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Neuroscience

Estimulación eléctrica cerebral transcraneal en roedores alerta

doi: 10.3791/56242 Published: November 2, 2017

Summary

Este protocolo describe un montaje quirúrgico para una toma de corriente del electrodo de epicranial permanente y un electrodo de pecho implantado en roedores. Al colocar un segundo electrodo en el zócalo, diferentes tipos de la estimulación eléctrica cerebral transcraneal pueden proporcionarse al sistema motor en animales alerta a través del cráneo intacto.

Abstract

La estimulación eléctrica cerebral transcraneal puede modular la excitabilidad cortical y la plasticidad de los seres humanos y roedores. La forma más común de estimulación en el ser humano es la estimulación por corriente directa transcraneal (tDCS). Con menos frecuencia, se utiliza la estimulación transcraneal de corriente alterna (TAC) o la estimulación transcraneal ruido aleatorio (tRNS), una forma específica de TAC utilizando una corriente eléctrica aplicada al azar dentro de un rango de frecuencias predefinidas. El aumento de la investigación de estimulación eléctrica cerebral no invasiva en los seres humanos, ambos con fines experimentales y clínicos, ha producido una creciente necesidad de estudios de seguridad básica, mecanicista, en animales. Este artículo describe un modelo para la estimulación eléctrica cerebral transcraneal (tES) a través del cráneo intacto contra el sistema motor en roedores alerta. El protocolo proporciona instrucciones paso a paso para la creación quirúrgica de una toma de electrodo permanente epicranial combinado con un contraelectrodo implantado en el pecho. Mediante la colocación de un electrodo de estimulación en el zócalo epicranial, tipos diferentes de estimulación eléctrica, comparables a la tDCS, TAC y tRNS en seres humanos, pueden ser entregados. Por otra parte, se introducen las medidas prácticas para tES en roedores alerta. La densidad de corriente aplicada, duración de la estimulación y el tipo de estimulación pueden ser elegidos dependiendo de las necesidades experimentales. Las advertencias, ventajas y desventajas de esta configuración se discuten, así como aspectos de tolerabilidad y seguridad.

Introduction

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La administración transcranial de corrientes eléctricas en el cerebro (tES) se ha utilizado durante décadas para estudiar la función cerebral y para modificar el comportamiento. Más recientemente, la aplicación dirigen de las corrientes, o con menos frecuencia corrientes alternas (TAC y tRNS), de forma no invasiva a través del cráneo intacto por medio de dos o más electrodos (anode(s) y cathode(s)) ha ganado interés científico y clínico. En particular, tDCS se ha utilizado en sesiones de más de 33.200 en sujetos sanos y pacientes con enfermedades neuropsiquiátricas y ha surgido como una caja fuerte y fácil, rentable aplicación cabecera, con posible potencial terapéutico como de larga duración efectos conductuales1. Esto claramente produjo el aumento de la necesidad y el interés científico en el estudio de mecanismos, incluyendo aspectos de seguridad. Este artículo se centra en la forma más utilizada de estimulación, tDCS.

Entre especies, tDCS modula la excitabilidad cortical y la plasticidad sináptica. Cambios de excitabilidad se han divulgado como alteración de la polaridad-dependiente de la tasa de disparo neuronal espontánea en ratas y gatos2,3,4, o como cambios en la amplitud de (MEP) potenciales evocados motor en humanos y ratones ( aumentado después anódicas y disminuido después de tDCS cathodal: humano5,6; ratón7). Anódicas DCS aumenta la eficacia sináptica cortical motor o hippocampal sinapsis en vitro por varias horas después de la estimulación o potenciación de plazo largo (LTP), cuando aplicado junto con una entrada sináptica débil específica o cuando se administra antes de una plasticidad inducir la estimulación8,9,10,11,12. De acuerdo, los beneficios de la estimulación en el éxito de la formación, motor o cognitivo a menudo se revelan sólo si tDCS es aplicada conjuntamente con el entrenamiento de8,13,14,15. Estos resultados anteriores se atribuyen principalmente a las funciones de las neuronas, se debe observar que las células no-neuronales (glia) también pueden contribuir a efectos funcionales de tDCS. Por ejemplo, los niveles de calcio intracelular astrocytic aumentaron durante anódicas tDCS en ratones alerta16. Del mismo modo, tDCS anódicas en densidades de corriente por debajo del umbral para la neurodegeneración inducida por una activación dependiente de la dosis de microglia17. Sin embargo, la modulación de la interacción de la neurona-glia de tDCS necesita aún más investigación específica.

Tomado Junta, animal investigación claramente había avanzado nuestro conocimiento sobre el efecto modulador de la tDCS en excitabilidad y la plasticidad. Sin embargo, existe un observable de la "brecha de traslación inversa" en el aumento exponencial en las publicaciones de los estudios de tDCS humana en contraste con el lento y menor aumento en las investigaciones de los mecanismos subyacentes de tES en in vitro y en vivo modelos animales. Además, tES roedores modelos se realizan con alta variabilidad a través de laboratorios de investigación (desde transdérmica epicranial estimulación), y procedimientos de estimulación divulgado a menudo no son totalmente transparentes, lo que dificulta la comparabilidad y replicación de datos de la investigación básica así como la interpretación de los resultados.

