Summary
Questo protocollo descrive un set-up chirurgico per un socket di elettrodo epicranica permanente e un elettrodo impiantato in roditori. Inserendo un secondo elettrodo nella presa, diversi tipi di stimolazione elettrica cerebrale transcranica possono essere consegnati per il sistema motorio in allerta animali attraverso il cranio intatto.
Abstract
Stimolazione elettrica cerebrale transcranica può modulare l'eccitabilità corticale e plasticità in esseri umani e roditori. La forma più comune di stimolazione in esseri umani è la stimolazione transcranica corrente continua (tDCS). Meno frequentemente, corrente alternata la stimolazione transcranica (TAC) o la stimolazione transcranica rumore casuale (tRNS), una forma specifica di TAC utilizzando una corrente elettrica applicata in modo casuale all'interno di una gamma di frequenza pre-definito, viene utilizzata. L'aumento della ricerca di stimolazione non invasiva elettrica del cervello in esseri umani, sia per scopi sperimentali e clinici, ha dato una maggiore necessità di studi di base, meccanicistico, sicurezza negli animali. Questo articolo descrive un modello di stimolazione elettrica cerebrale transcranica (tES) attraverso il cranio intatto il sistema motorio nei roditori avvisi di targeting. Il protocollo fornisce istruzioni dettagliate per il set-up chirurgico di un socket di elettrodo permanente epicranica combinato con un controelettrodo impiantato sul petto. Inserendo un elettrodo di stimolazione nella presa epicranica, tipi differenti di stimolazione elettrica, paragonabili a tDCS tACS e tRNS in esseri umani, possono essere consegnati. Inoltre, vengono introdotti i passaggi pratici per tES in avvisi roditori. La densità di corrente applicata, la stimolazione durata e tipo di stimolazione possono essere scelti a seconda delle esigenze sperimentali. Le avvertenze, i vantaggi e gli svantaggi di questo set-up sono discusse, così come aspetti di tollerabilità e sicurezza.
Introduction
L'amministrazione di transcranial di correnti elettriche al cervello (tES) è stato utilizzato per decenni per studiare la funzione del cervello e per modificare il comportamento. Più recentemente, l'applicazione diretta di correnti, o meno frequentemente correnti alternate (tACS e tRNS), non invasivo attraverso il cranio intatto mediante l'uso di due o più elettrodi (anode(s) e cathode(s)) ha guadagnato l'interesse scientifico e clinico. In particolare, tDCS è stato utilizzato in più di 33.200 sessioni in soggetti sani e pazienti con malattie neuropsichiatriche ed è emerso come un sicuro e facile, conveniente applicazione sul comodino, con potenziale terapeutico possibile, nonché a lunga durata effetti comportamentali1. Questo ha reso chiaramente la maggiore necessità e interesse scientifico per gli studi meccanicistici, compresi gli aspetti di sicurezza. Questo articolo si concentra sulla forma più comunemente usata di stimolazione, tDCS.
Tra le specie, tDCS modula l'eccitabilità corticale e plasticità sinaptica. Eccitabilità cambiamenti sono stati segnalati come alterazione di polarità-dipendente di tasso di infornamento di un neurone spontanea in ratti e gatti2,3,4, o cambiamenti nel motore ampiezze (MEP) potenziali evocate in esseri umani e topi ( entrambi aumentati dopo anodica e in diminuzione dopo tDCS cathodal: umano5,6; del mouse7). Anodica DCS aumentata efficacia sinaptica del motore corticale o hippocampal sinapsi in vitro per diverse ore dopo la stimolazione o potenziamento a lungo termine (LTP), quando co-applicato con un input sinaptico debole specifico o quando somministrato prima di una plasticità induzione della stimolazione8,9,10,11,12. Secondo, i benefici della stimolazione con successo di formazione motorie o cognitive spesso si rivelano solo se tDCS è co-applicata con formazione8,13,14,15. Mentre questi risultati precedenti sono principalmente attribuiti alle funzioni dei neuroni, si deve osservare che le cellule non neuronali (glia) possono anche contribuire agli effetti funzionali del TDC. Per esempio, livelli di calcio intracellulare astrocytic aumentato durante tDCS anodica in topi avviso16. Allo stesso modo, tDCS anodica a densità di corrente di sotto della soglia per la neurodegenerazione indotta un'attivazione dipendente dalla dose di microglia17. Tuttavia, la modulazione delle interazioni neuroni-glia di tDCS necessita di ulteriori indagini specifiche.
Presa insieme, animale ricerca avanzato chiaramente la nostra comprensione dell'effetto modulatory di tDCS sull'eccitabilità e plasticità. Tuttavia, c'è un observable "divario traslazionale inversa" nell'aumento esponenziale delle pubblicazioni di studi tDCS umana in contrasto con il lento e lieve incremento nelle indagini i meccanismi di tES in vitro e in vivo modelli animali. Inoltre, roditore tES modelli vengono eseguite con elevata variabilità in laboratori di ricerca (che vanno da transdermico epicranica stimolazione) e stimolazione segnalati procedure spesso non sono completamente trasparente che ostacolano la comparabilità e replicabilità di dati di ricerca di base, nonché l'interpretazione dei risultati.
Qui, descriviamo in dettaglio l'implementazione chirurgica di un assetto di stimolazione transcranica cervello targeting la corteccia motoria primaria, che consente la traduzione alla condizione umana tDCS, riducendo al minimo la variabilità e permette la stimolazione ripetuta senza ostacolando il comportamento. Viene fornito un protocollo passo-passo per successive tES in ratti avvisi. Aspetti metodologici e concettuali della applicazione sicura di tES in avvisi roditori sono discussi.
