  11. 同様に筋膜組織のトンネルの入り口の手前のわずかなループを形成、緩い結び目によってケーブルに接続します
  12. (同じ縫合材料は電極とケーブルも使用可能)、カットのサイズによっては 3-4 皮膚縫合で皮膚を閉じます

4。手術: 帽状 tES ソケットの配置

  1. 定位脳手術フレームで動物の場所
    。 メモ: ~1.5-1% のメンテナンス イソフルラン流れに麻酔薬の濃度を下げると吸入麻酔を使用して場合は、つま先ピンチ反射、呼吸パターンを調整します
  2. 3.2 で説明されているように坊主の頭皮を消毒します
  3. 中間の耳レベルに吻側の目線から 1行でメスで皮膚をカットします
    。 注: 場合胸部電極 placem耳鼻咽喉科を行った、4.2 および 4.3 の手順が既に実行されています
  4. 。 メスと徹底的に両側に骨膜 (頭蓋骨の結合組織) をこすり
  5. コットンで拭き取るを入れ替えます。ブルドッグのクランプでカットの 4 つのコーナーで膠原病をこだわるし、手術フィールドを開いたままに横に垂らすことができます
  6. 適用 0.9% 食塩水骨表面と綿棒で組織をきれいにします。3% H 2 O 2 骨表面をきれい。組織との接触を避けてください。これによって骨はより徹底的に掃除し、骨から少量の出血を停止します。また、骨膜の残差が表示されます。綿棒を適度な圧力を適用することでこれらの残差を削除します
    。 注: 骨膜残差の除去により接着や骨に接着 tES ソケットの耐久性が高くなります。
    1. 止め出血の場合骨ドリルを使用し、骨にわずかな圧力で 1-3 s のそれに触れます。この機械的手順がほとんどの場合に重要な加熱をせずに出血を停止しています。決して骨; 電気焼灼器を使用します。でも簡単なアプリケーションは、脳組織の損傷になります (電気焼灼器のみ使用してください傷組織の出血のため).
  7. 固定ネジは、セットアップの順守を改善する、継手のねじサイズ ドリル ビットを選択します。事前手ドリルで掘削し、骨ドリルで若干垂直圧力アプリケーションにより、2 つの異なる骨プレートに 2 つのぎざぎざの穴を配置します。TES ソケットの目的の位置に近接をようにそれが電極にねじを妨げる可能性があります (例えば、 左一次運動皮質 tES の右正面と後部の頭頂部のネジの位置を選択) します
  8. 埋込カウンター電極の場合はり将来トンネルのケーブル固定用右後方の頭頂骨に位置する第 3 の穴
  9. バリの穴にプラスチックのネジを置くし、ネジまで最初の摩擦を感じた。3 つの追加の 180 ° スクリュー ターンを実行します。スクリューの安定性のための鉗子でチェックし、ないタイトな十分な場合は 1 つのより多くのターンを追加します
    。 注: ラットのこれにより、ネジの配置を硬膜外硬膜や脳 (ねじの設計回転数が異なる場合があります) によって損なうことがなく。神経変性のしきい値を超える DC 電流密度でも病変の場所やネジの下程度ねじ配置しなかった混乱ないのでステンレスのネジを使用は現実的であります
  10. 。 はんだごてと約 5 分間予熱
  11. ターンは右頭頂葉のねじ周り occipitally 組織トンネルを抜けたケーブルを風し、巻線の背後にある約 1 cm のケーブルを残して、それをカットします。メスのケーブルの端を慎重にワイヤーストリッパします