Aquí, describimos en detalle la aplicación quirúrgica de un montaje de estimulación transcraneal cerebral dirigidos a la corteza primaria del motor, que permite la traducción a la condición humana tDCS minimizando la variabilidad y estimulación repetida sin obstaculizan el comportamiento. Se proporciona un protocolo paso a paso para la subsecuente tES en ratas alerta. Se discuten aspectos metodológicos y conceptuales de aplicación segura de tES en roedores alerta.

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Protocol

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para la investigación con animales, las pertinentes aprobaciones (país-específica) deben obtenerse antes de iniciar los experimentos. Todos los experimentos con animales divulgados aquí se realizan según la EU Directiva 2010/63/CE, la ley de protección animal alemán actualizado (" Tierschutzgesetz ") de julio de 2013 y los reglamentos de investigación animal alemán actualizada de agosto de 2013. Protocolos animales han sido aprobados por las autoridades locales " Comisión de Experimentación Animal de la Consejo Regional de Freiburg " y " Comisión de Experimentación Animal de la Universidad médica centro de Freiburg ".

1. preparación de instrumental y Material para cirugía

  1. Asegúrese de que los elementos que aparecen en la figura 1 están disponibles y ya colocados para la cirugía.
  2. Preparar una placa rectangular delgada de platino (por ejemplo, 10 mm x 6 mm x 0,15 mm), que servirá como contraelectrodo colocado subcutáneamente en el pecho y dos agujeros pequeños en dos esquinas opuestas de la placa de.
  3. Soldar un cable aislado con una longitud de ~ 10 cm usando una lata-soldadura sin plomo a uno de los rincones (sin un agujero) de la placa de platino.
  4. Aplique una pequeña gota de pegamento acrílico histo en la Junta de soldadura para el aislamiento de.

2. Preparación del roedor para cirugía

  1. asignar un número de estudio a los roedores y esta nota sobre la cirugía preparada Card
  2. Peso del roedor y tenga en cuenta el peso de la tarjeta de la cirugía. Calcular la dosis de anestésicos de inyección (por ejemplo, la ketamina 100 mg/kg de peso más peso corporal de 70 mg/kg de xilacina para las ratas).
  3. Inducir la anestesia por inyección intraperitoneal (i.p.) de la cantidad calculada de anestésicos.
    Nota: Cuando se utiliza anestesia inhalatoria en lugar de otro (p. ej., isoflurano), coloque el roedor en una cámara de inducción con flujo continuo de ~ 4% de oxígeno de 1-2 L/min.
  4. Control profundidad de la anestesia por el reflejo del pellizco del dedo del pie a partir de 5 min post inyección. Si el reflejo del pellizco del dedo del pie está todavía presente, llegar a prolongación y profundización de la anestesia por inyección del 30% de la dosis inicial.
    1. Si en cualquier momento en el experimento devuelve el reflejo del pellizco del dedo del pie, se debe inyectar 30% de la dosis inicial de la anestesia.
    2. Cuando se utiliza anestesia inhalatoria, busque pérdida del reflejo postural de los roedores en la sala de inducción y Compruebe la profundidad de la anestesia por la falta de un reflejo del pellizco del dedo del pie. Si los reflejos están todavía presentes, extender la duración en la cámara de anestesia. A lo largo del experimento todo, adaptar el porcentaje de isoflurano a la profundidad de la anestesia hasta llegar a una concentración de mantenimiento de isoflurano ~1-1.5%.
    3. Cuando la frecuencia de la respiración disminuye y jadeando, bajar el porcentaje; cuando el roedor recupera el reflejo del pellizco del dedo del pie o muestra movimiento espontáneo, aumentar el porcentaje de anestésico inhalante.
  5. Tan pronto como los reflejos están ausentes, coloque el roedor en la mesa de laboratorio o manténgalo en la mano.
    Nota: Cuando se utiliza anestesia inhalatoria, proporcionar flujo continuo isoflurano reducida (ahora entre 2-3%) mediante el uso de una boquilla conectada al nebulizador.
  6. Quitar el pelo de la rata ' cabeza por depilar la zona de oreja a oreja y entre el nivel de los ojos rostral a apenas detrás de las orejas con una maquinilla. Luego eliminar el vello en el pecho por depilar la zona entre las patas delanteras desde el xifoides hasta las clavículas.
    Nota: Mantener la piel en tensión facilita el afeitado.
  7. Cubrir los ojos de la rata con un poco de ungüento para proteger la córnea de ojo.
  8. Marque la rata ' oído s según el número de estudio asignado.
    Nota: Dependiendo de la duración del estudio, una marca de cola puede ser suficiente, de lo contrario es preferible destinar estandarizados.

3. Quirúrgico: Implantación de electrodo pecho

Nota: este paso puede omitirse cuando el contraelectrodo se coloca externamente en el pecho afeitado con un chaleco de.

