Summary
Este protocolo descreve uma armação cirúrgica para um soquete de eletrodo sub-fascial permanente e um eletrodo implantado no peito em roedores. Colocando um segundo eletrodo na tomada, diferentes tipos de estimulação elétrica do cérebro de transcraniana podem ser entregue para o sistema motor em animais alertas através do crânio intacto.
Abstract
Estimulação elétrica do cérebro de transcraniana pode modular a excitabilidade cortical e plasticidade em humanos e roedores. A forma mais comum de estimulação em seres humanos é a estimulação transcraniana de corrente contínua (tDCS). Menos frequentemente, estimulação transcraniana de corrente alternada (TAC) ou estimulação transcraniana de ruído aleatório (tRNS), uma forma específica de TAC usando uma corrente elétrica aplicada aleatoriamente dentro de um intervalo de frequência pré-definidos, é usada. O aumento da investigação de estimulação cerebral elétrica não invasiva em seres humanos, tanto para fins experimentais e clínicos, resultou em uma maior necessidade de estudos de segurança básico, mecanicista, em animais. Este artigo descreve um modelo para estimulação elétrica do cérebro de transcraniana (tES) através do crânio intacto como alvo o sistema motor em roedores alertas. O protocolo fornece instruções passo a passo para a instalação cirúrgica de um soquete de eletrodo permanente sub-fascial combinado com um eletrodo contador implantado no peito. Colocando um eletrodo de estimulação na tomada sub-fascial, tipos diferentes de estimulação elétrica, comparáveis a tDCS, TAC e tRNS em humanos, podem ser entregue. Além disso, os passos práticos para tES em alertas roedores são introduzidos. A densidade de corrente aplicada, estimulação duração e tipo de estimulação podem ser escolhidos dependendo das necessidades de experimentais. As advertências, vantagens e desvantagens desta montagem são discutidas, assim como aspectos de tolerabilidade e segurança.
Introduction
A administração de transcraniana de correntes elétricas para o cérebro (tES) tem sido usada por décadas para estudar a função do cérebro e para modificar o comportamento. Mais recentemente, a aplicação direta de correntes, ou menos frequentemente correntes alternas (TAC e tRNS), canaliza através do crânio intacto pelo uso de dois ou mais eletrodos (anode(s) e cathode(s)) ganhou interesse científico e clínico. Em particular, tDCS tem sido utilizado em mais de 33.200 sessões em indivíduos saudáveis e pacientes com doenças neuropsiquiátricas e emergiu como um seguro e fácil, econômica aplicação de cabeceira, com possível potencial terapêutico, bem como de longa duração efeitos comportamentais1. Isto claramente rendeu a maior necessidade e o interesse científico em estudos mecanicistas, incluindo aspectos de segurança. Este artigo enfoca a forma mais comumente utilizada de estimulação, tDCS.
Em toda a espécie, tDCS modula a excitabilidade cortical e plasticidade sináptica. Alterações de excitabilidade foram relatadas como dependente da polaridade alteração da taxa de disparo neuronal espontânea em ratos e gatos2,3,4, ou alterações no motor amplitudes de potenciais evocados (MEP) em humanos e ratos ( ambos aumentaram após anodal e diminuição após tDCS cathodal da: humano5,6; rato.7). DCS anodal aumentou a eficácia sináptica de motor cortical ou hippocampal sinapses em vitro durante várias horas após a estimulação ou potenciação de longo prazo (LTP), quando aplicado co com uma entrada sináptica fraca específica ou quando dado antes uma plasticidade induzindo a estimulação8,9,10,11,12. Em conformidade, os benefícios da estimulação na sucesso treinamento motor ou cognitivo, muitas vezes são revelados apenas se tDCS é co aplicada com formação de8,13,14,15. Enquanto estas conclusões anteriores são atribuídas principalmente às funções dos neurônios, note-se que células não-neuronais (glia) podem também contribuir para efeitos funcionais das tDCS. Por exemplo, os níveis de cálcio intracelular hamartomas aumentaram durante tDCS anodal em ratos alerta16. Da mesma forma, tDCS anodal em densidades de corrente abaixo do limiar para a neurodegeneração induzida uma ativação dependente da dose de micróglia17. No entanto, a modulação da interação neurônio-glia por tDCS precisa de maiores investigações específicas.
Tomados junto, animal pesquisa avançada claramente nossa compreensão do efeito moduladora da tDCS na excitabilidade e plasticidade. No entanto, há um observável "lacuna de translação inversa" no aumento exponencial nas publicações de estudos tDCS humana em contraste com o lento e pequeno aumento em investigações sobre os mecanismos subjacentes de tES em vitro e in vivo modelos animais. Além disso, modelos de roedores tES são realizados com alta variabilidade em laboratórios de pesquisa (variando de transdermal a estimulação sub-fascial) e procedimentos de estimulação relatado muitas vezes não são totalmente transparentes, dificultando a comparabilidade e replicabilidade de dados de pesquisa básica, bem como a interpretação dos resultados.
Aqui, descrevemos em detalhe a implementação cirúrgica de uma configuração de estimulação transcraniana cérebro visando o córtex motor primário, que permite a tradução da condição humana tDCS minimizando a variabilidade e permite a estimulação repetida sem dificultando o comportamento. É fornecido um protocolo passo a passo para tES subsequentes em ratos alertas. Aspectos metodológicos e conceituais da aplicação segura de tES em roedores alertas são discutidos.
