Summary
Det här protokollet beskriver en kirurgisk set-up för en permanent epicranial elektrod uttag och en implanterad bröstet elektrod på gnagare. Genom att placera en andra elektroden i uttaget, kan olika typer av transkraniell elektrisk hjärnstimulering levereras till det motoriska systemet i alert djur genom intakt skallen.
Abstract
Transkraniell elektrisk hjärnstimulering kan modulera kortikala upphetsning och plasticitet hos människa och gnagare. Den vanligaste formen av stimulering hos människa är transkraniell likström stimulering (TDC). Mindre ofta, används transkraniell växelström stimulering (TAC) eller transkraniell slumpmässigt brus stimulering (tRNS), en särskild form av TAC med hjälp av en elektrisk ström appliceras slumpmässigt inom en fördefinierad frekvensområde. Ökningen av noninvasiv elektrisk stimulering hjärnforskning i människor, både för experimentell och klinisk tillämpning, har gett ett ökat behov av grundläggande, mekanistisk, säkerhetsstudier i djur. Denna artikel beskriver en modell för transkraniell elektrisk hjärnstimulering (tES) genom intakt skallen inriktning det motoriska systemet i alert gnagare. Protokollet innehåller stegvisa instruktioner för kirurgiska set-up för en permanent epicranial elektrod socket kombinerat med en implanterad counter elektrod på bröstet. Genom att placera en stimulering elektrod i uttaget epicranial, kan olika elektrisk stimulering typer, jämförbar med TDC, TAC och tRNS hos människor, levereras. Dessutom introduceras de praktiska steg för tES i alert gnagare. Tillämpad strömtäthet, stimulering varaktighet och stimulering typ kan väljas beroende på de experimentella behov. De varningar, fördelar och nackdelar med detta upplägg diskuteras, samt säkerhet och tolerabilitet.
Introduction
Transkraniell administrationen av elektriska strömmar till hjärnan (tES) har använts i årtionden att studera hjärnans funktion och ändra beteende. Mer nyligen, ansöker direkt strömmar, eller mindre ofta växelströmmar (TAC och tRNS), flourescerande genom intakt skallen genom användning av två eller flera elektroder (anode(s) och cathode(s)) har vunnit vetenskapliga och kliniska intresse. I synnerhet TDC har använts i mer än 33,200 sessioner hos friska försökspersoner och patienter med neuropsykiatriska sjukdomar och har vuxit fram som en säker och enkel, kostnadseffektiv sängkanten ansökan, med möjliga terapeutiska potential samt långvarig beteendemässiga effekter1. Detta gav tydligt ökade behovet och vetenskapligt intresse för mekanistiska studier, inklusive säkerhetsaspekter. Denna artikel fokuserar på den vanligaste formen av stimulering, TDC.
Mellan arter modulerar TDC kortikala retbarhet och synaptisk plasticitet. Retbarhet förändringar har rapporterats som polaritet-beroende ändring av spontana neuronala eldhastighet i råttor och katter2,3,4, eller förändringar i motor evoked potential (MEP)-amplituder i människor och möss ( båda ökade efter anodal och minskade efter katodal TDC: mänskliga5,6. mus7). Anodal DCS ökade synaptic effekten av motor kortikala eller Hippocampus synapser i vitro i flera timmar efter stimulering eller lång sikt potentiering (LTP), när Co tillämpas med en viss svag synaptic ingång eller när ges före en plasticitet inducerande stimulering8,9,10,11,12. I enlighet, avslöjas ofta fördelarna med stimulering på motorisk eller kognitiv utbildning framgång endast om TDC är samtidig tillämpad utbildning8,13,14,15. Medan dessa tidigare fynd hänförs främst till funktioner av nervceller, bör det noteras att icke-neuronala celler (glia) kan också bidra till funktionella effekter av TDC. Exempelvis ökade astrocytic intracellulära kalciumnivåer under anodal TDC i alert möss16. Likaså inducerade anodal TDC på strömtätheter under tröskeln för neurodegeneration en dos beroende aktivering av mikroglia17. Moduleringen av neuron-glia interaktion av TDC måste dock ytterligare specifika undersökningar.
Tas tillsammans, djurs forskning avancerade klart vår förståelse av den immunmodulerande effekten av TDC på retbarhet och plasticitet. Det finns dock en ”inverterad translationell gap” observerbara i exponentiell ökning i publikationer av mänskliga TDC studier i motsats till den långsamma och mindre ökning i undersökningar av de bakomliggande mekanismerna för tES i in vitro- och in vivo djurmodeller. Dessutom gnagare tES modeller utförs med hög variabilitet över forskningslaboratorier (alltifrån transdermal till epicranial stimulering) och rapporterade stimulering förfaranden är ofta inte helt transparent hindra jämförbarheten och replikerbarhet av grundforskning data samt tolkning av resultaten.
Här beskriver vi i detalj kirurgiska genomförandet av en transkraniell hjärnan stimulering set-up inriktning primära motoriska cortex, vilket gör att översättningen i villkoret mänskliga TDC samtidigt minimera variabiliteten, och tillåter upprepad stimulering utan hindra beteende. Ett steg för steg protokoll för efterföljande tES i alert råttor tillhandahålls. Metodologiska och begreppsliga aspekterna av säkra tillämpningen av tES i alert gnagare diskuteras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
för forskning på djur, de relevanta (landsspecifika) godkännanden måste erhållas innan experiment. Alla djurförsök som redovisas här utförs enligt de EU-direktiv 2010/63/EU, den uppdaterade tyska djurskyddslag (" Tierschutzgesetz ") i juli 2013 och uppdaterade tyska djurförsök reglementet av augusti 2013. Djur protokoll har godkänts av de lokala myndigheterna " kommissionen för djur experiment av regionala rådet av Freiburg " och " kommissionen för djur experiment av University Medical Center Freiburg ".
1. beredning av instrumentering och Material för kirurgi
- Se till att de poster som anges i figur 1 är tillgängliga och redan placerade för kirurgi.