  1. Lugar los roedores propensos (en el pecho) en la tabla de operación.
    Nota: En caso de anestesia de inhalación, mantener la rata ' hocico s colocado en la boquilla de la anestesia, reduciendo aún más la concentración de isoflurano a 1.5-2%.
  2. Desinfectar el cuero cabelludo afeitado con un spray desinfectante o con una torunda empapada en antiséptico agente (p. ej., etanol 70%) y dejar que seque al aire. Repetir dos veces.
  3. Cortar la piel con un bisturí en una línea desde el nivel del ojo rostral a la altura del oído medio.
    Nota: Esto permite hacer un túnel del cable de conexión del electrodo del implante del pecho hacia la parte superior de la cabeza y también el corte deseado para la colocación de zócalo de electrodo DCS.
  4. a su vez la rata a posición supina, por lo que se expone el pecho.
  5. Desinfectar la piel del pecho, como se describe en el paso 3.2.
  6. Elevar la piel lateral del pecho derecho con un fórceps de tejido y corte un ojal con una tijera pequeña de 0,5 cm medial de la axila derecha. Luego realizar un corte recto sagital en sentido craneal con las tijeras.
  7. Formar una bolsa subcutánea por atraumatically desconectarse la piel del músculo pectoral mayor izquierdo. Hacerlo varias veces abriendo las tijeras pequeñas (o un hisopo de algodón empapado salina).
  8. Girar el animal sobre su lado derecho al túnel de la trayectoria del cable desde la esquina izquierda del occipital de la piel cabeza abierta a lo largo del cuello para salir en la bolsa pectoral por penetrar la fascia superficial con unas pinzas homeostáticas.
  9. Abre cuidadosamente las pinzas homeostáticas para agarrar el extremo del cable electrodo conectado al electrodo de platino sin permitir que los alambres afilados alejarse. Tire del cable a través del túnel hasta que el electrodo entra en la bolsa, con el punto de soldado hacia el miembro posterior izquierdo de roedores. Gire el roedor a la posición propensa.
  10. Fijar la placa de platino con una sutura no absorbible trenzada sintética estéril a la fascia pectoral en los dos orificios de esquina (4-5 nudos se recomiendan para la estabilidad) de la oposición.
  11. Mismo modo Conecte el cable a la fascia por un nudo suelto, formando un bucle leve antes de la entrada del túnel de tejido.
  12. Cerrar la piel con suturas cutáneas 3-4 dependiendo del tamaño del corte (el mismo material de sutura puede usarse en cuanto al electrodo y el cable).