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Protocol
per la ricerca che coinvolgono gli animali, le approvazioni relative (specifico per paese) devono essere ottenute prima di iniziare gli esperimenti. Tutti gli esperimenti animali segnalati qui sono eseguiti secondo la direttiva 2010/63/UE, la legge di protezione animale tedesco aggiornato (" Tierschutzgesetz ") del luglio 2013 e il regolamento aggiornato ricerca animale tedesco dell'agosto 2013. Protocolli di animali sono stati approvati dalle autorità locali " Commissione per la sperimentazione animale del Consiglio regionale di Freiburg " e " della Commissione per la sperimentazione animale dell'Università medica Center Friburgo ".
1. preparazione della strumentazione e materiale per la chirurgia
- assicurarsi che gli elementi elencati nella Figura 1 sono disponibili e già posizionato per chirurgia.
- Preparare una piastra rettangolare sottile di platino (ad esempio, 10 x 6 x 0,15 mm), che servirà come l'elettrodo contatore posizionato sottocute sul petto e due piccoli fori in due angoli opposti della piastra del punzone.
- Saldare un cavo isolato con una lunghezza di ~ 10 cm utilizzando una stagno-saldatura senza piombo a uno degli angoli (senza foro) della piastra platino.
- Applicare una piccola goccia di colla histo-acrilico sul giunto di saldatura per isolamento.
2. Preparazione del roditore per chirurgia
- assegnare un numero di studio per il roditore e notare che questo sul preparato chirurgia card.
- Pesare il roditore e annotare il peso sulla scheda di chirurgia. Calcolare la dose di anestetici di iniezione (ad es., ketamina 100 mg/kg di peso corporeo più xilazina 70 mg/kg di peso corporeo per i ratti).
- Indurre anestesia tramite l'iniezione intraperitoneale (i.p.) della quantità calcolata di anestetici.
Nota: Quando si utilizza invece l'anestesia per inalazione (ad es., isoflurano), posizionare il roditore in un'aula di induzione con flusso continuo di ~ 4% in 1-2 L/min di ossigeno. - Controllo profondità dell'anestesia dal riflesso del pizzico di punta a partire 5 min dopo l'iniezione. Se il riflesso di pizzico di punta è ancora presente, raggiungere il prolungamento e l'approfondimento dell'anestesia tramite iniezione del 30% della dose iniziale.
- Se in qualsiasi momento nell'esperimento restituisce il riflesso di pizzico di punta, il 30% della dose iniziale di anestesia deve essere iniettato.
- Quando si utilizza l'anestesia per inalazione, guardare per la perdita del riflesso posturale del roditore nella camera di induzione e controllare la profondità dell'anestesia dalla mancanza di un riflesso di pizzico di punta. Se i riflessi sono ancora presenti, è possibile estendere la durata nella camera di anestesia. In tutto l'intero esperimento, adattare la percentuale di isoflurane alla profondità dell'anestesia fino a raggiungere una concentrazione di manutenzione di isoflurane ~1-1.5%.
- Quando la frequenza di respirazione diminuisce ansimante e si verifica, abbassare la percentuale; quando il roditore riacquista il riflesso di pizzico di punta o Mostra movimento spontaneo, aumentare la percentuale di inalazione anestetica.
- , Non appena i riflessi sono assenti, posizionare il roditore sul banco di laboratorio o tenerlo in mano.
Nota: Quando si utilizza l'anestesia per inalazione, fornire flusso costante ridotta isoflurano (ora tra 2-3%) utilizzando un ugello collegato al nebulizzatore. - Rimuovere i capelli sul ratto ' testa di s con la rasatura della zona da orecchio a orecchio e tra il livello rostrale occhio appena dietro le orecchie con un clipper. Quindi rimuovere i peli sul petto con la rasatura della zona tra le zampe anteriori da xifoideo fino alle clavicole.
Nota: Mantenere la pelle in tensione facilita la rasatura. - Coprire gli occhi del ratto con una goccia di unguento oculare per proteggere la cornea.
- Mark ratto ' orecchio s secondo il numero assegnato Studio.
Nota: A seconda della durata dello studio, un marchio di coda potrebbe essere sufficiente, altrimenti lo stanziamento standardizzato è preferibile.
3. Chirurgico: L'impianto petto elettrodo
Nota: questo passaggio può essere ignorato quando il controelettrodo è posizionato esternamente sul petto rasato con un giubbotto di.
- Posto il roditore incline (sul petto) sulla tabella di funzionamento.
Nota: In caso di anestesia per inalazione, ratto di tenere ' muso s inserito nella bocchetta di anestesia, riducendo ulteriormente la concentrazione di isoflurane 1.5-2%. - Disinfettare il cuoio capelluto rasato con un disinfettante spray o con un tampone imbevuto di agente antisettico (per esempio etanolo 70%) e lasciare asciugare all'aria. Ripetere due volte.
- Tagliare la pelle con un bisturi in una sola riga dal livello rostrale occhio al livello dell'orecchio medio.
Nota: Questo permette per il tunneling del cavo dell'elettrodo impiantato petto verso la parte superiore della testa ed è anche il taglio desiderato per il posizionamento di presa elettrodo DCS. - Girare il ratto alla posizione supina, in modo che il petto è esposto.
- Disinfettare la pelle del torace, come descritto al punto 3.2.