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Protocol
para pesquisa envolvendo animais, as aprovações (específico do país) relevantes devem ser obtidas antes de iniciar os experimentos. Todas as experiências com animais aqui relatadas são executadas de acordo com a Directiva 2010/63/UE, a lei de proteção animal alemão atualizado (" Tierschutzgesetz ") de julho de 2013 e os regulamentos de atualizada pesquisa animal alemã de agosto de 2013. Protocolos de animais que tenham sido aprovados pelas autoridades locais " Comissão para a experimentação Animal do Conselho Regional da cidade de Freiburg " e " Comissão para a experimentação Animal da Universidade Medical Center Freiburg ".
1. preparação de instrumentação e Material para cirurgia
- certifique-se que os itens listados na Figura 1 estão disponíveis e já colocado para cirurgia.
- Preparar uma placa de platina retangular fina (por exemplo, 10 x 6 x 0,15 mm), que servirá como o elétrodo contrário colocado por via intramuscular, no peito e um soco dois pequenos buracos em dois cantos opostos da placa.
- Soldar um cabo isolado com um comprimento de ~ 10 cm, usando uma lata-solda sem chumbo para um dos cantos da placa de platina (sem um buraco).
- Aplicar uma pequena gota de cola histo-acrílico sobre a articulação de solda para isolamento.
2. Preparação do roedor para cirurgia
- atribuir um número de estudo para o roedor e observe isso na cirurgia preparada cartão
- o roedor de pesar e anotar o peso do cartão da cirurgia. Calcular a dose de anestésicos de injeção (por exemplo, cetamina 100mg/kg de peso corporal mais peso corporal de 70 mg/kg de xilazina para ratos).
- Induzir anestesia por injeção intraperitoneal (i.p.) do montante calculado de anestésicos.
Nota: Quando utilizar anestesia por inalação, em vez disso (por exemplo, isoflurano), coloque o roedor em uma câmara de indução com fluxo contínuo de ~ 4% de oxigênio de 1-2 L/min. - Seleção profundidade da anestesia por reflexo de pitada do dedo do pé começando 5 min pós injeção. Se o reflexo de pitada de dedo do pé está ainda presente, alcançar o prolongamento e aprofundamento da anestesia por injeção de 30% da dose inicial.
- Se em qualquer ponto do tempo no experimento retorna o reflexo de pitada de dedo do pé, 30% da dose inicial da anestesia deve ser injetado.
- Ao usar anestesia por inalação, procure por perda do reflexo postural do roedor na câmara de indução e verifique a profundidade da anestesia pela falta de um reflexo de pitada de dedo do pé. Se os reflexos ainda estão presentes, estenda a duração na câmara de anestesia. Ao longo de todo o experimento, adaptar-se a percentagem de isoflurano para a profundidade da anestesia até atingir uma concentração de manutenção de isoflurano ~1-1.5%.
- Quando ocorre a frequência da respiração diminui e ofegante, reduzir a percentagem; quando o roedor recobra o reflexo de pitada de dedo do pé ou mostra movimento espontâneo, aumentar o percentual de anestésicos de inalação.
- , Assim como os reflexos estão ausentes, colocar o roedor no banco do laboratório ou segurá-la na mão.
Nota: Ao usar anestesia por inalação, fornecer fluxo contínuo isoflurano reduzida (agora entre 2-3%) usando um bocal conectado ao nebulizador. - Remover o cabelo no rato ' cabeça de corte da área de orelha a orelha e o nível dos olhos rostral apenas atrás das orelhas com uma tesoura. Em seguida, remover o cabelo no peito por raspar a área entre as patas dianteiras do xifoide até as clavículas.
Nota: Manter a pele sob tensão facilita o barbear. - Cobrem os olhos do rato com uma gota de pomada para proteger a córnea.
- Marcar o rato ' orelha s de acordo com o número atribuído estudo.
Nota: Dependendo da duração do estudo, uma marca de cauda pode ser suficiente, caso contrário esta especificação padronizada é preferível.
3. Procedimento cirúrgico: Implantação de eletrodos no peito
Nota: este passo pode ser ignorado quando o eletrodo contador é colocado externamente sobre o peito depilado, com um colete.
- Lugar o roedor propenso (no peito) na mesa de operação.
Nota: Em caso de anestesia por inalação, mantenha o rato ' focinho s colocado no bocal da anestesia, reduzindo ainda mais a concentração de isoflurano 1,5-2%. - Desinfectar o couro cabeludo raspado com um spray desinfetante ou com um cotonete embebido em agente anti-séptico (por exemplo, etanol 70%) e deixe secar ao ar. Repita duas vezes.
- Cortar a pele com um bisturi em uma linha do nível do olho rostral para o nível do ouvido médio.
Nota: Este permite o encapsulamento de cabo de conexão do elétrodo implantado no peito em direção ao topo da cabeça e é também o corte desejado para a colocação de soquete de eletrodo DCS. - Transformar o rato para a posição supina, para que o peito fique exposto.
- Desinfectar a pele do peito, conforme descrito no passo 3.2.