4. Procedimiento quirúrgico: Colocación de los tES Epicranial toma

  1. lugar del animal en un marco estereotáctico.
    Nota: Si bajo inhalación de anestesia, disminuye la concentración del anestésico a un flujo de isoflurano de mantenimiento de ~1.5-1%, ajustado al patrón de respiración y reflejo de pellizco del dedo del pie.
  2. Desinfectar el cuero cabelludo afeitado como se describe en el paso 3.2.
  3. Cortar la piel con un bisturí en una línea desde el nivel del ojo rostral a la altura del oído medio.
    Nota: Si el pecho electrodo placemENT se realizó, ya se han realizado pasos 4.2 y 4.3.
  4. Permutas
  5. raspar apagado el periostio (tejido conectivo en el cráneo) a los lados con el bisturí y minuciosamente Limpie con algodón. Para fijar el tejido conjuntivo en las 4 esquinas del corte con Bulldogs y dejarlos colgar lateralmente para mantener el campo de la cirugía abierta.
  6. Aplicar solución salina 0.9% para limpiar la superficie del hueso y el tejido con algodón. Luego limpie la superficie del hueso con 3% H 2 O 2. Evite el contacto con el tejido. Por este medio el hueso se limpia más a fondo y se detendrá la hemorragia leve del hueso. También, residuos del periostio se hacen visibles. Retire los residuos con un bastoncillo de algodón aplicando una presión moderada.
    Nota: Eliminación de los residuos de periostio incrementará la adherencia y la durabilidad de la toma de tES pegada sobre el hueso.
    1. En el caso de una hemorragia imparable, utilice un taladro del hueso y tocarlo para 1-3 s con ligera presión sobre el hueso. Este procedimiento mecánico en la mayoría de los casos detener el sangrado sin calefacción significativa. Nunca usar electrocauterización en el hueso; incluso breve aplicación resultará en daño de tejido cerebral (electrocauterización únicamente debe ser usada para herida tejido hemorragia).
  7. Tornillos de fijación mejorarán la adherencia de la instalación, elegir una broca de ajuste el tamaño de tornillo. Coloque dos orificios de trépano en dos placas de hueso diferentes por la perforación con un taladro de mano y luego por aplicación de ligera presión vertical con el taladro de hueso. Evitar proximidad cercana a la posición deseada de la toma de tES, dado que podría obstaculizar atornillar el electrodo (por ejemplo, para tES cortical motor principal izquierda, elegir la posición tornillo parietal derecha frontal y posterior).
  8. En caso de un electrodo implantado contador, rebabas un tercer agujero situado en el hueso parietal posterior derecho para la futura fijación de cable tunelizado.
  9. Coloque los tornillos de plástico en los agujeros de las rebabas y enrosque hasta sentir el primer roce. Luego realizar tres vueltas de tornillo adicional de 180 °. Compruebe con el fórceps para la estabilidad del tornillo y dele una vuelta adicional si no apretado.
    Nota: Para ratas adultas Esto asegurará la colocación epidural de los tornillos sin dañar la dura o el cerebro (dependiendo del diseño de la rosca, la vuelta número podría variar). El uso de tornillos de acero inoxidable también debe ser factible, ya que incluso en DCS densidades de corriente por encima del umbral de la neurodegeneración, colocar los tornillos perturbar no ubicación de lesión o grado por debajo de los tornillos de.
  10. Vuelta en el soldador y pre-calentamiento durante aproximadamente 5 minutos arrollar el cable al salir del túnel de tejido occipitally alrededor del tornillo del parietal derecho y corta, dejando aproximadamente 1 cm cable detrás de la bobina. Cuidadosamente Pele el aislamiento en el extremo del cable con un bisturí.
  11. Fijar el cable sin aliento para el tornillo y el hueso con pegamento cyanoacrylic.
  12. Aplicar una pequeña cantidad de estaño-soldadura sin plomo para el conector y los cables pelados del cable electrodo contador y conectar ambos pulsando brevemente ambas partes presoldados juntos mientras toca la punta del soldador hasta que se derrita la soldadura de estaño (sobre 2-3 s). Quite la punta inmediatamente para evitar el calentamiento excesivo de metal del cable con daño tisular posterior.
  13. Recoger la toma de corriente del electrodo personalizado hecho tES ( figura 1B, en rojo) con pinzas de punta doblada, serrado y aplique una capa delgada de pegamento cyanoacrylic en el borde inferior de la toma. Para la colocación encima de la corteza de motor y el uso de un enchufe de 4 mm de diámetro, coloque el punto medio de la toma en 2 mm anterior y lateral de 2 mm desde el vértice. Para esta posición, la frontera interior medial del encaje debe terminar directamente en la sutura sagital y la frontera caudal debe terminar a la altura de bregma. Presione el manguito brevemente en el hueso (mayoría cyanoacrylic pegamentos endurecen por presión).
    Nota: Colocar una fuente de luz directamente sobre el zócalo puede facilitar colocando la toma de.
  14. Asegurarse de que el hueso en el área de la toma de corriente está libre de pegamento (comprobando con la luz porque el pegamento es reflexivo). En el caso del pegamento derrame, quitar el enchufe, raspe el pegamento con el bisturí y repita el paso 4.12.
  15. Después de la toma de corriente y el área de estimulación futuro está libre de pegamento, primero sellar la frontera lateral del encaje a los tejidos vecinos con una pequeña gota de pegamento cyanoacrylic para evitar un puente fluido que podría conducir al desvío de la corriente en este lugar. No aplique demasiado pegamento como puede fluir en el área de estimulación (si esto ocurre, vuelva al paso 4.12).
    Nota: Mantener el área de estimulación de pegamento es crucial como una reducción del área de estimulación podría aumentar drásticamente la densidad de corriente (A/m²).
  16. Cubrir los tornillos con pegamento cyanoacrylic.
  17. Mezclar el cemento acrílico dental de dos componentes en un tubo pequeño de silicio o vidrio. Tan pronto como se vuelve viscoso, aplicarla con una espátula dental para sellar las fronteras restantes de la toma hasta el hueso. Evitar cualquier flujo de cemento acrílico dental en el área de estimulación.
  18. Por fin cubrir el cráneo entero, tornillos, cable de electrodo de contador y el encaje hasta ⅓ de la base con cemento acrílico dental. Asegúrese de que el cemento tenga la viscosidad correcta: si demasiado líquido fluirá hacia el tejido circundante; Si demasiado es difícil de distribuir uniformemente.
  19. Cuando se cubre todo el hueso y el cemento se endurece, quite las abrazaderas del bulldog, la piel sólo debe tocar el cemento acumulado para que no se necesita sutura. (Si el corte inicial fue elegido demasiado y el tejido conjuntivo o músculo es visible, aplicar una sutura como se describe en el paso 3.12).
  20. Aplicar una capa de yodo con un hisopo de algodón alrededor de la frontera de la piel cortada e inyectar por vía subcutánea carprofen (5 mg/kg de peso disuelto en 5-7.5 mL de solución salina 0.9% para reemplazo de tratamiento y el líquido de dolor).
    Nota: Si utiliza anestesia inhalatoria, apagarla ahora.
  21. Colocar el roedor en una caja de calentamiento para la recuperación de la anestesia hasta que el roedor está despierto y se restablezca la estabilidad postural.
    Nota: Revise el animal ' desarrollo peso, criterios de bienestar estatales y general diario según la institución de la herida ' recomendación s.

5. Procedimiento de estimulación eléctrica transcraneal

Nota: anestesia afecta tES efectos, realizar la estimulación en roedores alerta siempre que sea posible es recomendable. Permita que el roedor recuperar por lo menos 5 días (curación de la herida de la cabeza y el pecho) antes de comenzar los experimentos. Experimentos pueden realizarse en puntos anteriores del tiempo después de la cirugía cuando se utiliza un electrodo contador externo con un chaleco, como la herida del pecho es más irritable; pero los animales necesitan a estar habituado al chaleco del electrodo durante varios días y puede ocurrir interferencia con tareas conductuales.