- Förbereda en tunn rektangulär platina platta (t.ex. 10 x 6 x 0,15 mm), som kommer att fungera som counter elektroden placeras subkutant på bröstet, och två små hål i två motsatta hörn av plattan.
- Löda en isolerad kabel med en längd på ~ 10 cm med en blyfri tenn-lödtenn till ett av hörnen (utan hål) av platina plattan.
- Applicera en liten droppe histo-akryl lim på lödning gemensamma isolering.
2. Beredning av gnagare för kirurgi
- tilldela en studienummer till gnagare och notera detta på den förberedda kirurgin card.
- Väga gnagare och anteckna vikten på kirurgi kortet. Beräkna dosen av injektion anestetika (exempelvis ketamin 100 mg/kg kroppsvikt plus xylazin 70 mg/kg kroppsvikt för råttor).
- Inducera anestesi av intraperitoneal (IP) injektion av den beräkna mängden bedövningsmedel.
Obs: När du använder inandning anestesi istället (t.ex. isofluran), placera gnagare i en induktion kammare med kontinuerligt flöde av ~ 4% i 1-2 L/min syre. - Kontrollera djup anestesi av tå nypa reflexen börjar 5 min efter injektionen. Om tå nypa reflexen finns kvar, nå förlängning och fördjupning av anestesi genom injektion av 30% av den initiala dosen.
- Om vid någon tidpunkt i experimentet returnerar den tå nypa reflexen, 30% av den initiala dosen av anestesi bör injiceras.
- När du använder inandning anestesi, leta efter förlusten av den postural reflexen av gnagare i induktion kammaren och kontrollera djup anestesi av bristen på en tå nypa reflex. Om reflexer är fortfarande närvarande, förlänga i anestesi kammaren. Hela hela experimentet, anpassa procentandelen av isofluran till djupet av anestesi tills de når en underhåll koncentration av ~1-1.5% isofluran.
- När frekvensen av andning minskar och kippar inträffar, lägre procentsatsen; när gnagare återfår den tå nypa reflexen eller visar spontan rörelse, öka andelen inandning bedövningsmedel.
- Så snart reflexer är frånvarande, placera gnagare på bänken lab eller håll den i handen.
Obs: När du använder inandning anestesi, ge fortsatt minskad isofluran flöde (nu mellan 2-3%) med hjälp av ett munstycke som ansluten till nebulisatorn. - Ta bort håret på råtta ' s huvud genom rakning området från öra till öra och mellan rostralt ögonhöjd till strax bakom öronen med en clipper. Ta sedan bort hår på bröstet genom rakning området mellan frambenen från xiphoid upp till nyckelbenen.
Obs: Att hålla huden spänd underlättar rakningen. - Täcka ögonen på råtta med en droppe ögonsalva att skydda hornhinnan.
- Markera råtta ' s öra enligt de tilldelade studienummer.
Obs: Beroende på längden av studien, en svans mark kan räcka, annars standardiserade öronmärkning är att föredra.
3. Kirurgiskt ingrepp: Bröstet elektrod Implantation
Obs: detta steg kan hoppas över när räknaren elektroden placeras externt på rakat bröstet med en väst.
- Plats gnagare benägna (på bröstet) på tabellen drift.
Obs: Vid inandning anestesi, hålla råttan ' s nos placeras i anestesi munstycket, ytterligare minska isofluran koncentrationen till 1,5-2%. - Desinficera rakad hårbotten med en desinficerande spray eller med en bomullstuss indränkt i antiseptiskt medel (t.ex. etanol 70%) och låt lufttorka. Upprepa två gånger.
- Skära huden med en skalpell i en linje från den rostralt ögonhöjd till mitten av örat nivå.
Obs: Detta tillåter tunneling av anslutningskabeln från implanterade bröst elektroden mot toppen av huvudet och även önskad snittet för DCS elektrod socket placering. - Slå Råttan till ryggläge, så att bröstkorgen utsätts.
- Desinficera huden på bröstet som beskrivs i steg 3,2.
- Höj laterala huden på den högra kistan med en vävnad pincett och skära ett knapphål med liten sax med ca 0,5 cm mediala från den högra armhålan. Sedan göra ett rakt sagittala snitt i kranial riktning med saxen.
- Bildar en subkutan påse av atraumatiskt koppla huden från vänster stora bröstmuskeln. Göra det genom att upprepade gånger öppna den liten sax (eller av en saltlösning indränkt bomullstuss).
- Slå djuret på dess högra sida till tunnel kabel vägen från det vänstra occipital hörnet av öppnade huvud huden längs halsen för att lämna in byxor påsen genom tränger den ytliga fascia använder homeostatiska pincett.
- Öppna försiktigt homeostatiska tången till hugg efter slutet av elektrodkabeln bifogas platina elektroden utan att låta vassa trådarna till bortsprungna. Dra kabeln genom tunneln tills elektroden går in i påsen, orienterade med lödning peka mot det gnagare vänstra bakbenet. Vrid gnagarart tillbaka till benägna.
- Fixa platina plattan med en steril syntetisk flätad icke-resorberbar sutur till byxor fascian på de två motsatta hörnet hål (4-5 knop rekommenderas för stabilitet).
- På samma sätt fast kabeln till fascian av en lös knut, bildar en liten slinga för hänrycka av vävnad tunneln.
- Nära huden med 3-4 kutan suturer beroende på storleken på snittet (samma sutur material kan användas för elektrod och kabel).
4. Kirurgiskt ingrepp: Placering av den Epicranial tES Socket
- plats djuret i en stereotaktisk ram.
Obs: Om med inandning anestesi, sänker koncentrationen av bedövningsmedlet till ett underhåll isofluran flöde av ~1.5-1%, justerat till tå nypa reflex och andningsmönster. - Desinficera rakad hårbotten som beskrivs i steg 3,2.
- Skära huden med en skalpell i en linje från den rostralt ögonhöjd till mitten av örat nivå.