- Elevare la pelle laterale della cassa di destra con un forcipe del tessuto e tagliare un'asola con piccole forbici di circa 0,5 cm mediale da axilla di destra. Poi fate un taglio dritto sagittale orientamento cranica con le forbici.
- Formare una tasca sottocutanea di atraumatico scollegare la pelle dal muscolo pettorale del sinistro. Farlo aprendo ripetutamente le piccole forbici (o un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione fisiologica).
- Girare l'animale sul suo lato destro al tunnel del percorso dei cavi dall'angolo occipitale sinistra della pelle testa aperta lungo il collo per uscire nel sacchetto pettorale penetrando la fascia superficiale usando il forcipe omeostatico.
- Aprire con cautela il forcipe omeostatico per afferrare l'estremità del cavo dell'elettrodo collegato all'elettrodo di platino senza fili taglienti di allontanarsi. Tirare il cavo attraverso il tunnel fino a quando l'elettrodo entra il sacchetto, orientato con il punto di saldatura verso l'arto posteriore sinistro di roditori. Riportare il roditore alla posizione prona.
- Fissare la piastra di platino con una sutura non assorbibile intrecciata sintetica sterile alla fascia pettorale presso i due opposti fori di angolo (4-5 nodi sono raccomandati per la stabilità).
- Allo stesso modo collegare il cavo alla fascia con un nodo sciolto, formando un ciclo leggero prima dell'ingresso del tunnel nel tessuto.
- Chiudere la pelle con 3-4 suture cutanee a seconda delle dimensioni del taglio (lo stesso materiale di sutura può essere utilizzato per quanto riguarda l'elettrodo e cavo).
4. Procedura chirurgica: Posizionamento del tES epicranica Socket
- posto l'animale in una cornice stereotassica.
Nota: Se usando l'anestesia per inalazione, abbassare la concentrazione di anestetico a un flusso di isoflurane manutenzione del ~1.5-1%, regolato per la punta pizzico reflex e il pattern respiratorio. - Disinfettare il cuoio capelluto rasato come descritto al punto 3.2.
- Tagliare la pelle con un bisturi in una sola riga dal livello rostrale occhio al livello dell'orecchio medio.
Nota: Se il petto elettrodo placemENT è stata eseguita, già stata eseguita la procedura 4.2 e 4.3. - Raschiare fuori il periostio (tessuto connettivo sul cranio) ai lati con il bisturi e accuratamente pulire con cotone scambia. Fissare il tessuto connettivo ai 4 angoli del taglio con morsetti bulldog e farli appendere lateralmente per mantenere il campo di chirurgia aperta.
- Soluzione fisiologica 0,9% applica per pulire la superficie dell'osso e dei tessuti con tamponi di cotone. Quindi pulire la superficie dell'osso con 3% H 2 O 2. Evitare il contatto con il tessuto. Con la presente l'osso è più accuratamente pulito e sanguinamento minore dall'osso verrà arrestato. Inoltre, i residui del periostio diventano visibili. Rimuovere questi residui con un batuffolo di cotone, applicare una pressione moderata.
Nota: La rimozione dei residui periostio aumenterà adesione e durata del socket tES incollato sull'osso.- In caso di emorragia inarrestabile, utilizzare un trapano di osso e toccarlo per 1-3 e con una leggera pressione sull'osso. Nella maggior parte dei casi questa procedura meccanica si ferma l'emorragia senza riscaldamento significativo. Non usare mai l'elettrocauterio sull'osso; applicazione anche breve si tradurrà in danno di tessuto cerebrale (elettrocauterizzazione deve essere utilizzato esclusivamente per la ferita del tessuto sanguinante).
- Come viti di fissazione migliorerà l'aderenza di set-up, scegliete una punta di trivello la dimensione della vite di montaggio. Posizionare due fori della bava su due placche ossee differenti di pre-forare con un trapano a mano e quindi dall'applicazione di leggera pressione verticale con la punta dell'osso. Evitare la vicinanza nella posizione desiderata della presa tES, come esso potrebbe ostacolare avvittare l'elettrodo (ad es., per la sinistra tES corticale motore primario, scegliere posizione vite parietale destra frontale e posteriore).
- In caso di un elettrodo contatore impiantati, Bava un terzo foro situato nell'osso parietale posteriore di destra per la fissazione del futura del cavo con tunnel.
- Posizionare le viti di plastica nei fori della bava e avvitare fino a sentita il primo attrito. Quindi eseguire tre giri di vite ulteriori 180 °. Verifica con il forcipe per la stabilità della vite e aggiungere un altro giro se non abbastanza stretto.
Nota: Per i ratti adulti ciò garantirà epidurale posizionamento delle viti senza danneggiare la dura o il cervello (secondo il disegno del filetto di vite, il turno numero potrebbe variare). L'utilizzo di viti in acciaio inox anche dovrebbe essere fattibile, poiché anche a densità di corrente DCS sopra la soglia di neurodegenerazione, posizionamento delle viti ha fatto non perturbare le posizione della lesione o misura sotto le viti. - Disabilita il saldatore e pre-riscaldare per circa 5 min. avvolgere il cavo di uscita del tunnel di tessuto occipitally intorno alla vite del parietale di destra e poi tagliarla, lasciando circa 1 cm cavo dietro l'avvolgimento. Striscia con attenzione l'isolante all'estremità del cavo con un bisturi.
- Fissare il cavo senza fiato per la vite e l'osso con colla cyanoacrylic.