  1. Llenar el zócalo de electrodo tES la mitad con solución salina al 0.9% y eliminar burbujas de aire.
  2. SerFore cathodal tDCS, siempre Compruebe la cloración y si es necesario (por ejemplo, una superficie plata brillante), volver a clorar el electrodo de Ag/AgCl. Antes sessions anódicas tDCS, quite posibles depósitos de AgCl exceso de estímulos anteriores con papel de lija para permitir buena conductividad durante la estimulación. Tornillo en el tapón de rosca tES electrodo ( figura 1B, pieza gris).
    PRECAUCIÓN: Si no se vuelve a clorar el electrodo entre sesiones de tDCS cathodal conducirá al agotamiento de cloración durante la estimulación y a la acumulación de tóxicos por reacción electroquímica. Esto induce daño tisular. La cloración no es necesario en una sola sesión si duración de la estimulación es menos de 20 minutos
  3. Conectar los cables a los conectores de dos en la cabeza (para estimulación anódicas, está conectado el cable anódicas para el conector en el casquillo del tornillo, para estimulación cathodal es opuesto).
    Nota: Cuando se utiliza un electrodo contador colocado externamente, cubre el contraelectrodo con gel conductivo y el lugar en el roedor ' pecho s. Esto es más fácil si el electrodo se fija previamente en un pequeño chaleco de roedor, que el roedor puede llevar durante la estimulación.
  4. Lugar el roedor en la jaula experimental, con los cables conectado a un eslabón giratorio encima de la jaula que permite gratis movimiento.
  5. Encender el estimulador y ajustar los parámetros de estímulo (intensidad de la estimulación, duración, rampa hacia arriba y abajo en el tiempo).
  6. Cuando no utilice un dispositivo de estimulación disponible en el mercado con un cierre de seguridad y alarma de desconexión, incluyen un medidor en el circuito para comprobar el flujo de corriente constante.
    Nota: Con esta configuración, la estimulación puede ser aplicada durante el desempeño o la formación de tareas conductuales.
  7. Busque signos de estrés o malestar del roedor durante estimulación.
  8. Después del final de la estimulación, desconecte los cables, desenrosque el tapón del electrodo en la cabeza y limpie y seque la toma con un hisopo de algodón. Devolver el roedor a domicilio o proseguir con un procedimiento conductual si se desea.

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Representative Results

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La aplicación se describe de una puesta a punto para tES confiable repetidas en roedores alerta puede integrarse fácilmente en experimentos mecanicistas, en estudios de dosis-respuesta o experimentos incluyendo tareas conductuales. Hasta la fecha, la comparabilidad de los datos de los estudios en animales utilizando tES (no invasor) se ve dificultada por la variabilidad de las configuraciones de estimulación tES entre laboratorios y por las diferencias en los parámetros de estimulación (por ejemplo, varias densidades de corriente aplicadas en el exorbitantes niveles altos en comparación con el uso humano). Por lo tanto, el valor informativo de la investigación animal en el campo de tES es limitado. Este artículo presenta una configuración de tES que es fácil de estandarizar en laboratorios mediante la aplicación de la colocación del electrodo "activo" en el hueso por encima de la corteza específica (aquí, por encima de la corteza motora primaria (M1)) con solución salina como la Preferible conductora medio y el contraelectrodo colocan en el pecho (externamente o implantado).

Dado el pequeño tamaño de roedores, colocar el electrodo sobre la corteza específica sobre la piel del roedor puede llevar al desvío excesivo, particularmente cuando el electrodo contra se coloca en las proximidades, por ejemplo, en el cuello (para ejemplos de modelado actual Ver figura 3 (adoptado de referencia1)). Además, la estabilidad y el electrodo de contacto es menos confiable y roedores más se irritan por la colocación repetida de electrodo en el cuero cabelludo al usar una aplicación transdérmica. La fijación de una estructura no permanente también puede dificultar al roedor a cabo libremente. En contraste, los roedores ajustan rápidamente a este montaje implantado permanentemente presente.

La estimación de una intensidad de estímulo equivalente en comparación con los parámetros de estimulación humana es difícil, puesto que los modelos sólo pueden tener en cuenta un número limitado de factores y los roedores son pachygyric (véase la referencia1 para el cálculo de una escala factor). Por lo tanto, puede ser más informativo que recoge datos de dosis-respuesta, incluyendo corrientes de baja intensidad. Utilizando el montaje quirúrgico presentado en un estudio de dosis respuesta en ratas anestesiados, la activación microglial dependiente de la dosis, durar más tiempo el período de estímulo (estímulo después de 24 h) fue demostrada y disociables de neurodegeneración que ocurren en la alta intensidad DCS (figura 4; tomado de referencia17). La activación microglial, evaluada por alteración morfológica, se produjo primero en 31,8 A/m² (figura 4), mientras que se detectaron los primeros signos de neurodegeneración en 47.8 A/m². En estos experimentos, la anestesia afectó claramente la magnitud de la respuesta a DCS como el porcentaje de trozos de cerebro con fluorojade C (FJC) positivo neuronas en degeneración en alerta ratas fue mayor en 47.8 A/m² (Figura 4A). Como umbral para ≥ 24 h duración de la activación microglial es cerca del umbral de lesión, pero muy por encima de las intensidades que promueven procesos cognitivos y plástico fisiológicos en los seres humanos, tal activación algo puede indicar una inflamación pre-lesional inducida por el DCS. Por lo tanto, efectos conductuales o moleculares de la DCS a estas altas intensidades deben ser mecanísticamente diferentes comparado con efectos de baja intensidad (ver el esquema que resume los efectos e intensidades de tDCS experimentos en la figura 5).