  12. シアノ アクリル接着剤でネジや骨に息切れのケーブルを固定します
  13. コネクタとカウンター電極ケーブルの裸線鉛フリーはんだの少量を適用し、錫はんだが溶けるまでコテの先を触れながら一緒に両方の前はんだ付け部分を押して両方を接続 (約 2-3 秒)。その後組織の損傷、ケーブルの過度の金属加熱を避けるためにすぐにはんだ付けのヒントを削除します
  14. は曲がって、鋸歯状の先端の鉗子でカスタムした tES 電極ソケット ( 図 1 b 赤で) をピックアップし、ソケットの下縁にシアノ アクリル接着剤の薄い層を適用します。運動皮質と 4 mm 径のソケットを使用して上に設置、2 mm 前方で前から 2 mm 外側ソケット中点を配置します。この位置に矢状縫合で直接ソケットの内側縁の内側を終了し、尾の境界は前の高さで終わる必要があります。(ほとんどのシアノ アクリル接着剤硬化圧力によって) 骨に簡単にソケットを押します
    。 注: ソケットの真上に光源を配置することが簡単にソケットを配置します
  15. (接着剤は反射するので光でチェック) でソケットの領域内で骨は接着剤の無料を確認します。接着剤の場合流出、ソケットを削除、メスと接着剤をこすり、手順 4.12
  16. ソケットが場所にあり今後刺激エリア無料、接着剤の後はまず流体橋この場所で現在の分流につながる可能性を避けるためにシアノ アクリル接着剤の小さなドロップで周辺の組織にソケットの外側縁をシールします。刺激エリアへと流れ込む場合があります、あまりにも多くの接着剤は適用されません (この場合、4.12 の手順に戻る) です
    。 注: 刺激区域を接着剤の自由を保つ刺激面積の削減が電流密度を大幅に向上可能性がありますので重大である (A/m ²).
  17. シアノ アクリル接着剤ですべてのネジをカバーします
  18. は、小さなシリコン チューブやガラスの二成分歯科アクリル セメントを混ぜます。それは粘性になると、すぐに骨にソケットの残りのボーダーを密封する歯科ヘラで適用します。刺激領域にアクリル セメントの任意のフローを避ける
  19. 最後にカバー全体の頭蓋骨、ネジ、カウンター電極ケーブル、ソケットまで ⅓ 歯科用アクリル セメント ソケットの。セメントが正しい粘度を持っているを確認: かどうかも流体に流れ周囲の組織へ難しい場合、それはそれを均等に分散することは困難です
  20. すべての骨は覆われ、セメントが硬化するとき削除ブルドッグ クランプ; 皮膚既成セメントをタッチする必要がありますだけ縫合が必要ないように。(最初のカットはあまりにも長いと結合組織、筋が表示される場合は、3.12 の手順で説明するように縫合糸を適用する).
  21. カット肌の境界線を綿棒でヨウ素の 1 つの層を適用し、カルプロフェン (5 mg/kg 体重の痛み治療と流体交換 0.9% 生理食塩水 5 7.5 mL に溶解) を皮下注入します
    。 注: 吸入麻酔を使用している場合それをオフになりました
  22. 。 齧歯類が目を覚まし、姿勢の安定性が復元されるまで、
  23. が麻酔からの回復のため地球温暖化ボックスに齧歯類を配置します
    。 メモ: 確認動物 ' s 重量開発傷機関による毎日の州、および一般的な福利基準 ' s 推薦