- Elevar a pele lateral do peito direito com um fórceps de tecido e corte uma botoeira com tesouras pequenas de cerca de 0,5 cm medial da axila direita. Em seguida, fazer um corte sagital direto na orientação craniana com a tesoura.
- Formam uma bolsa subcutânea por atraumatically desconectando a pele do músculo peitoral maior à esquerda. Fazê-lo repetidamente abrindo a tesoura pequena (ou um cotonete de algodão embebido salina).
- Transformar o animal do seu lado direito fazer um túnel o caminho de cabo do canto esquerdo occipital da pele cabeça aberta ao longo do pescoço para sair no malote peitoral por penetrar a fáscia superficial usando fórceps homeostático.
- Abra cuidadosamente a pinça homeostática para agarrar a extremidade do cabo eletrodo ligado ao eléctrodo de platina sem permitir que o fio afiadas a desviar-se. Puxe o cabo através do túnel até o eletrodo entra o malote, orientado com o ponto de solda para o membro posterior esquerdo de roedores. Rode o roedor para a posição prona.
- Fixar a placa de platina com uma sutura não absorvível trançada sintética estéril à fáscia peitoral os dois buracos de canto (4-5 knots são recomendados para estabilidade) opondo-se.
- Da mesma forma, conecte o cabo à fáscia por um nó frouxo, formando um laço ligeiro antes da entrada do túnel de tecido.
- Fechar a pele com suturas cutâneas de 3-4 dependendo do tamanho do corte (o mesmo material de sutura pode ser usado como para o eletrodo e o cabo).
4. Procedimento cirúrgico: Colocação do tES sub-fascial soquete
- lugar do animal em uma armação estereotáxica.
Nota: Se utilizar anestesia por inalação, diminuir a concentração do anestésico para um fluxo de isoflurano manutenção de ~1.5-1%, ajustado para o reflexo de pitada de dedo do pé e o padrão de respiração. - Desinfectar o couro cabeludo raspado, conforme descrito no passo 3.2.
- Cortar a pele com um bisturi em uma linha do nível do olho rostral para o nível do ouvido médio.
Nota: Se o peito eletrodo placemEnt foi realizada, já foram executadas as etapas 4.2 e 4.3.
Troca de - raspar fora o periósteo (tecido conjuntivo no crânio) para os lados com o bisturi e cuidadosamente limpe com algodão. Fixar o tecido conjuntivo nos 4 cantos de corte com braçadeiras de buldogue e deixá-los ficar lateralmente para manter o campo de cirurgia aberta.
- Aplicar soro fisiológico 0,9% para limpar a superfície do osso e tecido com cotonetes de algodão. Em seguida, limpe a superfície do osso com 3% H 2 O 2. Evite o contacto com o tecido. Pelo presente, o osso é bem mais limpa e pequeno sangramento do osso será interrompido. Além disso, resíduos de periósteo tornam-se visíveis. Remover estes resíduos com um cotonete de algodão, aplicando uma pressão moderada.
Nota: Remoção de resíduos do periósteo aumentará a aderência e a durabilidade do soquete tES colada no osso.- Em caso de hemorragia incontrolável, utilize uma broca de osso e tocá-lo para 1-3 s com ligeira pressão sobre o osso. Este procedimento mecânico na maioria dos casos parará o sangramento sem aquecimento significativo. Nunca use o eletrocautério no osso; Até breve aplicação resultará em dano de tecido cerebral (eletrocautério deve ser usado exclusivamente para ferida sangrando de tecido).
- Como os parafusos de fixação vão melhorar a aderência de set-up, escolha uma broca de encaixe do tamanho do parafuso. Coloque dois buracos no crânio em duas placas diferentes de osso por pre-perfuração com uma broca de mão e, em seguida, pelo aplicativo ligeira pressão vertical com a broca de osso. Evitar proximidade para a posição desejada do soquete tES, pois isso pode impedir aparafusar o eletrodo (por exemplo, para a esquerda tES cortical motor primário, escolher a posição do parafuso parietal direita frontal e posterior).
- No caso de um eletrodo implantado contador, burr um terceiro furo localizado no osso parietal direito posterior para futura fixação do cabo encapsulado.
- Colocar os parafusos de plástico na trepanação e aperte até sente o primeiro atrito. Em seguida, execute três voltas de parafuso adicional de 180 °. Verifique com a pinça para a estabilidade do parafuso e adicionar mais uma curva, se não é suficientemente apertado.
Nota: Para ratos adultos isso garantirá peridural colocação dos parafusos sem danificar a dura-máter ou cérebro (dependendo do design de rosca, a curva número pode variar). O uso de parafusos de aço inoxidável também deve ser viável, desde que mesmo em DCS densidades de corrente acima do limiar de neurodegeneração, colocação de parafuso não perturb lesão local ou medida abaixo os parafusos. - Vez no ferro de soldar e pré-aqueça por aproximadamente 5 min. Enrole o cabo sair do túnel de tecido occipitally em torno do parafuso parietal direita e depois cortá-la, deixando aproximadamente 1 cm cabo atrás do enrolamento. Retirar cuidadosamente o isolamento na extremidade do cabo com um bisturi.