- Applicare una piccola quantità di piombo stagno-saldatura per il connettore e i fili scoperti del cavo elettrodo contatore e collegare entrambi premendo brevemente entrambi parti pre-saldate insieme mentre si tocca la punta del saldatore fino a quando si scioglie la latta-saldatura (circa 2-3 s). Rimuovere la punta di saldatura immediatamente per evitare un riscaldamento eccessivo del metallo del cavo con danno tissutale conseguente.
- Pick up il socket di elettrodo personalizzato fatto tES ( Figura 1B, in rosso) con una pinza a punta piegata, seghettate e applicare un sottile strato di colla cyanoacrylic al bordo inferiore dello zoccolo. Per il posizionamento sopra la corteccia motoria e tramite un socket di diametro 4 mm, posizionare il punto di presa metà a 2 mm anteriore e laterale di 2 mm dal bregma. Per questa posizione, il bordo mediale interno del socket dovrebbe terminare direttamente con la sutura sagittale e il bordo caudale deve terminare all'altezza di bregma. Premere la presa brevemente sull'osso (la maggior parte cyanoacrylic Colle induriscono di pressione).
Nota: Posizionare una fonte di luce direttamente sopra la presa può facilitare immissione il socket. - Assicurarsi che l'osso all'interno dell'area della presa è privo di colla (controllando con la luce perché la colla è riflettente). Nel caso di colla fuoriuscita, staccare la presa, raschiare la colla con il bisturi e ripetere il passaggio 4,12.
- Dopo la presa è a posto e la zona di stimolazione futuro è priva di colla, in primo luogo sigillare il bordo laterale del socket per il tessuto vicino con una piccola goccia di colla cyanoacrylic per evitare un ponte fluido che poteva portare allo smistamento di corrente in questa posizione. Non applicare colla troppo in quanto esso può confluire nell'area di stimolazione (in questo caso, tornare al passaggio 4,12).
Nota: Mantenere l'area di stimolazione libera di colla è fondamentale in quanto una riduzione dell'area di stimolazione potrebbe aumentare notevolmente la densità di corrente (A/m ²). - Coprire tutte le viti con colla cyanoacrylic.
- Mescolare il cemento acrilico dentale due componenti in un tubo di silicone o vetro. Non appena diventa viscoso, applicare con una spatola dentale per sigillare i bordi restanti del socket per l'osso. Evitare qualsiasi flusso di cemento dentale acrilico in area di stimolazione.
- Infine coprire l'intero cranio, viti, Cavo elettrodo contatore e la presa fino a ⅓ della presa con cemento acrilico dentale. Assicurarsi che il cemento abbia la giusta viscosità: se troppo fluido, fluirà nel tessuto circostante; Se troppo duro è difficile per distribuirlo uniformemente.
- Quando tutti l'osso è coperto e il cemento è indurito, rimuovere i morsetti bulldog; la pelle deve toccare appena il cemento costruito affinché la sutura non è necessaria. (Se il taglio iniziale è stato scelto troppo lungo e il tessuto connettivo o muscolo è visibile, applicare una sutura come descritto al punto 3.12).
- Applicare uno strato di iodio con un tampone di cotone intorno al bordo del taglio pelle e iniettare per via sottocutanea carprofen (5 mg/kg di peso corporeo disciolti in 5-7.5 mL di soluzione fisiologica allo 0,9% per la sostituzione del fluido e trattamento di dolore).
Nota: Se si utilizza l'anestesia per inalazione, spegnerlo ora. - Inserire il roditore in una casella scaldavivande per recupero dall'anestesia, fino a quando il roditore è sveglio e viene ripristinata la stabilità posturale.
Nota: Controllare l'animale ' sviluppo di peso s, ferita criteri statali e generale benessere tutti i giorni secondo l'istituzione ' raccomandazione s.
5. Procedura di stimolazione elettrica transcranica
Nota: anestesia colpisce tES effetti, eseguire la stimolazione in roditori avvisi quando possibile è consigliabile. Consentire il roditore a recuperare per almeno 5 giorni (guarigione della ferita testa e torace) prima di iniziare gli esperimenti. Gli esperimenti possono essere eseguiti ai punti di tempo precedenti dopo l'intervento chirurgico quando si utilizza un elettrodo contatore esterno fissato con un gilet, come la ferita al petto è più irritabile; ma gli animali devono essere abituati al gilet elettrodo per diversi giorni e potrebbero verificarsi interferenze con mansioni comportamentistiche.
- Riempire la presa di elettrodo tES metà con soluzione fisiologica allo 0,9% e rimuovere le bolle d'aria.
- EssereFore cathodal tDCS sessioni, sempre controllare la clorazione e se necessario (ad esempio una superficie d'argento lucida), ri-cloro l'elettrodo Ag/AgCl. Prima delle sessioni di tDCS anodica, rimuovere eventuali depositi di AgCl in eccesso da precedenti stimolazioni con carta vetrata per consentire buona conducibilità durante la stimolazione. Avvitare il tappo a vite elettrodo tES ( Figura 1B, pezzo grigio).
Attenzione: Il mancato ri-cloro l'elettrodo tra le sessioni cathodal tDCS porterà all'esaurimento di clorurazione durante la stimolazione e ad accumulo tossico di reazione elettrochimica. Questo può indurre danni ai tessuti. Ri-clorazione non è necessaria all'interno di una singola sessione se stimolazione durata è inferiore a 20 min. - Collegare i cavi ai due connettori sulla testa (per stimolazione anodica, il cavo anodica sia collegato al connettore sul tappo a vite, per cathodal stimolazione, è opposto).