Obs: Om den bröstet elektrod placeringENT utfördes, steg 4.2 och 4.3 har redan utförts. - Skrapa av periostet (bindväv på skallen) till sidorna med en skalpell och noggrant torka bort med bomull swappar. Fixera det connective silkespappret på 4 hörn av snittet med bulldog klämmor och låt dem hänga sidled för att hålla fältet kirurgi öppen.
- Tillämpa 0,9% koksaltlösning att rengöra benytan och vävnad med bomullspinnar. Ren sedan benytan med 3% H 2 O 2. Undvik kontakt med vävnaden. Härmed benet är mer noggrant rengöras och mindre blödning från benet kommer att stoppas. Även blir rester av periostet synliga. Ta bort dessa rester med en bomullstuss som måttlig påtryckningsmedel.
Obs: Avlägsnande av periostet residualerna ökar vidhäftning och hållbarhet av uttaget tES limmas på benet.- Vid ostoppbar blödning, använda ett ben borr och röra den för 1-3 s med lätt tryck på benet. Denna mekaniska åtgärd stoppar i de flesta fall blödningen utan betydande uppvärmning. Använd aldrig diatermi med ben, även kort ansökan kommer att resultera i skador på hjärnan (diatermi bör enbart användas för sår vävnad blödning).
- Som fixering skruvarna kommer att förbättra set-up följsamhet, välja en borr som passande skruv storlek. Placera två burr hål på två olika benplattor av förborrning med en handborr och sedan av lätt vertikal tryck program med ben borren. Undvik närhet till önskad position för tES uttaget, eftersom det kan hindra skruvning i elektroden (t.ex. för vänstra primära motoriska kortikala tES, välja rätt frontal och posteriora parietala skruven ställning).
- Vid en inopererad counter elektrod, skorra ett tredje hål som ligger i höger bakre parietala ben för framtida fixering av tunnlade kabeln.
- Placera plastskruvar i burr hål och skruva tills första friktionen är klädde med filt. Utför sedan tre ytterligare 180 ° skruv svängar. Kontrollera med pincett för stabiliteten i skruven och Lägg till en mer tur om inte hårt nog.
Obs: För vuxna råttor Detta säkerställer epidural placering av skruvarna utan att skada den dura eller hjärnan (beroende gänga design, turn nummer kan variera). Användning av rostfritt stål skruvar bör också vara möjligt, eftersom även vid DCS strömtätheter tröskelvärdet för neurodegeneration, skruv placering inte stör lesion läge eller omfattningen under skruvarna. - Tur på lödkolven och förvärmning för cirka 5 min. vind kabeln spännande vävnad tunneln occipitally runt höger parietala skruven och sedan klippa det, lämna ca 1 cm kabel bakom lindningen. Noggrant remsa isoleringen i slutet av kabeln med en skalpell.
- Fixa omständlig kabeln på skruv och ben med cyanoacrylic lim.
- Applicera en liten mängd av blyfri tenn-lodet att kontakten och de frilagda ledningarna av counter elektrodkabeln och Anslut båda genom att både pre lödde delar tillsammans medan röra lödning spetsen tills tin-lodet smälter (ca 2-3 s). Ta bort lödning spetsen omedelbart för att undvika överdriven metall värme av kabeln med efterföljande vävnadsskada.
- Plocka upp uttaget anpassade gjort tES elektrod ( figur 1B, i rött) med böjd, sågtandade tips pincett och applicera ett tunt lager av cyanoacrylic lim till den nedre kanten av uttaget. För placering ovanför motoriska cortex och använda en 4 mm diameter uttaget, placera mitten av uttaget plats på 2 mm främre och 2 mm i sidled från bregma. För denna ståndpunkt, den inre mediala gränsen av uttaget bör upphöra direkt på sagittal suturen och stjärtfenan gränsen bör avsluta på höjden av bregma. Tryck på uttaget kort på benet (de flesta cyanoacrylic lim hårdnar vid trycket).
Obs: Placera en ljuskälla direkt ovanför sockeln kan underlätta att placera uttaget. - Se till att benet inom området i uttaget är gratis lim (genom att kontrollera med ljus eftersom limmet är reflekterande). När det gäller lim spill, ta bort uttaget, skrapa limmet med en skalpell och upprepa steg 4.12.
- Efter uttaget är på plats och området framtida stimulering är gratis av lim, tätning först den laterala kanten av uttaget i närliggande vävnad med en liten droppe cyanoacrylic lim att undvika en flytande bro som kan leda till rangering av nuvarande på denna plats. Gäller inte för mycket lim eftersom det kan rinna in i området stimulering (om detta inträffar, återgå till steg 4.12).
Obs: Att hålla området stimulering gratis lim är avgörande som en minskning av området stimulering kan dramatiskt öka strömtäthet (A/m²). - Täcker alla skruvar med cyanoacrylic lim.
- Blanda två-komponent dental akryl cement i en liten kisel tube eller glas. Så snart det blir trögflytande, tillämpa den med en dental spatel att försegla återstående gränsar av uttaget på benet. Undvika eventuella flödet av dental akryl cement till området stimulering.
- Slutligen täcka hela skallen, skruvar, counter elektrodkabeln och uttaget upp till ⅓ av uttaget med dental akryl cement. Säkerställa att cementen har rätt viskositet: om alltför vätska, det kommer att flöda in i omgivande vävnad; om för hårt är det svårt att fördela det jämnt.
- När alla ben är täckt och cement är hårdgjord, ta bort de bulldog klämmorna; huden bör bara röra den bebyggda cementen så att suturering behövs ej. (Om första snittet var valt för lång och bindväv eller muskel syns, tillkommer en sutur som beskrivs i steg 3.12).
- Applicera ett lager av jod med en bomullstuss runt kanten av skära huden och subkutant injicerar karprofen (5 mg/kg kroppsvikt upplöst i 5-7,5 mL av 0,9% saltlösning för smärta behandling och vätska ersättare).