5。経頭蓋電気刺激プロシージャ

注: 麻酔 tES の効果に影響を与える、可能な限り警告齧歯動物での刺激を実行する勧めします。実験を開始する前に、少なくとも 5 日間 (頭と胸の傷の治癒) 回復する齧歯動物を許可します。実験後に実行できる以前の時点で外科胸の傷は最も過敏な; として、ベストと固定外部カウンター電極を使用する場合しかし、動物はいくつかの日のために電極のベストに慣れる必要があり、行動課題との干渉が発生する可能性が

  1. 0.9% 生理食塩水と半分 tES 電極ソケットを記入し、空気の泡を削除します
  2. します。フォア, tDCS セッションは常に塩素処理をチェックし、銀/塩化銀電極が再度塩素 (光沢のある銀面など)、必要な場合。Anodal tDCS セッション前に良好な伝導性の刺激の間ようにサンドペーパーで前の刺激から可能な余分な塩化銀沈殿物を削除します。TES 電極スクリュー キャップ ( 図 1 b、灰色部分) のネジします
    。 注意: 電気化学反応による刺激中に塩素化の枯渇し、有毒なビルドアップは再, tDCS セッション間電極を塩素消毒するため障害にはつながるが。これは組織の損傷を誘発します。刺激持続時間が 20 分に満たない場合、単一セッション内で再塩素処理は必要ありません
  3. は、頭の上の 2 つのコネクタにケーブルを接続 (anodal 刺激のため anodal のケーブルが接続されている反対だし, 刺激のため、スクリュー キャップのコネクタ).
    注: 外部に設置カウンター電極を使用する場合カバー導電性ゲルと齧歯類の場所で対向電極 ' s 胸。これは簡単にする電極は、齧歯動物は刺激中に着ることができる小さい齧歯動物のベストの固定済みです
  4. 自由のための動きができるケージの上回転に接続されているケーブルと実験ケージに齧歯動物の場所
  5. 刺激をオンにし、(刺激強度、期間、時間上下ランプ) 刺激パラメーターを調整します
  6. 安全シャット ダウンと断線警報、市販の刺激装置を使用していないときに、一定の電流をチェックする回路メーター
    。 注: このセットアップで、刺激することができます適用されるパフォーマンスまたは行動のタスクのトレーニング中にします
  7. 刺激時にストレスの兆候や齧歯類の不快感を確認します
  8. 刺激終了後ケーブルを外し、頭に電極キャップをはずし、きれい、綿棒を使ってソケットを乾燥します。家庭環境に齧歯類を返したり、場合必要な行動手順を続行します

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Representative Results

警告齧歯動物で信頼性の高い繰り返し tES のセットアップの説明の実装は、機構の実験、用量反応の研究、または行動のタスクを含む実験に簡単に統合できます。日には、(非侵襲的) tES を使用して動物の研究からのデータの比較は tES 刺激アップ研究室間の変動によって、刺激パラメーター (例えばで適用される様々 な電流密度の違いによって妨げられる法外な高いレベルで人間のアプリケーションと比較して)。したがって、tES の分野での動物研究の有益な値は制限されます。本稿では上記ターゲットの皮質骨に「アクティブ」の電極の配置を実装することにより、研究所全体で標準化する簡単である tES セットアップ (ここで、上記の一次運動野 (M1)) 生理食塩水でより好ましいとして導電性胸の上に配置中、カウンター電極 (外部または移植)。

カウンター電極近く、例えば、首 (現在モデリングの例の場合は特に、過剰な分流するにつながる可能性があります齧歯動物の皮膚にターゲットを絞った皮質上電極を配置する齧歯動物の小さなサイズを考えると、、図 3 (参考1から採用) を参照してください)。さらに、安定性と電極の接触は信頼性が低く、齧歯動物は経皮吸収型アプリケーションを使用するときに頭皮に繰り返される電極配置によってますますいらいらしています。非パーマネント セットアップの固定も自由に実行から齧歯類を妨げる可能性があります。対照的に、齧歯動物はこの永続的に存在の注入設定を迅速に調整します。

人間の刺激のパラメーターと比較して同等の刺激強度の推定が難しいモデルのみ考慮要因の限られた数を取ることができますので、齧歯動物、pachygyric (スケーリングの推定の参考1を参照してください。要因)。したがって、低強度の電流を含む用量反応データを収集できない最も有益。麻酔下ラットの用量反応の研究で提示された手術のセットアップを使用して、刺激周期 (24 h 後刺激) を勝ち抜き用量依存ミクログリア活性化された実証と神経変性高で発生から分離可能です強度の DC (図 4参照17から採用した)。47.8 神経変性の最初の兆候が検出された中ミクログリア活性化、形態変化によって評価が最初 31.8 A/m ² (図 4) で発生しました A/m ²。これらの実験で 47.8 A/m ² (図 4 a) で警告ラット fluorojade C (FJC) 肯定的な変性ニューロンと脳スライスの割合が高かったと麻酔は DC に応答の大きさを明確に影響。≥ 24 h のしきい値として病変しきい値に近いはミクログリア活性化を持続させるが、大きく人間の生理学的認知とプラスチック プロセスを促進するため強度の上このような活性化ではなく可能性があります初期炎症DCS によって誘導されます。したがって、これらの高強度で DC の行動または分子の効果は低強度の効果 (効果および図 5に tDCS 実験の強度をまとめたスキームを参照) と比較して機械論的に異なると予想されます。