- Consertar o cabo sem fôlego para o parafuso e o osso com cola de cyanoacrylic.
- , Aplique uma pequena quantidade de chumbo estanho-solda para o conector e os fios desencapados do cabo eletrodo contador e conectar ambos premindo brevemente as duas partes pre-soldadas juntos enquanto toca com a ponta de solda até que derreta a solda de estanho (aproximadamente 2-3 s). Remover a ponta de solda imediatamente para evitar o aquecimento excessivo de metal do cabo com dano tecidual subsequente.
- Buscar o soquete de eletrodo tES feito personalizado ( figura 1B, em vermelho) com pinça de ponta curvada, serrilhada e aplique uma camada fina de cola de cyanoacrylic até a borda inferior do soquete. Para a colocação acima o córtex motor e usando um soquete de 4 mm de diâmetro, coloque o ponto de tomada a meados no 2mm anterior e lateral de 2 mm do bregma. Para esta posição, borda medial interna do soquete deve terminar diretamente na sutura sagital e a borda caudal deve terminar na altura do bregma. Pressione o soquete brevemente no osso (a maioria das colas cyanoacrylic endurecem por pressão).
Nota: Colocar uma fonte de luz diretamente sobre o soquete pode facilitar colocação o socket. - , Certifique-se de que o osso dentro da área do soquete é livre de cola (verificando com a luz, porque a cola é reflexiva). No caso de cola derramar, remover o soquete, raspar a cola com o bisturi e repita a etapa 4.12.
- Após o soquete está no lugar e a área da futura estimulação é livre de cola, primeiro selar a borda lateral do soquete ao tecido vizinho com uma pequena gota de cola cyanoacrylic para evitar uma ponte de fluido que pode levar a derivação de corrente neste local. Não aplique demasiada cola como ele pode fluir para a área de estimulação (se isso ocorrer, volte ao passo 4.12).
Nota: Manter a área de estimulação livre de cola é crucial como uma redução da área de estimulação pode aumentar drasticamente a densidade de corrente (A/m ²). - Cobrir todos os parafusos com cola de cyanoacrylic.
- Misturar o cimento acrílico de dois componentes dental em um tubo de silicone pequenas ou vidro. Assim torna-se viscoso, aplicá-lo com uma espátula odontológica para selar as bordas restantes do soquete para o osso. Evitar qualquer fluxo de cimento acrílico odontológico na área de estimulação.
- Finalmente cobrir o crânio inteiro, parafusos, cabo de eletrodo de contador e o soquete até ⅓ do soquete com cimento acrílico dental. Certifique-se de que o cimento tem a viscosidade correta: se muito fluido, fluirá para o tecido circundante; se demasiado duro é difícil distribuí-lo uniformemente.
- Quando é coberto todo o osso e o cimento é endurecido, retire os grampos de buldogue; a pele só deve tocar o cimento construído para que a sutura não é necessária. (Se o corte inicial foi escolhido há muito tempo e o tecido conjuntivo ou muscular é visível, aplicar uma sutura conforme descrito na etapa 3.12).
- , Aplique uma camada de iodo com um cotonete de algodão ao redor da borda da pele cortada e injectar por via subcutânea carprofeno (5 mg/kg de peso corporal dissolvido em 5-7,5 mL de solução salina 0,9% para dor tratamento e fluido de substituição).
Nota: Se utilizar a anestesia por inalação, desligue agora. - Colocar o roedor em uma caixa de aquecimento para a recuperação da anestesia, até que o roedor está acordado e estabilidade postural é restaurada.
Nota: Verifique o animal ' desenvolvimento de peso s, ferida critérios de bem-estar geral e estado diariamente de acordo com a instituição ' recomendação de s.
5. Procedimento de estimulação elétrica transcraniana
Nota: como anestesia afeta efeitos de SMT, realizando a estimulação em roedores alertas sempre que possível é recomendável. Permitir que o roedor recuperar pelo menos 5 dias (cicatrização da ferida cabeça e peito) antes de iniciar os experimentos. Experimentos podem ser realizados nos pontos anteriores de tempo após a cirurgia quando usando um eletrodo contador externo fixado com um colete, como o ferimento no peito é mais irritável; Mas os animais precisam estar habituados com o colete de eletrodo durante vários dias e pode ocorrer interferência com tarefas comportamentais.
- Preencher o soquete de eletrodo tES metade com soro fisiológico a 0,9% e remover bolhas de ar.
- Servante tDCS cathodal da sessões, sempre verifique a cloração e se necessário (por exemplo, uma superfície brilhante prata), re-chlorinate o eletrodo de Ag/AgCl. Antes tDCS anodal sessões, remova possíveis depósitos de AgCl excesso de estímulos anteriores com lixa para permitir a boa condutibilidade durante a estimulação. Enroscar a tampa de rosca tES do eletrodo ( figura 1B, pedaço de cinza).
Cuidado: Falha para re-chlorinate o eletrodo entre sessões tDCS cathodal da conduzirá à exaustão de cloração durante a estimulação e a acumulação tóxica por reação eletroquímica. Isto irá induzir dano tecidual. Não é necessário re-cloração dentro de uma única sessão se estimulação duração é inferior a 20 min. - Conectar os cabos para os dois conectores na cabeça (para a estimulação anodal, o anodal cabo está conectado ao conector na tampa do parafuso, para cathodal da estimulação, é oposto).