Figure 1
Figura 1: insumos para cirugía y esquema técnico de la toma tES y electrodo cap unidad. (A) 1. Bastoncillos de algodón, 2. desinfectante, 3. marco estereotáxico, 4. soldador, 5. analgésico (por ejemplo, carprofen), 6. & 7. anestésicos (por ejemplo, xilacina & ketamina), 8. jeringa, 9. Clipper, 10. perforadora de oído, 11. ungüento oftálmico (p. ej., bepanthene), 12. estaño-soldadura sin plomo, 13. dos componentes dental cemento acrílico (DAC), 14. yodo, 15. 3% H2O2, 16. solución salina al 0.9%, 17. sintético había trenzado sutura no absorbible (por ejemplo, Mersilene 4-0), 18. pedacitos de taladro, 19. pegamento cyanoacrylic, 20. pinzas Bulldog 21. pinzas homeostáticas, 22. pinzas de punta doblada, serrado, 23. pinzas de punta recta, afilada, 24. recto, pinzas para tejidos, 25. espátula dental, 26. bisturí, 27. tijeras, 28. taladro de mano, 29. destornillador, 30. motor impulsado por taladro, 31. conectores hembra, 32. toma tES, 33. Plaza de electrodo de platino conectado a cable, empalme de soldadura cubierto con el pegamento de histoacrylic, 34. tornillos de plástico. (B) toma de tES (rojo) para la fijación sobre el cráneo de roedor con un diámetro interno de 4 mm; la unidad de electrodo (gris) es construida por un tapón de rosca y un sello interno con un agujero de centro, dejando espacio para el cable del electrodo Ag/Cl de disco, que se pega a la parte inferior de la estampilla. Esto permite la máxima estabilidad de la estructura y evitar roturas de alambre en el punto de conexión del electrodo de alambre sensible. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: las ratas equipada con instalación de tES. La rata de la izquierda está equipada con un contraelectrodo externo fijo en el pecho depilado. El electrodo de goma de carbono está cosido en la parte inferior del chaleco. La rata de la derecha tiene un electrodo del pecho implantado con el cable incluido en el túnel a la cabeza. Al conector hembra del cable (caudal) se fija dentro de la unidad de cemento acrílico dental construido detrás de la toma para el electrodo de tES (rostral). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: modelado de la distribución actual en dos montajes diferentes tES roedores. Modelos de elementos finitos predecir el flujo de corriente del cerebro en dos modelos de rata con montajes de tDCS epicranial, modificadas con permiso1. Usando estos modelos, la densidad de corriente umbral previsto cerebro para inducir las lesiones corticales fue de 17.0 A/m² para el montaje utilizado por Fritsch, et al. 8 (A) y 6.3 A/m² para el montaje de Rohan, et al. 21 (B), correspondientes a los campos eléctricos de 61 y 23 V/m, respectivamente. Tenga en cuenta las discrepancias en el patrón de flujo actual de los dos montajes diferentes. En (A) se aplica una densidad de corriente más alta para un tiempo más corto, resultando en una menor densidad de carga que en (B). Lo más importante es la colocación del electrodo contador (cuello y pecho) podría tener un impacto adicional en el flujo de corriente resultante de cerebro. Por lo tanto, para la interpretación de los datos de roedores, es necesaria la especificación de tamaño de electrodo, la corriente de colocación (dos electrodos), aplicada y duración de la estimulación. Tenga en cuenta que la corriente real en el cerebro de la rata sólo puede estimarse mediante el uso de estos modelos computacionales. Escala de color indica la densidad de corriente de 0 a 11.6 A/m² o superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: efectos de respuesta de dosis de DCS sobre la activación de la microglia y la neurodegeneración en rebanadas de cerebro obtienen después de diferentes dosis de tDCS anódicas aplicado a la corteza primaria del motor. Se modifica la figura17 resume los resultados de immunohistological de un estudio de dosis-respuesta tDCS. (A) relación entremicroglia activado morfológicamente por anti-CD11b/c tinción (ver características abajo) y neurodegeneración reveladas positividad FJC. Rebanadas de cerebro cortical motor de rata fueron calificados por un investigador cegado ya sea como anti-CD11b/c tinción FJC negativo, anti-CD11b/c positiva única (detección de activación determinada morfológicamente), o como anti-CD11b/c y FJC positivo. Tenga en cuenta que la activación microglial precedió a presencia de la neurodegeneración. (B) secciones coronales representante de rebanadas de cerebro cortical motor izquierdo (en o cerca de +1,56 mm desde el vértice) de ratas expuestas a diferentes intensidades de tDCS anódicas aplicado a la corteza primaria del motor. En ratas anestesiadas, signos de neurodegeneración no produjeron en 31.8 A/m², mientras que algunas neuronas en degeneración estuvieron presentes en 47,8 daños neuronales y A/m² incrementado con el aumento de dosis. De nota, DCS anódicas en 47.8 A/m² en ratas alerta aumentó el porcentaje de trozos con neurodegeneración. Barra de escala para todas las secciones: 500 μm. ampliación entrada escala bar para todas las secciones: 20 μm. (C) histológico muestra las imágenes de la clasificación de la activación de la microglia en inmunohistoquímica anti-CD11b/c, que van desde 0 (no activada) a 4 (severamente activada ), 1-4 fueron calificados como "positivos". Barras de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: esquema que ilustra la relación de la actualidad utiliza roedores tDCS densidades de corriente en comparación con la aplicación humana: los umbrales de la inflamación, neurodegeneración y modulación de los procesos fisiológicos en la duración de la estimulación de hasta 30 mínimo El actualmente utilizado roedores DCS densidades de corriente rango de 1.3 a 143 A/m² con la mayoría de los estudios con más de 20 A/m², mientras que las densidades de corriente en la mayoría de los estudios en humanos están entre 0.3 y 0.8 A/m²1,14. Parámetros de estimulación humana son por lo menos un orden de magnitud por debajo del umbral de neurodegeneración1. Umbral para la neurodegeneración es significativamente mayor bajo anestesia, cuando la excitabilidad cortical es suprimida17. Duración de la activación microglial comienza por debajo pero cerca de las intensidades de inducir daño neuronal17. Investigación de modular los efectos de la DCS en procesos cerebrales fisiológicos mayores intensidades por debajo del umbral de lesión son probablemente diferentes de tesis en intensidades muy bajas (comparables a la aplicación en humana). La traducción exacta de parámetros de estimulación entre especies está bajo investigación. Las valoraciones se ven obstaculizadas por pasivas factores como tamaño y anatomía (convoluciones del cerebro y surcos), sino también por posibles sensibilidades diferentes a campos eléctricos de las neuronas, glia y redes entre especies (no se sabe si el mismo flujo de corriente daría lugar a la misma efecto fisiológico). Por lo tanto, el diseño de estudio más informativo prueba tES efectos en una forma de dosis respuesta, incluso a muy bajas intensidades corriente. El esquema se basa en datos de7,12,16,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 (duración de la estimulación máxima de 30 minutos por sesión, los datos son de modelos animales de enfermedad excluidos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Este protocolo describe los materiales típicos y etapas del procedimiento para la realización quirúrgica de una puesta a punto permanente tES, así como para la subsecuente estimulación en roedores alerta. Durante la preparación de un roedor tES experimento, varios aspectos metodológicos (seguridad y tolerabilidad de tES, parámetro de resultado) así como los aspectos conceptuales (comparabilidad con la condición humana, efectos previstos de la estimulación en un cerebro particular región) es necesario tener en cuenta. Desde un punto de vista metodológico, la creación quirúrgica de la toma tES craneal con el contraelectrodo de pecho implantado es ventajosa para los estudios longitudinales ya que permite para el uso en alerta, moviendo libremente roedores. Habituación del roedor a las conexiones de cable y montaje permanente es necesario, pero luego, permite tES incluso en combinación con tareas conductuales. Por otra parte, la incomodidad de los roedores durante la estimulación es menor probable que con este montaje en comparación con usar un contraelectrodo cosido en un chaleco, ya que los movimientos no se limitan en el anterior caso y tejido el contacto del electrodo implantado durante estímulo está garantizado.