Nota: Quando si utilizza un elettrodo contatore posizionato esternamente, coprire il controelettrodo con gel conduttivo e posto il roditore ' petto s. Questo è più facile se l'elettrodo è prefissato in una posizione ideale in un piccolo roditore gilè, che il roditore può indossare durante la stimolazione. - Luogo il roditore nella gabbia sperimentale, con i cavi collegato a un girevole sopra la gabbia che consente il libero movimento.
- Accendere lo stimolatore e regolare i parametri di stimolazione (intensità di stimolazione, durata, rampa su e giù per tempo).
- Quando non si utilizza un dispositivo di stimolazione disponibile in commercio con un arresto di sicurezza e allarme di sconnessione, includono un metro nel circuito per controllare il flusso di corrente costante.
Nota: Con questo set-up, stimolazione può essere applicata durante le prestazioni o la formazione di mansioni comportamentistiche. - Controllare i segni di stress o disagio del roditore durante la stimolazione.
- Dopo la fine della stimolazione, scollegare i cavi, svitare il tappo di elettrodi sulla testa e pulire e asciugare la presa con un batuffolo di cotone. Tornare il roditore nell'ambiente domestico o procedere con una procedura del comportamento, se lo si desidera.
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Representative Results
L'implementazione descritta di un set-up per tES affidabile ripetuta nei roditori avvisi sono facilmente integrabili in meccanicistici esperimenti, studi di dose-risposta o esperimenti tra cui mansioni comportamentistiche. Ad oggi, la comparabilità dei dati dagli studi sugli animali usando tES (non invasiva) è ostacolata dalla variabilità delle configurazioni di stimolazione tES tra laboratori e da differenze nei parametri di stimolazione (ad es., varie densità di corrente applicata alle alti livelli esorbitanti rispetto all'applicazione umana). Quindi, il valore informativo di ricerca sugli animali nel campo della tES è limitato. Questo articolo presenta un set-up tES che è facile da standardizzare laboratori implementando il posizionamento dell'elettrodo "attivo" l'osso sopra la corteccia mirata (qui sopra la corteccia motoria primaria (M1)) con soluzione salina come la preferibile conduttivo medio e il controelettrodo collocati sul petto (esternamente o impiantati).
Date le piccole dimensioni dei roditori, ponendo l'elettrodo sopra la corteccia mirata sulla pelle il roditore può condurre allo smistamento eccessivo, specialmente quando la contro-elettrodo si trova nelle immediate vicinanze, per esempio, nel collo (per esempi di modellazione corrente Vedi Figura 3 (adottato da riferimento1)). Inoltre, il contatto di stabilità e l'elettrodo è meno affidabile e roditori sono più irritati dalla posizionamento ripetuta degli elettrodi sul cuoio capelluto quando si utilizza un'applicazione transdermica. La fissazione di un set-up non permanente può anche ostacolare il roditore di eseguire liberamente. Al contrario, i roditori regolare rapidamente per questo set-up impiantato permanentemente presente.
La stima di un'intensità di stimolazione equivalente rispetto ai parametri di stimolazione umana è difficile, poiché modelli possono solo prendere in considerazione un numero limitato di fattori e roditori sono pachygyric (Vedi riferimento1 per la stima di uno scaling fattore). Pertanto, la raccolta dati dose-risposta, incluse le correnti di bassa intensità può essere più informativo. Utilizzando il set-up chirurgici presentato in uno studio di dose-risposta in ratti anestetizzati, l'attivazione microglial dose-dipendente, superando il periodo di stimolazione (post-stimolazione 24 h) è stata dimostrata e dissociabile da neurodegeneration che si verificano ad alta intensità di DCS (Figura 4; adottato dal riferimento17). L'attivazione microgliale, valutata dall'alterazione morfologica, si è verificato in primo luogo a 31,8 A/m ² (Figura 4), mentre i primi segni della neurodegenerazione sono stati rilevati al 47,8 A/m ². In questi esperimenti, l'anestesia influenzato chiaramente la grandezza della risposta a controller di dominio come la percentuale di fettine di cervello con fluorojade C (FJC) positivo degenerazione neuroni in allarme ratti era superiore al 47,8 A/m ² (Figura 4A). Come la soglia per ≥ 24 h durata attivazione microglial è vicino alla soglia di lesione, ma notevolmente sopra le intensità che favoriscono i fisiologici processi cognitivi e plastica in esseri umani, tale attivazione piuttosto potrebbe indicare un'infiammazione pre-lesional indotta da DCS. Quindi, gli effetti comportamentali o molecolari del DCS a queste alte intensità si presume siano meccanicisticamente diverse rispetto agli effetti di bassa intensità (vedere lo schema che riassume gli effetti e le intensità di tDCS esperimenti nella Figura 5).