Nota: Quando utilizar um eletrodo contador colocado externamente, cobrir o eletrodo contador com gel condutor e coloque sobre o roedor ' peito de s. Este é mais fácil se o eletrodo pre-é fixado em um colete de roedor pequeno, que o roedor pode usar durante a estimulação. - Lugar o roedor na gaiola experimental, com os cabos conectado a um eixo acima da gaiola que permite a livre circulação.
- Ativar o estimulador e ajustar os parâmetros de estimulação (intensidade de estimulação, duração, rampa acima e para baixo tempo).
- Quando não utilizar um dispositivo de estimulação comercialmente disponíveis com um segurança desligado e o alarme de desconexão, incluem um medidor no circuito para verificar o fluxo de corrente constante.
Nota: Com esta configuração, estimulação pode ser aplicada durante o desempenho ou treinamento de tarefas comportamentais. - Verificar se há sinais de estresse ou desconforto do roedor durante estimulação.
- Após o término da estimulação, desconecte os cabos, desatarraxe a tampa do eletrodo na cabeça e limpe e seque o soquete com um cotonete. Retornar o roedor para o ambiente da casa ou prosseguir com um processo comportamental, se desejado.
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Representative Results
A implementação descrita de uma armação para confiável tES repetidas em roedores alertas pode ser facilmente integrada em experimentos mecanicistas, estudos de dose-resposta ou experimentos incluindo tarefas comportamentais. Até à data, a comparabilidade dos dados de estudos com animais usando tES (não invasivo) é dificultada pela variabilidade de tES instantâneas estimulação entre laboratórios e por diferenças nos parâmetros de estimulação (por exemplo, várias densidades de corrente aplicadas no exorbitantes níveis elevados em comparação com a aplicação em seres humanos). Portanto, o valor informativo de pesquisa animal no campo do tES é limitado. Este artigo apresenta uma armação de tES que é fácil de padronize laboratórios implementando a colocação do eletrodo "ativo" no osso acima do córtex alvo (aqui, acima o córtex motor primário (M1)) com solução salina a preferível condutora médio e o eletrodo contador colocado no peito (externamente ou implantados).
Dado o pequeno tamanho dos roedores, colocar o eletrodo acima o córtex alvo na pele do roedor pode levar a excessiva "manobras", particularmente quando o Counter-eletrodo é colocado nas proximidades, por exemplo, no pescoço (para obter exemplos de modelagem atual Veja a Figura 3 (adotado de referência1)). Além disso, a estabilidade e o eletrodo de contato é menos confiável e roedores são mais irritados pela colocação do eletrodo repetidas no couro cabeludo quando usando uma aplicação transdérmica. A fixação de um set-up não permanente também pode impedir o roedor realizando livremente. Em contraste, os roedores ajustar rapidamente a esta organização implantada permanentemente presente.
A estimativa de uma intensidade de estimulação equivalente em comparação com parâmetros de estimulação humano é difícil, desde modelos só podem tomar em consideração um número limitado de fatores e roedores são pachygyric (ver referência1 para a estimativa de uma escala fator). Portanto, a coleta de dados de dose-resposta, incluindo correntes de baixa intensidade pode ser mais informativo. Usando a instalação cirúrgica apresentada em um estudo de dose-resposta em ratos anestesiados, a ativação microglial dose-dependente, superando o período de estimulação (post-estimulação de 24h) foi demonstrada e dissociável de neurodegeneração ocorrendo em alta intensidade DCS (Figura 4; adotado da referência17). Ativação Microglial, avaliada por alteração morfológica, primeiro ocorreu em 31,8 A/m ² (Figura 4), enquanto os primeiros sinais de neurodegeneração foram detectados em 47,8 A/m ². Nesses experimentos, a anestesia afetou claramente a magnitude da resposta ao DCS como a porcentagem de fatias de cérebro com neurônios degeneram positivo de fluorojade C (FJC) em ratos alertas foi maior em 47,8 A/m ² (Figura 4A). Como o limiar para ≥ 24h durando ativação microglial é perto do limiar de lesão, mas extremamente acima as intensidades que promovem processos cognitivos e plásticos fisiológicos nos seres humanos, tal ativação bastante pode indicar uma inflamação pre-lesional induzida pela DCS. Portanto, efeitos comportamentais ou moleculares de DCS nestas intensidades altas deverão ser mecanicamente diferente em comparação com os efeitos de baixa intensidade (Veja o esquema sumarizando os efeitos e as intensidades das tDCS experiências na Figura 5).