El montaje de tES presentados se ha utilizado para experimentos duran hasta 3 meses, sin discontinuidad del cable de electrodo, inestabilidad material o infección. Por lo tanto es probable que la configuración es también adecuada para experimentos más de este período.

Este montaje de estimulación epicranial evita excesivo desvío a través de las estructuras dérmicas, que probablemente está ocurriendo a un grado más grande en los roedores, dado la relación de electrodo al tamaño del cuerpo (ver figura 3 y la referencia1). La instalación implantada para la estimulación epicranial en roedores permite alto sentido práctico para los experimentos de mover libremente los animales, una definición clara de las posiciones de los electrodos y la confiabilidad de entrega actual. Mientras que estos factores representan ventajas importantes para la normalización de los experimentos, la discrepancia a la estimulación transdérmica en seres humanos o roedores (por ejemplo, hace referencia a32,33) debe tenerse en cuenta. Sin embargo, para la traducción de los resultados, la cantidad real de corriente alcanzar el cerebro (densidad de la corriente del cerebro), independiente del paso por diferentes tejidos, es de gran relevancia34. Colocación del electrodo contador general determina la dirección y distribución de la corriente de flujo1. Así, para la polarización de las neuronas, una colocación del electrodo de contador en el pecho (dirección dorsoventral del flujo de corriente) puede ser más eficaz en comparación con la colocación en el cuello (dirección rostrocaudal del flujo de corriente).

Abordar los mecanismos subyacentes de tES o su efecto sobre el comportamiento de los estudios deben siempre que sea posible realizarse en roedores alerta, ya que anestesia interactúa significativamente con (patho)-procesos fisiológicos incluyendo la actividad neuronal35 ,36 y plasticidad36,37y puede suprimir o alterar tES eficacia17(y nuestras observaciones no publicadas) o dañar1,17. Viceversa, los resultados obtenidos en roedores anestesiados no permiten una inferencia directa a la condición de alerta, potencialmente obstaculizar traducción hacia adelante a la investigación en seres humanos. Se muestra un ejemplo de las diferencias de tDCS aplicado a la corteza motora en ratas anestesiadas y alerta ratas en la sección de resultados representativos. tDCS en igualmente altas densidades de corriente inducidas por una mayor tasa de activación de la microglia y la neurodegeneración en ratas alerta en comparación con las ratas anestesiados17. Mientras que estos resultados son parte de un experimento de respuesta a la dosis en que tDCS efectos en microglía y neurodegeneración se produjeron en altas intensidades (no se recomienda para su uso en estudios mecánicos o de comportamiento), es tentador especular en el actual bajo tDCS densidades, la misma desviación de los resultados ocurre dependiendo de la vigilancia del roedor.