Obs: Om du använder inandning anestesi, stänga av nu. - Placera gnagare i en värmande låda för återhämtning från anestesi tills gnagare är vaken och postural stabilitet återupprättas.
Obs: Kontrollera djuret ' s viktutveckling, sår statligt och allmänt välbefinnande kriterier dagligen enligt institutionen ' rekommendation.
5. Transkraniell elektrisk stimulering förfarande
Obs: som anestesi påverkar tES effekter, utför stimulering i alert gnagare som möjligt rekommenderas. Tillåta gnagare att återvinna för minst 5 dagar (läkning av huvudet och bröstet såret) innan du startar experiment. Experiment kan utföras vid tidigare tidpunkter efter operation när du använder en extern disk elektrod fast med en väst, som bröstet såret är mest irriterad; men djur måste vara vana att elektroden västen i flera dagar och störningar med beteendemässiga uppgifter kan uppstå.
- Fylla uttaget tES elektrod hälften med 0,9% koksaltlösning och avlägsna luftbubblor.
- Varafore katodal TDC sessioner, alltid kontrollera klorering, och om det behövs (till exempel en glänsande silver yta), åter KLORERA Ag/Granulatfyllda elektroden. Innan anodal TDC sessioner, ta bort eventuella överskott Granulatfyllda insättningar från tidigare stimuli med sandpapper för att möjliggöra god ledningsförmåga vid stimulering. Skruv i skruvlocket tES elektrod ( figur 1B, grå pjäs).
FÖRSIKTIGHET: Åter KLORERA elektroden mellan katodal TDC sessioner kommer att leda till utmattning av klorering vid stimulering och giftiga uppbyggnad av elektrokemisk reaktion. Detta kommer att orsaka vävnadsskada. Re klorering behövs inte inom en enda session om stimulering längd är kortare än 20 min. - Anslut kablarna till de två kontakterna på huvudet (för anodal stimulering, anodal kabeln är ansluten till kontakten på skruvlocket, för katodal stimulering, är det motsatta).
Obs: När du använder ett externt placerade counter elektrod, täcka counter elektroden med ledande gel och plats på gnagare ' s byst. Det är lättast om elektroden är redan fast i en liten gnagare väst, som gnagare kan bära under stimulering. - Plats gnagare i experimentell buren, med kablar anslutna till en vridbar ovanför buren som tillåter fri rörelse.
- Aktivera stimulatorn och justera parametrarna stimulering (stimulering intensitet, varaktighet, ramp upp och ner tid).
- När du inte använder en kommersiellt tillgänglig stimulering enhet med säkerhet stänga och urkoppling larm, inkluderar en mätare i kretsen att kontrollera konstant strömflödet.
Obs: Med denna uppsättning, stimulering kan tillämpas under utförandet eller utbildning av beteendemässiga uppgifter. - Kontrollera för tecken på stress eller obehag av gnagare under stimulering.
- Efter slutet av stimulering, koppla bort kablarna, skruva av elektroden locket på huvudet, och rengör och torka uttaget med en bomullspinne. Återgå gnagare till hemmiljön eller fortsätta med en beteendevetenskaplig förfarande om så önskas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beskrivs genomförandet av en set-up för tillförlitlig upprepade tES i alert gnagare kan enkelt integreras i mekanistiska experiment, dos-respons studier eller experiment inklusive beteendemässiga uppgifter. Hittills har hindras jämförbarhet av data från djurstudier med (noninvasiv) tES av variabilityen av de tES stimulering uppställningar mellan laboratorier och skillnader i stimulering parametrar (t.ex. olika strömtätheter tillämpas på orimliga höga nivåer jämfört med programmet mänskliga). Informativa värdet av djurförsök inom tES är därför begränsad. Denna artikel presenterar en tES set-up som är lätt att standardisera i laboratorier genom att implementera placeringen av ”aktiv” elektroden på benet ovanför riktade cortex (här, ovanför den primära motoriska cortexen (M1)) med saltlösning som de föredra konduktiv medium och counter elektroden placeras på bröstet (externt eller implanteras).
Med tanke på små gnagare, kan placera elektroden ovanför riktade cortex på gnagares hud leda till överdriven växling, särskilt när kampen mot elektroden placeras i närheten, exempelvis i nacken (för exempel på nuvarande modellering Se figur 3 (antagen från referens1)). Dessutom den stabilitet och elektrod kontakten är mindre tillförlitliga och gnagare är mer irriterad av upprepad elektrodplacering i hårbotten när du använder en transdermal applikation. Fixering av en icke-permanent uppställning kan också hindra gnagare från att utföra fritt. Däremot justera gnagare snabbt att detta permanent närvarande implanterade upplägg.
Uppskattningen av en motsvarande stimulering intensitet jämfört med mänsklig stimulering parametrar är svårt, eftersom modeller kan endast ta hänsyn till ett begränsat antal faktorer och gnagare är pachygyric (se referens1 för uppskattning av en skalning faktor). Samla dos-responsdata inklusive låg intensitet strömmar kan därför mest informativa. Använda presenterade kirurgiska set-up i ett dos-respons-studie på sövda råttor, var dosberoende mikrogliala aktiveringen outlasting perioden stimulering (24 h efter stimulering) visats och syralöslig från neurodegeneration förekommer vid hög intensitet DCS (figur 4, antog från referens17). Mikrogliala aktivering, bedömas genom morfologisk förändring, uppstod först på 31,8 A/m² (figur 4 c), när de första tecknen på neurodegeneration upptäcktes på 47,8 A/m². I dessa experiment påverkas anestesi tydligt omfattningen av svar på DCS som procentandelen av hjärnan skivor med fluorojade C (FJC) positiva degenererade nervceller i alert råttor var högre vid 47,8 A/m² (figur 4A). Som tröskelvärde för ≥ 24 h varar mikrogliala aktiveringen ligger nära tröskelvärdet lesion, men kraftigt över de stödnivåer som främjar fysiologiska kognitiva och plast processer hos människan, sådan aktivering snarare tyda en pre-lesional inflammation induceras av DCS. Därav, beteendemässiga eller molekylära effekterna av DCS på dessa höga intensiteter förväntas vara slentrianmässigt olika jämfört med låg intensitet effekter (se systemet sammanfattar effekter och intensiteter av TDC experiment i figur 5).