Figura 1: suprimentos para cirurgia e o esquema técnica do soquete de tES e eletrodo cap unidade () 1. Cotonetes de algodão, 2. desinfetante, 3. quadro estereotáxico, 4. ferro de soldar, 5. analgésico (por exemplo, carprofeno), 6. & 7. anestésicos (por exemplo, xilazina & cetamina), 8. seringa, 9. Clipper, 10. perfurador de orelha, 11. pomada de (por exemplo, bepanthene), 12. solda estanho chumbo, 13. dois-componente dental cimento acrílico (DAC), 14. iodo, 15. 3% H2O2, 16. soro fisiológico a 0,9%, 17. sintético trançado sutura não absorvível (por exemplo, Mersilene 4-0), 18. brocas, 19. cyanoacrylic cola, 20. braçadeiras de buldogue 21. homeostático fórceps, 22. pinça de ponta curvada, serrilhada, 23. pinça de ponta reta, afiada, 24. reta, pinça de tecido, 25. espátula odontológica, 26. bisturi, 27. tesoura, 28. broca de mão, 29. chave de fenda, 30. motorizada, broca, 31. conectores fêmea, 32. tES de soquete, 33. Praça eléctrodo de platina ligado ao cabo, junção de solda coberto com cola histoacrylic, 34. parafusos de plástico. (B) tomada de tES (vermelha) para a fixação no crânio roedor com um diâmetro interno de 4 mm; a unidade de eletrodo (cinza) é construída por uma tampa de rosca e um selo interno com um orifício central, deixando espaço para o cabo do eléctrodo Ag/Cl disco, que é colado no fundo do carimbo. Isto permite a máxima estabilidade de afinação e evitar a quebra do fio no ponto de conexão-arame-eletrodo sensível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: ratos equipado com afinação tES. O rato do lado esquerdo está equipado com um eletrodo contador externamente fixo sobre o peito depilado. O eletrodo de borracha de carbono é cosido à parte inferior do colete. O rato no lado direito tem um eletrodo implantado no peito com o cabo de um túnel na cabeça. O conector fêmea ligado ao cabo (caudal) é fixado no interior da unidade dental cimento acrílico construída, atrás do soquete para o elétrodo de tES (rostral). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: modelagem de distribuição atual em duas montagens diferentes roedores tES. Modelos de elementos finitos prevendo o fluxo de corrente do cérebro em dois modelos do rato com montagens de tDCS sub-fascial, modificados com permissão1. Usando estes modelos, a densidade de corrente do cérebro de limiar previsto para induzir lesões corticais foi 17,0 A/m ² para a montagem usada por Fritsch, et al 8 (A) e 6.3 A/m ² para a montagem por Rohan, et al 21 (B), correspondente a campos elétricos de 61 e 23 V/m, respectivamente. Observe as discrepâncias no atual padrão de fluxo das duas montagens diferentes. No(na)é aplicada a uma maior densidade de corrente por um tempo mais curto, resultando em uma densidade de carga menor do que em (B). O mais importante a colocação do eletrodo contador (pescoço vs peito) pode ter um impacto adicional sobre o fluxo de corrente de cérebro resultante. Portanto, para interpretação dos dados de roedores, a especificação do tamanho do eletrodo, corrente de colocação (dois eletrodos), aplicada e duração de estimulação é necessária. Note que a corrente real dentro do cérebro do rato só pode ser estimada usando estes modelos computacionais. Escala de cores indica a densidade de corrente de zero a 11,6 A/m ² e acima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: efeitos de resposta de Dose da DCS na ativação da microglia e neurodegeneração em fatias do cérebro obtidos após doses diferentes de tDCS anodal aplicado para o córtex motor primário. A figura é modificada de17 , resumindo os resultados de um estudo de tDCS de dose-resposta reagidos. () Relação entremorfologicamente ativado microglia avaliados pela anti-CD11b/c coloração (veja classificação abaixo) e neurodegeneração revelada pela positividade FCJ. Fatias de motor cortical cerebral de rato foram classificadas por um investigador cego ou como anti-CD11b/c e FCJ coloração negativa, como anti-CD11b/c positiva única (detecção de ativação determinada morfologicamente), ou como anti-CD11b/c e FCJ positivas. Observe que a ativação microglial precedido a ocorrência de neurodegeneração. (B) secções coronais representativo de fatias de cérebro cortical motor esquerdo (em ou perto de +1,56 mm do bregma) de ratos expostos a diferentes intensidades de tDCS anodal aplicado para o córtex motor primário. Em ratos anestesiados, sem sinais de neurodegeneração ocorreram em 31,8 A/m ², enquanto alguns neurônios degeneram estavam presentes em 47,8 dano neuronal e de A/m ² aumentou ainda mais com o aumento da dose. De nota, anodal DCS em 47,8 A/m ² em ratos alertas aumentou a percentagem de fatias com neurodegeneração. Barra de escala para todas as seções: 500 µm. ampliação da entrada da barra escala para todas as seções: 20 µm. (C) amostra histológica imagens do rating da ativação da microglia no anti-CD11b/c imuno-histoquímica, variando de 0 (não ativado) a 4 (severamente ativado ), 1-4 foram classificados como "positivo". Barras de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: esquema ilustrando a relação de atualmente usadas densidades de corrente tDCS roedores em comparação com a aplicação em seres humanos: limiares para inflamação, neurodegeneração e modulação dos processos fisiológicos em durações de estimulação de até 30 min. O atualmente usado roedores DCS densidades de corrente variam de 1.3 a 143 A/m ², com a maioria dos estudos que utilizam mais do que 20 A/m ², enquanto