Figure 1
図 1: 手術と tES ソケット ・電極の技術方式のキャップ ユニット(A) 1。綿棒、2。消毒剤、3。定位脳手術フレーム、4。はんだごて、5。鎮痛剤 (例えばカルプロフェン)、6。& 7。麻酔薬 (例えば、キシラジン & ケタミン)、8。注射器、9。クリッパー、10。耳パンチャー、11。眼軟膏 (例えばbepanthene)、12。鉛フリー錫はんだ、13。2 液歯科用アクリル セメント (DAC)、14。ヨウ素、15。3% H2O216。0.9% 生理食塩水、17。合成非吸収性縫合糸 (例えばMersilene 4-0)、18 の編組。ドリル ・ ビット、19。シアノ アクリル接着剤、20。ブルドッグ クランプ 21。恒常性鉗子、22。先端は曲がって、鋸歯状鉗子、23。ストレート、鋭い先端の鉗子、24。ストレート、組織鉗子、25。歯科用ヘラ、26。メス、27。はさみ、28。ドリル、29。スクリュー ドライバー、30。電動ドリル、31。メスコネクタ、32。tES ソケット、33。正方形の白金電極ケーブル、34、histoacrylic 接着剤で覆われてはんだ付け接合部に接続されています。プラスチックのネジ。(B) tES ソケット 4 mm の内径と齧歯動物の頭蓋骨固定用 (赤)電極ユニット (グレー) はスタンプの下部に接着されている Ag/Cl ディスク電極のケーブルのための部屋を残してセンター穴付きスクリュー キャップと内側のスタンプによって構築されています。これにより、セットアップの最大の安定性と敏感なワイヤ電極接続時点でワイヤー破断の回避。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: ラットは装備 tES セットアップします。左側のラット剃毛胸に外部固定カウンター電極が備わっています。炭素ゴム電極は、ベストの下に縫いです。右側のラットは、頭にトンネル ケーブルと注入された胸電極を持っています。メスコネクタ ケーブル (尾側) に接続されているは、tES 電極 (吻側) のソケットの後ろに建てられた歯科用アクリル セメント ユニット内に固定されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 2 つの異なる齧歯動物 tES モンタージュにおける電流分布のモデリングします。有限要素モデルは、帽状 tDCS モンタージュ、権限1に変更で 2 つのラット モデルで脳の現在の流れを予測します。これらのモデルを使用して、皮質病変を誘発する予測しきい値脳電流密度は 17.0 フリッチュによって使用されるモンタージュの A/m ²8 (A) と 6.3 ロハンでモンタージュの A/m ²21 (B)、それぞれ 61, と 23 V/m の電場に対応します。2 つの異なるモンタージュの現在のフロー パターンの違いに注意してください。(A) (B) のより低い電荷密度の結果、短い時間のためのより高い電流密度が適用されます。最も重要なカウンター電極 (胸と首) の配置は、その結果脳の現在の流れの他の影響があります。したがって、齧歯動物データの解釈、電極サイズ、配置 (両方の電極)、適用電流、および刺激の期間の仕様が必要です。これらの計算モデルを用いたラット脳の中で実際の電流を推定できるだけに注意してください。カラー スケールを示します 11.6 ゼロから電流密度 A/m ² 以上。