Por último, otra de las ventajas del protocolo previsto es la reducción de posibles fuentes de error. Estrategias de resolución de problemas y pasos críticos se han destacado en el protocolo. Estos incluyen la elección de la densidad de corriente adecuada para la investigación en particular (como discutido arriba), la necesidad de preparación de los electrodos de tES antes de cada estímulo y el fondo y verificación para conductancia confiable. Con respecto a la preparación del electrodo, cloración del electrodo antes de cathodal estimulación (es decir, cátodo sobre el área cortical) es absolutamente crucial ya que el agotamiento de la cloración durante la estimulación dará lugar a la acumulación de tóxicos por las reacciones electroquímicas y secundariamente causa daño a los tejidos. En nuestra experiencia, agotamiento de la cloración no ocurre dentro de los primeros 20 minutos de estimulación. Por el contrario, antes de la estimulación repetida anódicas, deposición de Ag/Cl en el ánodo debe eliminarse para evitar la interrupción de la estimulación. Conductancia es un punto crítico, que no sólo se refiere a la preparación del electrodo, pero también a la sesión de práctica de la estimulación de los roedores, así como la calidad de la implantación quirúrgica de la toma de tES. Cierre de la toma de tES al área de tejido y cráneo circundante debe garantizarse durante los procedimientos quirúrgicos para la correcta estimación de la densidad de corriente. Desvío a lo largo de tejido adyacente conduce a sobreestimación de la corriente aplicada al cerebro por un lado y puede alterar los resultados fisiológicos basados en la distorsión de la dirección de flujo actual. Por otra parte, la reducción de la zona de estimulación, por deposición de Ag/Cl (véase arriba) o por la cobertura de la zona de estimulación durante tES toma implantación (por ejemplo, por el acrílico pegamento cemento o histoacrylic) — puede llevar a la subestimación de la aplicación densidad de corriente y estimulación a través de un área reducida pueden llevar a daño tisular por densidades de corriente de pico alto sin querer. Por último, el medio conductor, por ejemplo, solución salina, debe ser óptimamente distribuidos sobre el área de estimulación para permitir la estimulación continua. Durante un experimento continuo, conductancia alterada puede llegar a ser visible como el siguiente: un comportamiento inesperado del roedor (signos de estrés, rendimiento variable en una tarea en particular), las variaciones en la entrega actual aparece en un metro del amperio de la eléctrica circuito, o la pérdida completa de continuidad de la estimulación. En este caso, los electrodos deben limpiarse de deposiciones y el área de estimulación debe ser inspeccionado nuevamente cualquier suciedad. Las conexiones de cables, colocación de electrodo de tES en la toma respectiva y el medio conductor deben comprobar y sustituye al aparecer disfuncional. Si tES entrega era incompatible, los datos obtenidos (p. ej., comportamiento, histología) de esta sesión en particular deba ser excluida del análisis.

El umbral para la neurodegeneración determinado en ratas alerta (nuestros datos no publicados) de sesiones cathodal y anódicas son seguro y bien tolerado en roedores alerta, cuando se utiliza hasta 20 min de estímulo continuo a intensidades por debajo de 31,8 A/m² (equivalente a 0,4 mA con un electrodo de transcranial de 4 mm de diámetro) y cuando se adhieran a las recomendaciones descritas en este protocolo. Sin embargo, elegir intensidades inferiores más cercana a los parámetros de estimulación humana (0.3-1.6 A/m²) o preferentemente dosis-responsabilidadexperimentos se recomiendan para aprovechar al máximo el carácter informativo de los datos obtenidos y para facilitar la traducción hacia delante de los resultados para uso humano.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por la Fundación de investigación alemana (DFG RE 2740/3-1). Agradecemos a Frank Huethe y Thomas Günther por la producción propia de la tES por encargo y estimulador de la DC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Softasept N B. Braun Melsungen AG,
Melsungen, Deutschland
3887138 antiseptic agent
Ethanol 70 % Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland T913.1
arched tip forceps FST Fine science tools, Heidelberg, Deutschland 11071-10
Iris Forceps, 10cm, Straight, Serrated World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA 15914
Scalpel Handle #3, 13cm World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA 500236
Standard Scalpel Blade #10 World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA 500239
Zelletten cellulose swabs Lohmann und Rauscher, Neuwied, Deutschland 13349 5 x 4 cm 
Isoflurane AbbVie Deutschland GmbH & Co N01AB06
Iris Scissors, 11.5cm, Straight World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA 501758 small scissors
cotton swab/cotton buds Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland EH12.1 Rotilabo
Kelly Hemostatic Forceps, 14cm, Straight World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA 501241 surgical clamp
electrode plate (platinum) custom made Wissenschaftliche Werkstatt Neurozentrum Uniklinik Freiburg, Deutschland 10x6 mm, 0.15 mm thickness
insulated copper strands (~1 mm diameter) Reichelt elektronik GmbH & Co. KG, Sande, Germany LITZE BL electrode cable
Weller EC 2002 M soldering station Weller Tools GmbH, Besigheim, Germany EC2002M1D
Iso-Core EL 0,5 mm FELDER GMBH Löttechnik, Oberhausen, Deutschland 20970510 lead free solder
MERSILENE Polyester Fiber Suture Johnson & Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany R871H nonabsorbable braided suture, 4-0
Histoacryl B. Braun Melsungen AG,
Melsungen, Deutschland
9381104 cyanoacrylate
Ketamin 10% Medistar GmbH, Germany n/a anesthetics
Rompun 2% (Xylazine) Bayer GmbH, Germany n/a anesthetics

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Estimulación eléctrica cerebral transcraneal en roedores alerta
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Fritsch, B., Gellner, A. K., Reis, J. Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents. J. Vis. Exp. (129), e56242, doi:10.3791/56242 (2017).More

Fritsch, B., Gellner, A. K., Reis, J. Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents. J. Vis. Exp. (129), e56242, doi:10.3791/56242 (2017).

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