Figur 1: leveranser för kirurgi och tekniska system tES socket och elektrod cap affärsenhet (A) 1. Bomullspinnar, 2. desinfektionsmedel, 3. stereotaktisk ram, 4. lödkolv, 5. smärtstillande (t.ex., karprofen), 6. & 7. narkosmedel (t.ex. xylazin & ketamin), 8. spruta, 9. Clipper, 10. öra Hålslag, 11. ögonsalva (t.ex., bepanthene), 12. blyfri tenn-lödtenn, 13. två-komponent dental akryl cement (DAC), 14. jod, 15. 3% H2O216. 0,9% koksaltlösning, 17. syntetiska flätad icke-resorberbar sutur (t ex, Mersilene 4-0), 18. borrkronor, 19. cyanoacrylic lim, 20. Bulldog klämmor 21. homeostatiska pincett, 22. peang böjd, tandad spets, 23. Pincett rak, skarp spets, 24. raka, vävnad pincett, 25. Dental spatel, 26. skalpell, 27. sax, 28. handborr, 29. skruvmejsel, 30. motor driven borr, 31. honkontakter, 32. tES socket, 33. fyrkantig platina elektroden kopplad till kabel, lödning gemensamt täckt med histoacrylic lim, 34. plastskruvar. (B) tES socket (röd) för fixering på gnagare skallen med en inre diameter på 4 mm. elektroden enheten (grå) är byggd av ett skruvlock och en inre stämpel med ett centrumhål som lämnar utrymme för kabeln av Ag/Cl skiva elektrod, som limmas mot botten av stämpeln. Detta möjliggör maximal stabilitet för set-up och undvikande av tråd raster på känsliga tråd-elektrod-kopplingspunkten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: råttor utrustad med tES set-up. Råtta till vänster är utrustad med en externt fast disk elektrod på rakat bröstet. Kol gummi elektroden är sydde till botten av västen. Råtta till höger har en implanterad bröstet elektrod med kabeln tunneldata till huvudet. Honkontakten fästs kabeln (kaudala) är fast inom dental akryl cement byggt enheten, bakom uttaget för tES elektroden (rostralt). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: modellering av nuvarande fördelning i två olika gnagare tES montage. Finita element modeller förutspår hjärnan strömflödet i två råtta modeller med epicranial TDC montage, modifierad med tillstånd1. Använda dessa modeller, förutspådde tröskel hjärnan strömtätheten att inducera kortikala lesioner var 17,0 A/m² för montage används av Fritsch, o.a. 8 (A) och 6.3 A/m² för montage av Rohan, o.a. 21 (B), motsvarande elektriska fält på 61, och 23 V/m, respektive. Observera skillnaderna i de nuvarande flöde mönstret av de två olika montage. (A) tillämpas en högre strömtäthet för en kortare tid, vilket resulterar i en lägre avgift densitet än i (B). Framför allt kanske placeringen av counter elektroden (nacken vs. bröstet) en extra effekt på resulterande hjärnan strömflödet. För tolkning av gnagare data därför specifikation av elektroden storlek, placering (båda elektroderna), tillämpas ström och stimulering varaktighet nödvändigt. Observera att den faktiska nuvarande inom råtthjärna endast kan beräknas med hjälp av dessa beräkningsmodeller. Färgskalan visar strömtäthet från noll till 11,6 A/m², och ovan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: dos responseffekter av DCS på mikroglia aktivering och nervcellsdöd i hjärnan skivor erhålls efter olika doser av anodal TDC tillämpas på primära motoriska cortex. Figuren är modifierad från17 sammanfattar immunohistological resultaten av en studie som dos-respons TDC. (A) förhållandet mellanmorfologiskt aktiverade mikroglia bedömas av anti-CD11b/c färgning (värdering se nedan) och neurodegeneration avslöjades av FJC positivitet. Rat motor kortikala hjärnan skivor bedömdes av en blindad utredare antingen som anti-CD11b/c och FJC färgning negativa, som anti-CD11b/c positiva bara (upptäcka aktiveringen fastställas morfologiskt) eller som både anti-CD11b/c och FJC positiva. Observera att mikrogliala aktivering föregås förekomsten av neurodegeneration. (B) representativa koronalt avsnitt av vänster motor kortikala hjärna skivor (på eller nära +1.56 mm från bregma) från honråttor som exponerats för olika intensiteter av anodal TDC tillämpas på primära motoriska cortex. Sövda råttor, inga tecken på neurodegeneration inträffade på 31,8 A/m², medan några degenererade nervceller var närvarande vid 47,8 A/m² och neuronala skador som ytterligare ökade med ökad dos. Av not, anodal DCS på 47,8 A/m² i alert råttor ökade andelen skivor med neurodegeneration. Skalstapeln för alla sektioner: 500 µm. förstoring inlopp skalstapeln för alla sektioner: 20 µm. (C) histologiska prov bilder av klassificeringen av mikroglia aktivering i anti-CD11b/c immunohistokemi, alltifrån 0 (inte aktiverad) till 4 (allvarligt aktiveras ), 1-4 klassades som ”positivt”. Skala barer = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: ordning illustrerar förhållandet av närvarande används gnagare TDC strömtätheter jämfört med programmet mänskliga: tröskelvärden för inflammation, neurodegeneration och modulering av fysiologiska processer vid stimulering löptider på upp till 30 min. För närvarande används gnagare DCS strömtätheter intervallet från 1,3 till 143 A/m² med majoriteten av studier med mer än 20 A/m², medan strömtätheter i majoriteten av