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 一次運動野に適用 anodal tDCS の異なる投与後ミクログリアの活性化と脳スライスにおける神経変性の DC の用量応答効果が得られる。図は17用量反応 tDCS 研究の免疫組織学的所見の要約から変更されます。(A) 関係抗 CD11b/c 染色 (評価は下記を参照) によって評価形態学的活性化ミクログリアと神経変性 FJC 陽性で明らかにしました。ラット運動皮質脳スライスから評価された抗 CD11b/-c と FJC の染色として盲目の探偵か抗 CD11b/c 肯定的なだけ (検出形態決定活性化の)、または抗 CD11b/-c と FJC の両方として、否定的な肯定的です。ミクログリア活性化神経変性の出現に先行したことに注意してください。(B) 左モーター皮質脳スライス (または前から +1.56 mm 近く) anodal tDCS の一次運動野に適用の異なった強度に暴露したラットからの代表のコロナ セクション。麻酔下ラットの神経変性疾患の兆候が発生しなかった 31.8 で数 A/m ²、変性ニューロン線量の増加とともにさらに増加 47.8 A/m ² と神経損傷で存在していた。注意、47.8 A で anodal DC/警告ラット m ² の神経変性にスライスの割合を増加させた。すべてのセクションのためのスケール バー: 500 μ m の範囲の倍率入口スケール バーのすべてのセクション: 0 (アクティブでない) から 4 (深刻なアクティブに至るまで、抗 CD11b/c 免疫組織化学におけるミクログリアの活性化の評価の 20 μ m. (C) 組織学的サンプル画像)、1-4 は、「肯定的」として評価されました。スケール バー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 方式は現在の関係を示す使用人間のアプリケーションに比べると齧歯動物の tDCS 電流密度: 炎症、神経変性疾患、および最大 30 の刺激時間は生理的過程の変調のしきい値分現在使用されている齧歯動物の DC 電流密度範囲 1.3 から 143 A/m ² を使用して研究の大半よりも 20 A/m ²、人間研究の大半で電流密度が 0.3 〜 0.8 A/m ²1,14。人間の刺激パラメーターを少なくとも 1 つ神経変性1しきい値以下桁数であります。皮質興奮性が抑制された17神経変性のしきい値は、麻酔下で有意に高かったです。ミクログリア活性化を永続的な神経損傷17を誘導強度に近いが、下を開始します。病変のしきい値より高い強度で脳生理的に DC の効果を調節することの調査は、非常に低強度 (人間のアプリケーションに匹敵する) で見られる論文とは異なる。種の刺激パラメーターの正確な翻訳は、調査中です。推定は (それが知られていない同じ電流が同じにつながるかどうか種を越えたサイズと (溝と脳回) は解剖学のような受動的な要因によっても神経細胞、グリア細胞、およびネットワークの電界に可能な異なった感受性を妨げています。生理学的な効果)。したがって、最も有益な研究デザインは非常に低い電流強度を含む線量応答方法で tES 効果をテストします。方式は7,12,16,18,19,20,21,22,からのデータ23,24,25,26,27,28,29,30,31 (30 分セッションごとの最大刺激期間データが除外疾患動物モデルから)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