Figura 1: forniture per chirurgia e schema tecnico del tES presa ed elettrodo tappo unità (A) 1. Tamponi di cotone, 2. disinfettante, 3. stereotactic telaio, 4. saldatore, 5. analgesico (ad es., carprofen), 6. & 7. anestetici (per esempio, xilazina & ketamina), 8. siringa, 9. Clipper, 10. perforatore di orecchio, 11. unguento oculare (ad es., bepanthene), 12. saldare a stagno senza piombo, 13. due-componente cemento acrilico dentale (DAC), 14. iodio, 15. 3% H2O2, 16. soluzione fisiologica allo 0,9%, 17. sintetico intrecciato sutura non riassorbibile (ad es., Mersilene 4-0), 18. punte, 19. colla cyanoacrylic, 20. Morsetti Bulldog 21. forcipe omeostatico, 22. pinza punta piegata, seghettate, 23. pinza punta dritto, affilato, 24. dritto, pinze, 25. spatola dentale, 26. bisturi, 27. forbici, 28. trapano a mano, 29. cacciavite, 30. trapano, 31 con comando a motore. connettori femmina, 32. presa di tES, 33. Piazza elettrodo di platino collegata al cavo, giunto di saldatura ricoperta di colla histoacrylic, 34. viti in plastica. (B) presa di tES (rosso) per il fissaggio sul cranio del roditore con un diametro interno di 4 mm; l'unità di elettrodo (grigio) è costruito da un tappo a vite e un timbro interiore con un foro centrale, lasciando spazio per il cavo dell'elettrodo Ag/Cl disco, che è incollata alla parte inferiore del timbro. Questo consente per la massima stabilità dell'assetto e l'elusione delle rotture di filo nel punto di collegamento filo-elettrodo sensibile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: ratti dotato di set-up tES. Il ratto sulla sinistra è dotato di un elettrodo contatore esternamente fisso sul petto rasato. L'elettrodo di carbonio gomma è cucito alla parte inferiore della maglia. Il ratto sulla destra ha un elettrodo impiantato sul petto con il cavo con tunnel alla testa. Il connettore femmina collegato al cavo (caudale) è fissato all'interno dell'unità dentale cemento acrilico costruito, dietro la presa per l'elettrodo di tES (rostrale). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: modellazione di distribuzione della corrente in due diversi tES roditore montaggi. Modelli agli elementi finiti predire il flusso di corrente del cervello in due modelli di ratto con epicranica tDCS montaggi, modificati con autorizzazione1. Utilizzando questi modelli, la densità di corrente di soglia prevista del cervello per indurre lesioni corticali era 17.0 A/m ² per il montaggio usato da Fritsch, et al. 8 (A) e 6,3 A/m ² per il montaggio di Rohan, et al. 21 (B), corrispondenti ai campi elettrici di 61 e 23 V/m, rispettivamente. Notare le discrepanze l'attuale modello di flusso dei due diversi montaggi. Nel()viene applicata un'alta densità di corrente per un tempo più breve, risultante in una densità di carica inferiore rispetto a (B). La cosa più importante il posizionamento dell'elettrodo contatore (collo vs torace) potrebbe avere un impatto aggiuntivo sul conseguente flusso di corrente del cervello. Pertanto, per l'interpretazione dei dati del roditore, la specifica della dimensione degli elettrodi, corrente di posizionamento (entrambi gli elettrodi), applicato e la durata di stimolazione è necessaria. Si noti che la quantità di corrente all'interno del cervello di ratto può essere stimato solo utilizzando questi modelli computazionali. Scala a colori indica la densità di corrente da zero a 11,6 A/m ² e sopra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: effetti di risposta Dose di DCS su attivazione microgliale e neurodegenerazione nelle fette del cervello ottengono dopo dosi differenti di tDCS anodica applicato per la corteccia motoria primaria. La figura è stata modificata da17 che riassume i risultati di immunohistological di uno studio di dose-risposta tDCS. (A) rapporto tramicroglia morfologicamente attivato valutato da anti-CD11b/c che macchia (voto Vedi sotto) e la neurodegenerazione ha rivelato dalla positività FJC. Fette di motore corticali del cervello del ratto sono stati valutati da un ricercatore accecato sia come anti-CD11b/c e FJC macchiatura negativa, come anti-CD11b/c positivo solo (rilevamento di attivazione determinato morfologicamente), o come sia anti-CD11b/c e FJC positivi. Si noti che l'attivazione microglial preceduto occorrenza della neurodegenerazione. (B) sezioni coronale rappresentative delle fette di cervello corticale motore sinistro (a o vicino a +1,56 mm dal bregma) dai ratti esposti a diverse intensità di tDCS anodica applicato per la corteccia motoria primaria. In ratti anestetizzati, senza segni di neurodegenerazione si è verificato a 31,8 A/m ², mentre alcuni neuroni in degenerazione erano presenti a 47,8 danni A/m ² e un neurone ulteriormente aumentata con l'aumento della dose. Di nota, DCS anodica a 47,8 A/m ² in ratti avvisi ha aumentato la percentuale delle fette con il neurodegeneration. Barra della scala per tutte le sezioni: 500 µm. ingrandimento ingresso scala bar per tutte le sezioni: 20 µm. (C) immagini campione istologico del rating di attivazione della microglia in immunoistochimica anti-CD11b/c, che vanno da 0 (non attivato) a 4 (severamente attivato ), 1-4 sono stati classificati come "positivo". Scala bar = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: schema che illustra la relazione tra attualmente utilizzato roditore tDCS densità di corrente rispetto all'applicazione umana: soglie per infiammazione, neurodegenerazione e la modulazione dei processi fisiologici alle durate di stimolazione fino a 30 min. Attualmente usate roditore DCS densità di corrente compreso tra 1.3 e 143 A/m ² con la maggioranza degli studi utilizzando