studier på människa är mellan 0,3 och 0,8 A/m²1,14. Mänskliga stimulering parametrar är minst en storleksordning under tröskeln för neurodegeneration1. Tröskelvärdet för neurodegeneration är betydligt högre under anestesi, när kortikala upphetsning är undertryckta17. Bestående mikrogliala aktiveringen börjar under men nära de stödnivåer som förmå nervcellskador17. Utredning av modulerande inverkan på fysiologiska cerebrala processer vid högre intensitet under tröskeln lesion av DCS sannolikt skiljer sig från avhandlingar sett med mycket låg intensitet (jämförbar med mänskliga ansökan). Den exakta översättningen av stimulering parametrar mellan arter är under utredning. Uppskattningar hindras av passiva faktorer som storlek och anatomi (sulci och gyri), men också av möjliga olika känslighet för elektriska fält av nervceller, glia och nätverk mellan arter (det inte är känt om samma strömflödet skulle leda till samma fysiologisk effekt). Därför testar mest informativa studiedesign tES effekter i ett svar sätt, inklusive mycket låg nuvarande stödnivåer. Systemet är baserat på data från7,12,16,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 (maximal stimulering varaktighet 30 min per session, uppgifterna är från animaliska sjukdomsmodeller undantagna). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det här protokollet beskriver typiska material och förfarandeåtgärder för kirurgiska förverkligandet av en permanent tES set-up, liksom för efterföljande stimulering i alert gnagare. Under utarbetandet av en gnagare tES experimentera, flera metodologiska aspekter (säkerhet och tolerabilitet av tES, resultatet parameter) samt begreppsmässiga aspekter (jämförbarhet med människans villkor, förväntade effekter av stimulering på en viss hjärna region) behöver beaktas. Från en metodologisk synvinkel är den kirurgiska uppbyggnaden av kraniala tES uttaget med implanterade bröst counter elektroden fördelaktiga för longitudinella studier eftersom den tillåter för tillämpning i alert, fritt rörliga gnagare. Tillvänjning av gnagare till kabelanslutningar och permanent installation är nödvändig, men efteråt, det tillåter tES även i kombination med beteendeterapi uppgifter. Obehag av gnagare vid stimulering är dessutom sannolikt lägre med detta upplägg jämfört med bär en counter-elektrod som sys in i en väst, eftersom rörelser inte är begränsade i tidigare fall och vävnad kontakten av inopererade elektroden under stimulering är säkerställd.
Presenterade tES set-up har använts för experiment som varar upp till 3 månader, utan någon elektrod kabel diskontinuitet, materiella instabilitet eller infektion. Det är således troligt att set-up lämpar sig också för experiment längre än denna period.
Detta epicranial stimulering montage förhindrar överdriven växling via dermal strukturer, vilket sker sannolikt i större utsträckning i gnagare ges relationen mellan elektroden till kroppsstorlek (se figur 3 och referens1). Den implanterade set-up för epicranial stimulering i gnagare möjliggör hög funktionalitet för experiment i fritt rörliga djur, en tydlig definition av elektrod positioner, och nuvarande leveranssäkerhet. Medan dessa faktorer utgör stora fördelar för standardiseringen av experiment, bör avvikelsen till transdermalt stimulering i människor eller gnagare (t.ex. referenser32,33) hållas i åtanke. Men för översättning av resultat är den faktiska mängden nuvarande når hjärnan (hjärnan strömtäthet), oberoende av passagen genom olika vävnader, av större relevans34. Placering av counter elektroden bestämmer allmänt riktning och distribution av nuvarande flöde1. Således för polarisering av nervceller, kan en placering av counter elektroden på bröstet (dorsoventral riktningen av strömflödet) vara effektivare jämfört med placering i halsen (rostrocaudal riktningen av strömflödet).
Studier som avser de underliggande mekanismerna tES eller dess effekt på beteende bör när så är möjligt utföras i alert gnagare, eftersom anestesi betydligt samverkar med (patolo)-fysiologiska processer inklusive neuronal aktivitet35 ,36 och plasticitet36,37, och kan undertrycka eller ändra tES effekt17, (och våra opublicerade observationer) eller skada1,17. Tvärtom, tillåter erhållna resultat i sövda gnagare inte en direkt slutledning till alert villkoret, potentiellt hindra framåt översättning till forskning på människor. Ett exempel på skillnaderna av TDC tillämpas på motoriska cortex hos sövda råttor och alert råttor visas i avsnittet representativa resultat. TDC tillämpas på lika hög strömtäthet inducerade en större frekvens av mikroglia aktivering och neurodegeneration alert råttor jämfört sövda råttor17. Medan dessa fynd är en del av ett dos-respons-experiment inträffade som TDC effekter på mikroglia och neurodegeneration vid hög intensitet (rekommenderas inte för användning i mechanistical eller beteendemässiga studier), det är frestande att spekulera som på låga TDC nuvarande tätheter, samma avledning av resultat skulle uppstå beroende på vakenheten av gnagare.