このプロトコルでは、典型的な材料および警告の齧歯動物の後続刺激のためだけでなく、恒久的な tES セットアップの手術実現のための手順について説明します。概念的な面 (人間の条件、特定の頭脳の刺激の予想される効果との比較と同様に、いくつかの方法論的側面 (安全性と忍容性 tes の結果パラメーター) tES 実験、齧歯類の準備中考慮する必要は地域)。方法論的観点から注入された胸のカウンター電極を頭蓋 tES ソケットの手術のセットアップは、アプリケーション、警告、齧歯動物を自由に移動できるので縦方向の研究で有利です。恒久的なセットアップとケーブル接続の齧歯動物の慣れが必要です、その後、行動のタスクとの組み合わせでも tES できますができます。また、刺激時の齧歯動物の不快感は着用中に注入電極の元のケースと組織連絡先で動きが制限されていないので、ベストに縫い付けて対向電極と比較してこのセットアップで可能性が低い刺激が保証されます。

提示 tES セットアップは、電極ケーブル不連続性や材料の不安定性感染症なし、3ヶ月まで永続的な実験のために使用されています。したがって、セットアップがこの期間より長く実験に適していますそうです。

この帽状刺激モンタージュを防ぐ真皮の構造体を介して過剰なシャントの齧歯動物の体サイズに電極の関係を与えられるより大きい範囲が可能性があります実行されている (図 3および参照1参照)。齧歯動物には帽状刺激注入のセットアップは、動物、電極の位置の明確な定義と現在の配信の信頼性を自由に移動するのに実験の実用性の高いことができます。これらの要因は、実験の標準化のための主要な利点を表す、人間または齧歯動物 (例えば、 32,33を参照) における経皮刺激する不一致が留意する必要があります。ただし、結果の翻訳、脳 (脳電流密度)、さまざまな組織、通過の独立に達する現在の実際の量は、主要な関連性34の。カウンター電極の配置は一般に方向と現在の流れ1の分布を決定します。したがって、ニューロンの偏波、胸 (現在の流れの卵割方向) に対向電極の配置より効果的かもしれない首 (rostrocaudal 現在のフロー方向) の配置と比較します。

TES または動作に及ぼす影響のメカニズムに対処する研究を可能な限り麻酔が大幅 (病態) と対話するため、警告の齧歯動物で実行-神経35 を含む生理学的なプロセス、36と可塑性36,37, と可能性がありますを抑制または tES 効果17、(と私たちの未発表の観察) を変更または1,17を傷つけます。逆に、麻酔をかけられた齧歯動物で得られた結果には人間の研究に進む訳を妨げる可能性のあるアラートの条件を直接推論できないようにします。代表の結果セクションに Tdc 麻酔下ラットおよび警告のラットの大脳皮質の運動に適用の違いの例を示します。tDCS 均等に高電流密度で適用は、ミクログリア活性化と麻酔下ラット17と比較して警告のラットの神経変性の大きい率を誘導されます。これらの調査結果は用量反応実験の一部を tDCS のミクログリアと神経変性に及ぼす影響で発生した高強度 (機械論的なまたは行動の研究で使用するため推奨されません) 低 tDCS 現在で推測していることも魅力的です。密度、齧歯類の覚醒によって結果の同じ転換が発生します。

最後に、指定されたプロトコルの別の利点は、エラーの原因の削減です。トラブルシューティングの方法と重要なステップは、プロトコルで強調されています。特定の研究目的 (前述したよう) tES 電極の作製の必要性それぞれが刺激を適用する前に適切な電流密度の選択が含まれますと、徹底的に、信頼性の高いコンダクタンスのチェックを繰り返します。刺激の中に塩素化の枯渇によって有毒なビルドアップにつながるので電極作製に関して, 刺激 (すなわち、皮質のターゲット領域に陰極) 前に電極の塩素化は不可欠電気化学反応と第二に組織損傷を引き起こす。我々 の経験で刺激の最初の 20 分以内は塩素の枯渇は発生しません。それどころか、anodal 刺激を反復する前に、陽極で Ag/Cl 沈着は刺激中止を避けるために取除かれなければなりません。コンダクタンスは、電極作製も tES ソケットの外科的移植の品質と同様に、齧歯類の実用的な刺激セッションにのみ関連していない重要なポイントです。TES ソケットを周囲の頭蓋骨と組織領域の閉鎖は、電流密度の正しい推定の手術中に確保されなければなりません。隣接する組織に沿って分流一方で脳に電流の過大評価につながるし、現在のフロー方向の歪みに基づく生理学的成果を変更可能性があります。一方、刺激面積の削減-Ag/Cl 蒸着 (上記参照) か tES 中刺激エリアをカバー、ソケットの注入 (例えば、アクリルの接着剤のセメントや histoacrylic によって)-適用の過小評価につながる可能性があります電流密度と面積が減少を介して刺激は、単に誤って高ピーク電流密度によって組織の損傷をもたらすかもしれない。最後に、導電性媒体、例えば、生理食塩水は、継続的な刺激のために使用できるように刺激領域上で最適な配布する必要があります。進行中の実験中に変質コンダクタンスは次のよう表示になる可能性があります: 予期しない動作 (ストレスの兆候、特定のタスクでの変数のパフォーマンス)、齧歯動物の電気のアンペア メーターに表示される現在の配信の変化回路、または刺激の継続性の完全な損失。この場合、電極による証言からきれいにされるべき、刺激エリアは任意の残骸の再度点検する必要があります。それぞれのソケットと導電性媒質における tES 電極の配置、ケーブル接続をチェックし、機能不全に表示されるときに置換する必要があります。TES の配信が一貫性のある、この特定のセッションの得られたデータ (例えば動作、組織学) が解析から除外する必要があります。