que as densidades de corrente na maioria dos estudos em humanos são entre 0.3 e 0.8 A/m ²,1,14. Parâmetros de estimulação humana são pelo menos uma ordem de magnitude abaixo do limiar para a neurodegeneração1. Limiar para a neurodegeneração é significativamente mais elevado sob anestesia, quando excitabilidade cortical é suprimida17. Duração de ativação microglial começa abaixo mas próximo as intensidades de indução de dano neuronal17. Investigação dos efeitos da DCS na processos fisiológicos cerebrais, em intensidades mais elevadas, abaixo do limiar de lesão de modulação são provavelmente diferentes de teses, vistos em intensidades muito baixas (comparáveis para a aplicação em seres humanos). A tradução exata de parâmetros de estimulação entre as espécies está sob investigação. Estimativas são prejudicadas por passivas fatores como tamanho e Anatomia (sulcos e corticais), mas também por possíveis sensibilidades diferentes para campos elétricos dos neurônios, glia e redes em toda a espécie (não se sabe se o fluxo de corrente mesmo levaria à mesma efeito fisiológico). Portanto, o projeto de estudo mais informativo está testando tES efeitos em forma de resposta de dose, incluindo as intensidades de corrente muito baixas. O esquema é baseado em dados de7,12,16,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 (duração de estimulação máxima de 30 min por sessão, dados são de modelos animais de doença excluídos). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve materiais típicos e etapas do procedimento cirúrgica realização de uma configuração de tES permanentes, bem como para estimulação subsequente em roedores alertas. Durante a preparação de um roedor tES experimentar, vários aspectos metodológicos (segurança e tolerabilidade de tES, parâmetro de resultado), bem como aspectos conceituais (comparabilidade com a condição humana, os efeitos previstos da estimulação em um cérebro particular região) precisam ser levados em conta. Do ponto de vista metodológico, a instalação cirúrgica do soquete tES craniana com o elétrodo contrário implantado no peito é vantajosa para estudos longitudinais, uma vez que permite a aplicação em alerta, movimentando-se livremente roedores. Habituação do roedor para as conexões de cabo e instalação permanente é necessária, mas depois disso, ele permite que tES mesmo em combinação com tarefas comportamentais. Além disso, o desconforto do roedor durante estimulação é provavelmente inferior com esta instalação comparada a usar um eletrodo contador cosido um colete, uma vez que os movimentos não são restritos ao antigo contacto caso e tecido do eletrodo implantado durante estimulação é assegurada.
A afinação de tES apresentado tem sido usada para experiências que duram até 3 meses, sem qualquer descontinuidade de cabo eletrodo, instabilidade material ou infecção. Assim, é provável que o set-up também é adequado para experiências mais neste período.
Esta montagem de estimulação sub-fascial impede a derivação excessiva através de estruturas dérmicas, que provavelmente está ocorrendo em maior medida em roedores, dada a relação do eletrodo ao tamanho do corpo (ver Figura 3 e referência1). O set-up implantado para estimulação sub-fascial em roedores permite alta praticidade para experimentos em movimentando-se livremente animais, uma definição clara das posições de eletrodo e confiabilidade de entrega atual. Enquanto esses fatores representam grandes vantagens para a padronização das experiências, a discrepância à estimulação transdérmica em seres humanos ou roedores (por exemplo, referências de32,33) deve ser mantida em mente. No entanto, para a tradução dos resultados, a quantidade real de atual de chegar ao cérebro (densidade de corrente do cérebro), independente da passagem através de diferentes tecidos, é de grande relevância,34. Colocação do eletrodo contador geralmente determina a direção e a distribuição do fluxo atual1. Assim, para a polarização dos neurônios, uma colocação do eletrodo contador no peito (direção dorsoventral do fluxo atual) pode ser mais eficaz em relação ao posicionamento no pescoço (direção rostrocaudal de fluxo de corrente).
Estudos abordando os mecanismos subjacentes de tES ou seu efeito sobre o comportamento devem sempre que possível ser realizado em roedores alertas, já que anestesia significativamente interage com (patho)-processos fisiológicos, incluindo a atividade neuronal35 ,36 e plasticidade36,,37e pode suprimir ou alterar tES eficácia17(e nossas observações inéditas) ou prejudicar o1,17. Vice-versa, resultados obtidos em roedores anestesiados não permitem uma inferência directa para a condição de alerta, potencialmente dificultando a tradução para a frente à pesquisa em seres humanos. Um exemplo das diferenças de tDCS aplicado ao córtex motor de ratos anestesiados e ratos alertas é mostrado na seção resultados representativos. tDCS aplicado a igualmente altas densidades de corrente induzidas por uma maior taxa de ativação da microglia e neurodegeneração em ratos alertas contra ratos anestesiados17. Enquanto estas conclusões são parte de um experimento de dose-resposta, na qual tDCS efeitos na microglia e neurodegeneração ocorreram em intensidades altas (não recomendável para uso em estudos comportamentais ou mechanistical), é tentador especular que no atual baixa tDCS densidades, o mesmo desvio de resultados ocorreria consoante o estado de alerta do roedor.