Slutligen, en annan fördel med det medföljande protokollet är minskningen av möjliga felkällor. Felsökningsstrategier och kritiska steg har lyfts i protokollet. Dessa inkluderar val av lämpliga strömtäthet för viss forskning ändamål (som diskuteras ovan), behovet av förberedelse av tES elektroderna innan varje tillämpas stimulering, och grundligt och upprepade kontrollera för tillförlitlig konduktans. När det gäller elektrod förberedelse, klorering av elektroden innan katodal stimulering (dvs, katoden över kortikala målområdet) är helt avgörande eftersom konsumtion av klorering vid stimulering leder till giftiga uppbyggnad av elektrokemiska reaktioner och sekundärt orsaka vävnadsskada. Vår erfarenhet sker konsumtion av klorering inte inom de första 20 min av stimulering. Tvärtom, innan upprepade anodal stimulering, måste Ag/Cl nedfall vid anoden tas bort för att undvika utsättande av stimulering. Konduktans är en kritisk punkt, som inte endast avser till elektroden förberedelsen utan också till praktiska stimulering session gnagare, liksom kvaliteten på kirurgisk implantation av uttaget tES. Stängningen av tES uttaget till omgivande skalle och vävnad bör säkerställas under de kirurgiska ingrepp för korrekt uppskattning av strömtätheten. Rangering längs intilliggande vävnad leder till överskattning av den nuvarande tillämpas på hjärnan å ena sidan, och kan förändra fysiologiska resultat baserat på snedvridning av nuvarande flödesriktningen. Å andra sidan, reduktion av stimulering området — antingen genom Ag/Cl nedfall (se ovan) eller genom täckning av området stimulering under tES socket implantation (t.ex. av akryl cement eller histoacrylic lim) — kan leda till underskattning av den tillämpade strömtäthet och stimulering via en minskad område kan leda till vävnadsskada genom oavsiktligt hög topp strömtätheter. Slutligen, det ledande mediet, t.ex., koksaltlösning, behöver fördelas optimalt över området stimulering för att möjliggöra fortsatt stimulering. Under ett pågående experiment, förändrad konduktans kan bli synlig som följande: oväntat beteende av gnagare (tecken på stress, variabel prestanda på en viss aktivitet), variationer i aktuella leveransen visas på en ampere-mätare av den elektriska krets eller fullständig förlust av stimulering kontinuitet. I det här fallet elektroderna bör rengöras från nedfall och området stimulering bör inspekteras igen för något skräp. Kabelanslutningar, placering av tES elektrod i respektive uttaget och det ledande mediet kontrolleras och bytas ut när visas dysfunktionella. Om tES leverans var inkonsekvent, kan de erhållna uppgifterna (t.ex. beteende, histologi) av denna särskilda session behöva undantas från analys.
Tröskeln för neurodegeneration bestäms i alert råttor (vår opublicerade data) av både katodal och anodal sessioner är säker och väl tolereras i alert gnagare, när du använder upp till 20 min av kontinuerlig stimulering på stödnivåer nedanför 31,8 A/m² (motsvarande 0,4 mA med en 4 mm diameter transkraniell elektrod), och då följa de rekommendationer som beskrivs i detta protokoll. Dock väljer lägre intensiteter närmare till mänskliga stimulering parametrar (0,3-1,6 A/m²) eller helst dos-ansvaSe experiment rekommenderas att maximera informativ karaktär av de erhållna uppgifterna och underlätta framåt översättning av resultaten till användning på människa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av den tyska forskningsfondens (DFG RE 2740/3-1). Vi tackar Frank Huethe och Thomas Günther för egen tillverkning av skräddarsydda tES set-up och DC-stimulator.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softasept N | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland |
3887138 | antiseptic agent |
| Ethanol 70 % | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland | T913.1 | |
| arched tip forceps | FST Fine science tools, Heidelberg, Deutschland | 11071-10 | |
| Iris Forceps, 10cm, Straight, Serrated | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 15914 | |
| Scalpel Handle #3, 13cm | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 500236 | |
| Standard Scalpel Blade #10 | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 500239 | |
| Zelletten cellulose swabs | Lohmann und Rauscher, Neuwied, Deutschland | 13349 | 5 x 4 cm |
| Isoflurane | AbbVie Deutschland GmbH & Co | N01AB06 | |
| Iris Scissors, 11.5cm, Straight | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 501758 | small scissors |
| cotton swab/cotton buds | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland | EH12.1 | Rotilabo |
| Kelly Hemostatic Forceps, 14cm, Straight | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 501241 | surgical clamp |
| electrode plate (platinum) | custom made | Wissenschaftliche Werkstatt Neurozentrum Uniklinik Freiburg, Deutschland | 10x6 mm, 0.15 mm thickness |
| insulated copper strands (~1 mm diameter) | Reichelt elektronik GmbH & Co. KG, Sande, Germany | LITZE BL | electrode cable |
| Weller EC 2002 M soldering station | Weller Tools GmbH, Besigheim, Germany | EC2002M1D | |
| Iso-Core EL 0,5 mm | FELDER GMBH Löttechnik, Oberhausen, Deutschland | 20970510 | lead free solder |
| MERSILENE Polyester Fiber Suture | Johnson & Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany | R871H | nonabsorbable braided suture, 4-0 |
| Histoacryl | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland |
9381104 | cyanoacrylate |
| Ketamin 10% | Medistar GmbH, Germany | n/a | anesthetics |
| Rompun 2% (Xylazine) | Bayer GmbH, Germany | n/a | anesthetics |
References
- Bikson, M., et al. Safety of Transcranial Direct Current Stimulation: Evidence Based Update 2016. Brain Stimul. 9 (5), 641-661 (2016).
- Bindman, L. J., Lippold, O. C., Redfearn, J. W. The action of brief polarizing currents on the cerebral cortex of the rat (1) during current flow and (2) in the production of long-lasting after-effects. J Physiol. 172, 369-382 (1964).
- Gartside, I. B. Mechanisms of sustained increases of firing rate of neurones in the rat cerebral cortex after polarization: role of protein synthesis. Nature. 220 (5165), 382-383 (1968).
- Purpura, D. P., McMurtry, J. G. Intracellular activities and potential changes during polarization of motor cortex. Neurophysiol. 28 (1), 166-185 (1965).
- Nitsche, M., Paulus, W. Excitability changes induced in the human motor cortex by weak transcranial direct current stimulation. J Physiol. 527 (Pt 3), 633-639 (2000).
- Nitsche, M. A., Paulus, W. Sustained excitability elevations induced by transcranial DC motor cortex stimulation in humans. Neurology. 57 (10), 1899-1901 (2001).
- Cambiaghi, M., et al. Brain transcranial direct current stimulation modulates motor excitability in mice. Eur J Neuro. 31 (4), 704-709 (2010).
- Fritsch, B., et al. Direct current stimulation promotes BDNF-dependent synaptic plasticity: potential implications for motor learning. Neuron. 66 (2), 198-204 (2010).