più di 20 A/m ², mentre la densità di corrente nella maggior parte degli studi sull'uomo sono compresi tra 0,3 e 0,8 A/m ²1,14. Parametri di stimolazione umano sono almeno un ordine di grandezza inferiore alla soglia di neurodegenerazione1. Soglia per la neurodegenerazione è significativamente più alto nell'ambito dell'anestesia, quando eccitabilità corticale è soppressa17. Durata di attivazione microglial inizia di sotto ma vicino le intensità di indurre danno neuronale17. Indagine di modulare gli effetti del DCS su processi fisiologici cerebrali a più alta intensità sotto la soglia di lesione sono probabilmente diversi dalle tesi visti a bassissima intensità (paragonabile all'applicazione umana). La traduzione esatta dei parametri di stimolazione tra specie è sotto inchiesta. Le valutazioni sono ostacolate da fattori passive come dimensione e anatomia (solchi e circonvoluzioni), ma anche di possibili diverse sensibilità ai campi elettrici di neuroni, glia e reti tra le specie (non è noto se il flusso di corrente stesso porterebbe allo stesso effetto fisiologico). Di conseguenza, il disegno di studio più informativo è testare gli effetti tES in un modo dose risposta, tra cui intensità di corrente molto basso. Il regime si basa su dati provenienti da7,12,16,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 (durata di stimolazione massima di 30 minuti per sessione, sono dati da modelli animali di malattia esclusi). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive materiali tipici e procedure dettagliate per realizzazione chirurgica di un assetto permanente tES, nonché per stimolazione successiva in avvisi roditori. Durante la preparazione di un roditore tES sperimentare, diversi aspetti metodologici (sicurezza e tollerabilità di tES, parametro di risultato), nonché aspetti concettuali (comparabilità con la condizione umana, gli effetti previsti di stimolazione su un cervello particolare Regione) devono essere presi in considerazione. Da un punto di vista metodologico, il set-up chirurgici della presa tES cranica con il controelettrodo petto impiantato è vantaggioso per gli studi longitudinali poiché permette per applicazione nell'avviso, liberi di muoversi roditori. L'assuefazione del roditore per i collegamenti del cavo e set-up permanente è necessaria, ma in seguito, permette di tES anche in combinazione con attività comportamentali. Inoltre, il disagio del roditore durante la stimolazione è probabilmente inferiore con questo set-up rispetto a indossare un controelettrodo cucito in un gilet, dato che i movimenti non sono limitati nel contatto ex cassa e tessuto dell'elettrodo impiantato durante la stimolazione è assicurata.
Il set-up presentato tES è stato utilizzato per esperimenti di durata fino a 3 mesi, senza discontinuità Cavo elettrodo, instabilità del materiale o infezione. È quindi probabile che il set-up è adatto anche per gli esperimenti più lunghi di questo periodo.
Questo montaggio di stimolazione epicranica previene eccessiva lo smistamento tramite le strutture cutanee, che è probabile che si verificano in misura maggiore nei roditori, tenuto conto della relazione dell'elettrodo alla dimensione corporea (Vedi Figura 3 e riferimento1). Il set-up impiantati per epicranica stimolazione in roditori consente elevata praticità per gli esperimenti nel muoversi liberamente gli animali, una chiara definizione delle posizioni dell'elettrodo e l'affidabilità dell'erogazione di corrente. Mentre questi fattori rappresentano importanti vantaggi per la standardizzazione degli esperimenti, la discrepanza di stimolazione transcutanea in esseri umani o roditori (ad esempio, fa riferimento a32,33) dovrebbe essere tenuta presente. Tuttavia, per la traduzione dei risultati, l'importo effettivo di corrente raggiunge il cervello (densità di corrente del cervello), indipendente di passaggio attraverso diversi tessuti, è di grande rilevanza34. Posizionamento dell'elettrodo contatore determina generalmente la direzione e la distribuzione del flusso corrente1. Così, per la polarizzazione dei neuroni, un posizionamento dell'elettrodo contatore sul petto (dorsoventral direzione del flusso di corrente) può essere più efficace rispetto al posizionamento del collo (rostrocaudal direzione del flusso di corrente).
Studi di affrontare i meccanismi di fondo del suo effetto sul comportamento o tES dovrebbero sempre fattibile essere eseguita nei roditori avvisi, poiché l'anestesia interagisce significativamente con fisio (Pato)-processi fisiologici, tra cui attività neuronale35 ,36 e plasticità36,37e può sopprimere o modificare tES efficacia17(e le nostre osservazioni non pubblicate) o danneggiare1,17. Viceversa, risultati ottenuti nei roditori anestetizzati non consentono un'inferenza diretta per la condizione dell'avviso, potenzialmente ostacolare Traduzione Avanti per ricercare in esseri umani. Nella sezione risultati rappresentativi è riportato un esempio delle differenze di tDCS applicato alla corteccia di motore in ratti anestetizzati e avvisi ratti. tDCS applicato alle altrettanto elevate densità di corrente indotta da un maggior tasso di attivazione microgliale e neurodegenerazione in ratti avvisi rispetto a ratti anestetizzati17. Mentre questi risultati sono parte di un esperimento di dose-risposta in cui tDCS effetti sulla microglia e neurodegenerazione avvenuta ad alte intensità (non consigliato per l'utilizzo in studi meccanicistico o comportamentali), che si è tentati di speculare che al basso tDCS corrente densità, si verificherebbe la stessa deviazione di risultati a seconda la vigilanza del roditore.