Finalmente, uma outra vantagem do protocolo fornecido é a redução das possíveis fontes de erro. Estratégias de solução de problemas e etapas críticas tem sido destacadas no protocolo. Estes incluem a escolha da densidade de corrente adequada para a investigação específica finalidade (como discutido acima), a necessidade de preparação dos eletrodos tES antes cada um aplicado a estimulação e o cuidadosamente e repetiu o cheque para condutância confiável. No que respeita à preparação do eléctrodo, cloração do eletrodo antes cathodal da estimulação (ou seja, cátodo sobre a área alvo cortical) é absolutamente crucial desde exaustão de cloração durante estimulação conduzirá ao acúmulo tóxico por reações eletroquímicas e, secundariamente, causa danos nos tecidos. Em nossa experiência, exaustão de cloração não ocorre dentro do primeiro 20 min de estimulação. Pelo contrário, antes repetida estimulação anodal, deposição de Ag/Cl no ânodo deve ser removida para evitar a interrupção da estimulação. Condutância é um ponto crítico, que não somente se relaciona à preparação do eletrodo, mas também para a sessão de estimulação prático do roedor, bem como a qualidade da implantação cirúrgica de soquete tES. Encerramento do socket tES ao crânio circundante e área de tecido deve ser assegurado durante os procedimentos cirúrgicos para a correta estimativa da densidade de corrente. Manobras ao longo do tecido adjacente leva a superestimação da corrente aplicada ao cérebro por um lado e podem alterar os resultados fisiológicos, com base na distorção de direção de fluxo atual. Por outro lado, a redução da área de estimulação — por deposição de Ag/Cl (veja acima) ou pela cobertura da área de estimulação durante tES soquete implantação (por exemplo, pela colagem acrílica de cimento ou histoacrylic) — pode levar a subestimação da mecânicas densidade de corrente e estimulação através de uma área reduzida pode levar a danos no tecido simplesmente por densidades de corrente de pico elevado involuntariamente. Por último, o condutor médio, por exemplo, solução salina, precisa ser otimamente distribuídos sobre a área de estimulação para permitir a estimulação contínua. Durante uma experiência em curso, condutância alterada pode tornar-se visível como a seguir: comportamento inesperado do roedor (sinais de estresse, desempenho variável em uma tarefa específica), variações na entrega atual exibido em um amperímetro de parte elétrica circuito, ou completa perda da continuidade de estimulação. Neste caso, os eléctrodos devem ser limpos de depoimentos e a área de estimulação deve ser inspeccionada novamente para quaisquer detritos. As conexões dos cabos, colocação do eletrodo tES na respectiva tomada e o condutor médio devem ser verificadas e substituídas quando aparecem disfuncional. Se tES entrega era inconsistente, os dados obtidos (por exemplo, comportamento, histologia) desta sessão particular podem precisar ser excluído da análise.
O limiar para a neurodegeneração determinado em ratos alertas (nossos dados não publicados) de sessões cathodal da e anodal são seguro e bem tolerado em roedores alertas, quando usando até 20 min. de estimulação contínua com intensidades abaixo de 31,8 A/m ² (equivalente a 0,4 mA com um eletrodo de transcraniana de diâmetro de 4 mm) e, quando aderem às recomendações descritas neste protocolo. No entanto, escolhendo o menores intensidades mais perto para os parâmetros de estimulação humana (0.3-1.6 A/m ²) ou de preferência dose-respostasSe as experiências são recomendadas para maximizar o caráter informativo dos dados obtidos e para facilitar a tradução direta dos resultados para aplicação em seres humanos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação de pesquisa alemã (DFG RE 2740/3-1). Agradecemos Frank Huethe e Thomas Günther a produção interna do set-up feito por tES e DC-estimulador.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softasept N | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland |
3887138 | antiseptic agent |
| Ethanol 70 % | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland | T913.1 | |
| arched tip forceps | FST Fine science tools, Heidelberg, Deutschland | 11071-10 | |
| Iris Forceps, 10cm, Straight, Serrated | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 15914 | |
| Scalpel Handle #3, 13cm | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 500236 | |
| Standard Scalpel Blade #10 | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 500239 | |
| Zelletten cellulose swabs | Lohmann und Rauscher, Neuwied, Deutschland | 13349 | 5 x 4 cm |
| Isoflurane | AbbVie Deutschland GmbH & Co | N01AB06 | |
| Iris Scissors, 11.5cm, Straight | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 501758 | small scissors |
| cotton swab/cotton buds | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland | EH12.1 | Rotilabo |
| Kelly Hemostatic Forceps, 14cm, Straight | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 501241 | surgical clamp |
| electrode plate (platinum) | custom made | Wissenschaftliche Werkstatt Neurozentrum Uniklinik Freiburg, Deutschland | 10x6 mm, 0.15 mm thickness |
| insulated copper strands (~1 mm diameter) | Reichelt elektronik GmbH & Co. KG, Sande, Germany | LITZE BL | electrode cable |
| Weller EC 2002 M soldering station | Weller Tools GmbH, Besigheim, Germany | EC2002M1D | |
| Iso-Core EL 0,5 mm | FELDER GMBH Löttechnik, Oberhausen, Deutschland | 20970510 | lead free solder |
| MERSILENE Polyester Fiber Suture | Johnson & Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany | R871H | nonabsorbable braided suture, 4-0 |
| Histoacryl | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland |
9381104 | cyanoacrylate |
| Ketamin 10% | Medistar GmbH, Germany | n/a | anesthetics |
| Rompun 2% (Xylazine) | Bayer GmbH, Germany | n/a | anesthetics |
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