- Ranieri, F., et al. Modulation of LTP at rat hippocampal CA3-CA1 synapses by direct current stimulation. J Neurophysiol. 107 (7), 1868-1880 (2012).
- Kronberg, G., Bridi, M., Abel, T., Bikson, M., Parra, L. C. Direct Current Stimulation Modulates LTP and LTD: Activity Dependence and Dendritic Effects. Brain Stimul. 10 (November), 51-58 (2016).
- Sun, Y., et al. Direct current stimulation induces mGluR5-dependent neocortical plasticity. Ann Neurol. 80 (2), 233-246 (2016).
- Podda, M. V., et al. Anodal transcranial direct current stimulation boosts synaptic plasticity and memory in mice via epigenetic regulation of Bdnf expression. Sci Rep. 6, 22180 (2016).
- Reis, J., Fritsch, B. Modulation of motor performance and motor learning by transcranial direct current stimulation. Curr opin Neurology. 24 (6), 590-596 (2011).
- Buch, E. R., et al. Effects of tDCS on motor learning and memory formation a consensus and critical position paper. Clin Neurophysiol. 128 (4), 589-603 (2017).
- Reis, J., Fischer, J. T., Prichard, G., Weiller, C., Cohen, L. G., Fritsch, B. Time- but not sleep-dependent consolidation of tDCS-enhanced visuomotor skills. Cerebral cortex. 25 (1), 109-117 (2015).
- Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Comm. 7, 11100 (2016).
- Gellner, A. -K., Reis, J., Fritsch, B. Glia: A Neglected Player in Non-invasive Direct Current Brain Stimulation. Front Cell Neurosci. 10, 188 (2016).
- Takano, Y., Yokawa, T., Masuda, A., Niimi, J., Tanaka, S., Hironaka, N. A rat model for measuring the effectiveness of transcranial direct current stimulation using fMRI. Neurosci Lett. 491 (1), 40-43 (2011).
- Islam, N., Moriwaki, A., Hattori, Y., Hori, Y. Anodal polarization induces protein kinase C gamma (PKC gamma)-like immunoreactivity in the rat cerebral cortex. Neurosci Res. 21, 169-172 (1994).
- Islam, N., Aftabuddin, M., Moriwaki, A., Hattori, Y., Hori, Y. Increase in the calcium level following anodal polarization in the rat brain. Brain Res. 684 (2), 206-208 (1995).
- Rohan, J. G., Carhuatanta, K. A., McInturf, S. M., Miklasevich, M. K., Jankord, R. Modulating Hippocampal Plasticity with In Vivo Brain Stimulation. J Neurosci. 35 (37), 12824-12832 (2015).
- Wachter, D., et al. Transcranial direct current stimulation induces polarity-specific changes of cortical blood perfusion in the rat. Exp Neurol. 227 (2), 322-327 (2011).
- Koo, H., et al. After-effects of anodal transcranial direct current stimulation on the excitability of the motor cortex in rats. Rest Neurol Neurosci. 34 (5), 859-868 (2016).
- Liebetanz, D., et al. After-effects of transcranial direct current stimulation (tDCS) on cortical spreading depression. Neurosci Lett. 398 (1-2), 85-90 (2006).
- Fregni, F., et al. Effects of transcranial direct current stimulation coupled with repetitive electrical stimulation on cortical spreading depression. Exp Neurol. 204 (1), 462-466 (2007).
- Cambiaghi, M., et al. Flash visual evoked potentials in mice can be modulated by transcranial direct current stimulation. Neurosci. 185, 161-165 (2011).
- Dockery, C. A., Liebetanz, D., Birbaumer, N., Malinowska, M., Wesierska, M. J. Cumulative benefits of frontal transcranial direct current stimulation on visuospatial working memory training and skill learning in rats. Neurobiol Learn Mem. 96 (3), 452-460 (2011).
- Faraji, J., Gomez-Palacio-Schjetnan, A., Luczak, A., Metz, G. A. Beyond the silence: Bilateral somatosensory stimulation enhances skilled movement quality and neural density in intact behaving rats. Behav Brain Res. 253, 78-89 (2013).
- Pikhovych, A., et al. Transcranial Direct Current Stimulation Modulates Neurogenesis and Microglia Activation in the Mouse Brain. Stem Cells In. , 1-10 (2016).
- Rueger, M. A., et al. Multi-session transcranial direct current stimulation (tDCS) elicits inflammatory and regenerative processes in the rat brain. PloS one. 7 (8), e43776 (2012).
- Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats. Clinical Neurophysiol. 120 (6), 1161-1167 (2009).
- Yoon, K. J., Oh, B. -M., Kim, D. -Y. Functional improvement and neuroplastic effects of anodal transcranial direct current stimulation (tDCS) delivered 1 day vs. 1 week after cerebral ischemia in rats. Brain Res. 1452, 61-72 (2012).
- Spezia Adachi, L. N., et al. Exogenously induced brain activation regulates neuronal activity by top-down modulation: conceptualized model for electrical brain stimulation. Exp Brain Res. 233 (5), 1377-1389 (2015).
- Jackson, M. P., et al. Safety parameter considerations of anodal transcranial Direct Current Stimulation in rats. Brain, behavior, and immunity. , (2017).
- Ordek, G., Groth, J. D., Sahin, M. Differential effects of ketamine/xylazine anesthesia on the cerebral and cerebellar cortical activities in the rat. J Neurophysiol. 109 (5), 1435-1443 (2013).
- Sykes, M., et al. Differences in Motor Evoked Potentials Induced in Rats by Transcranial Magnetic Stimulation under Two Separate Anesthetics: Implications for Plasticity Studies. Front Neural Circ. 10, 80 (2016).
- Zhang, D. X., Levy, W. B. Ketamine blocks the induction of LTP at the lateral entorhinal cortex-dentate gyrus synapses. Brain Res. 593 (1), 124-127 (1992).