Infine, un altro vantaggio del protocollo fornito è la riduzione delle possibili fonti di errore. Strategie di risoluzione dei problemi e passaggi critici sono stati evidenziati nel protocollo. Questi includono la scelta appropriata della densità di corrente per la particolare ricerca scopo (come discusso sopra), la necessità di preparazione degli elettrodi tES prima ognuna applicata la stimolazione e il fondo e ripetuto controllo per conduttanza affidabile. Per quanto riguarda la preparazione dell'elettrodo, clorazione dell'elettrodo prima cathodal stimolazione (cioè, catodo sopra l'area di destinazione corticale) è assolutamente cruciale poiché esaurimento di clorurazione durante la stimolazione porterà ad accumulo tossico di le reazioni elettrochimiche e, secondariamente, causa danni ai tessuti. Nella nostra esperienza, esaurimento di clorazione non si verifica entro i primi 20 min di stimolazione. Al contrario, prima ripetuta stimolazione anodica, Ag/Cl deposizione all'anodo deve essere rimosso per evitare la sospensione della stimolazione. Conduttanza è un punto critico, che non solo si riferiscono alla preparazione dell'elettrodo, ma anche per la seduta di stimolazione pratico di roditore, come pure la qualità dell'impianto chirurgico di socket tES. Chiusura del socket tES per la circostante cranio e la zona di tessuto dovrebbe essere garantita durante le procedure chirurgiche per la corretta stima della densità di corrente. Lo smistamento lungo tessuto adiacente conduce alla sopravvalutazione della corrente applicata al cervello da un lato e può alterare il fisiologici risultati basati sulla distorsione della direzione di flusso corrente. D'altra parte, riduzione dell'area di stimolazione — mediante deposizione di Ag/Cl (Vedi sopra) o mediante copertura della zona di stimolazione durante tES presa l'impianto (ad es., di colla acrilica di cemento o histoacrylic) — può condurre a sottovalutazione delle arti densità di corrente e la stimolazione tramite un'area ridotta può provocare danni tissutali semplicemente di picco involontariamente ad alta densità di corrente. Infine, il mezzo conduttivo, ad es., soluzione fisiologica, deve essere distribuita in modo ottimale sopra l'area di stimolazione per consentire per stimolazione continua. Durante un esperimento in corso, conduttanza alterata può diventare visibile come indicato di seguito: un comportamento imprevisto del roditore (segni di stress, prestazione variabile su un particolare compito), variazioni nell'erogazione di corrente visualizzata su un amperometro dell'elettrico circuito, o la perdita completa della continuità di stimolazione. In questo caso, gli elettrodi devono essere puliti da deposizioni, e l'area di stimolazione deve essere ispezionato nuovamente per eventuali detriti. Collegamenti dei cavi, posizionamento dell'elettrodo tES nella rispettiva presa e il mezzo conduttivo dovrebbero essere controllati e sostituiti quando appare disfunzionale. Se consegna tES è stato incoerente, i dati ottenuti (ad es., comportamento, istologia) di questa particolare sessione potrebbero essere necessario essere esclusi dall'analisi.
La soglia per la neurodegenerazione determinata in ratti avvisi (nostri dati non pubblicati) delle sessioni sia cathodal e anodica sono sicuro e ben tollerato in roditori avvisi, quando si utilizza fino a 20 min di stimolazione continua a intensità sotto 31,8 A/m ² (pari a 0,4 mA con un elettrodo di transcranial di diametro 4 mm) e quando aderendo alle raccomandazioni descritte in questo protocollo. Tuttavia, scegliendo intensità inferiore più vicino per i parametri di stimolazione umano (0.3-1.6 A/m ²) o preferibilmente dose-responsaSe gli esperimenti sono raccomandati per massimizzare il carattere informativo dei dati ottenuti e per facilitare la traduzione diretta dei risultati all'applicazione sull'uomo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione di ricerca tedesco (DFG RE 2740/3-1). Ringraziamo Frank Huethe e Thomas Günther per la produzione in-House del set-up su misura tES e DC-stimolatore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softasept N | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland |
3887138 | antiseptic agent |
| Ethanol 70 % | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland | T913.1 | |
| arched tip forceps | FST Fine science tools, Heidelberg, Deutschland | 11071-10 | |
| Iris Forceps, 10cm, Straight, Serrated | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 15914 | |
| Scalpel Handle #3, 13cm | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 500236 | |
| Standard Scalpel Blade #10 | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 500239 | |
| Zelletten cellulose swabs | Lohmann und Rauscher, Neuwied, Deutschland | 13349 | 5 x 4 cm |
| Isoflurane | AbbVie Deutschland GmbH & Co | N01AB06 | |
| Iris Scissors, 11.5cm, Straight | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 501758 | small scissors |
| cotton swab/cotton buds | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland | EH12.1 | Rotilabo |
| Kelly Hemostatic Forceps, 14cm, Straight | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 501241 | surgical clamp |
| electrode plate (platinum) | custom made | Wissenschaftliche Werkstatt Neurozentrum Uniklinik Freiburg, Deutschland | 10x6 mm, 0.15 mm thickness |
| insulated copper strands (~1 mm diameter) | Reichelt elektronik GmbH & Co. KG, Sande, Germany | LITZE BL | electrode cable |
| Weller EC 2002 M soldering station | Weller Tools GmbH, Besigheim, Germany | EC2002M1D | |
| Iso-Core EL 0,5 mm | FELDER GMBH Löttechnik, Oberhausen, Deutschland | 20970510 | lead free solder |
| MERSILENE Polyester Fiber Suture | Johnson & Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany | R871H | nonabsorbable braided suture, 4-0 |
| Histoacryl | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland |
9381104 | cyanoacrylate |
| Ketamin 10% | Medistar GmbH, Germany | n/a | anesthetics |
| Rompun 2% (Xylazine) | Bayer GmbH, Germany | n/a | anesthetics |
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