神経変性のしきい値決定警告ラット (未発表データ), と anodal の両方のセッションの安全なよく容認されて警告齧歯動物で 0.4 A/m ² 31.8 (相当以下の強度で継続的な刺激の最大 20 分を使用する場合4 mm 径の経頭蓋電極と mA)、ときにこのプロトコルで説明されている推奨事項に従うこと。しかし、人間の刺激パラメーターに近い低い強度を選択 (0.3 1.6 A/m ²) またはできれば線量責se 実験は、得られたデータの有益な文字を最大化する、人間のアプリケーションに結果の前方の翻訳を容易にするために適しています。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作品は、ドイツ研究振興協会 (DFG 日時 2740/3-1) によって支えられました。カスタムメイド tES セットアップと直流刺激装置の内製化は、フランク Huethe とトーマス ・ ギュンターをありがとうございます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Softasept N B. Braun Melsungen AG,
Melsungen, Deutschland
3887138 antiseptic agent
Ethanol 70 % Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland T913.1
arched tip forceps FST Fine science tools, Heidelberg, Deutschland 11071-10
Iris Forceps, 10cm, Straight, Serrated World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA 15914
Scalpel Handle #3, 13cm World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA 500236
Standard Scalpel Blade #10 World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA 500239
Zelletten cellulose swabs Lohmann und Rauscher, Neuwied, Deutschland 13349 5 x 4 cm 
Isoflurane AbbVie Deutschland GmbH & Co N01AB06
Iris Scissors, 11.5cm, Straight World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA 501758 small scissors
cotton swab/cotton buds Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland EH12.1 Rotilabo
Kelly Hemostatic Forceps, 14cm, Straight World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA 501241 surgical clamp
electrode plate (platinum) custom made Wissenschaftliche Werkstatt Neurozentrum Uniklinik Freiburg, Deutschland 10x6 mm, 0.15 mm thickness
insulated copper strands (~1 mm diameter) Reichelt elektronik GmbH & Co. KG, Sande, Germany LITZE BL electrode cable
Weller EC 2002 M soldering station Weller Tools GmbH, Besigheim, Germany EC2002M1D
Iso-Core EL 0,5 mm FELDER GMBH Löttechnik, Oberhausen, Deutschland 20970510 lead free solder
MERSILENE Polyester Fiber Suture Johnson & Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany R871H nonabsorbable braided suture, 4-0
Histoacryl B. Braun Melsungen AG,
Melsungen, Deutschland
9381104 cyanoacrylate
Ketamin 10% Medistar GmbH, Germany n/a anesthetics
Rompun 2% (Xylazine) Bayer GmbH, Germany n/a anesthetics

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神経科学、問題 129、運動皮質、脳の非侵襲的電気的刺激、tDCS、tRNS、tACS、用量反応、電極注入、サバイバル術、電流密度
警告齧歯動物で経頭蓋脳の電気的刺激
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Fritsch, B., Gellner, A. K., Reis,More

Fritsch, B., Gellner, A. K., Reis, J. Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents. J. Vis. Exp. (129), e56242, doi:10.3791/56242 (2017).

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