Summary
ここでレーザー血流イメージング (LDPI) の組み合わせを提案して、脊髄を導入するための標準化された手順だけでなく、局所血流と酸素飽和度 (その2) をコード レーザー血流モニタリング脊髄を測定する (LDPM)ラットの外傷。
Abstract
レーザードップラー (LDF) は、脊髄の微小循環の変化を測定することをお勧めになる血流量 (BF) 測定の非侵襲的方法です。この記事では、私たちの目標は、レーザー ドップラー イメージングと監視の両方を使用して、脊髄損傷後の BF の変化を分析するでした。各読み出しを取得するレーザー ドップラー画像スキャナーとプローブ/モニターの両方を採用されていた。LDPI のデータは、BF、損傷部位の周囲の血流の概要を与えた、アクセシブルに BF の異なる場所の間での比較分析のためのローカルの配布を提供します。期間にわたって測定プローブ領域ない激しくすることにより複合プローブは全体的な脊髄の血流と酸素供給を示す脊髄の BF と酸素飽和度を同時に測定していました。自体 LDF の動きに対する感度と生物ゼロ信号相対磁束などのいくつかの制限があります。しかし、技術は、単純なセットアップと BF の迅速測定法による臨床的および実験的研究で適用されています。
Introduction
脊髄の組織は、高度に血管や脊髄損傷 (SCI) による低酸素に非常に敏感です。私たちの以前の研究は、脊髄の血流は脳震盪傷害1,2, 運動機能の欠損に関連する可能性があります後低下したことを示した。最近の研究は、SCI に続く血管の整合性が感覚運動機能3の改善と相関関係にあることを示しています。それは、改良された血管が直接ない機能の改善4につながる白質を救助可能性があります報告されています。したがって、受傷後の脊髄灌流の維持の重要性と機能を維持するために登場。
SCI5,6、7の実験モデルでさまざまな技術を使用して多くの研究者によって様々 な処理 SCI 後血流に及ぼす影響を調べました。レーザーのドップラー、十分に確立された技術として、いくつかの動物と人間の研究8,9,10,11の灌流を定量化するための有用な方法は間違いなくだった。技術は、照明の光に赤色の血液細胞の移動によるドップラー シフト12の測定に基づいています。1980 年代初頭の技術の実用化、以来、レーザー ドップラー計測器13LDF に信頼性の高い技術にしたレーザー技術、光ファイバーと血流の測定用信号処理で大きな進歩しました。
現在の研究では、レーザー ドップラー計測の両方のメソッドは震とう性のラットの脊髄で血流 (BF) を評価するために適用されました。技術で、簡単にセットアップの非侵襲的性質では、我々 のプロトコルは、脊髄の BF 測定高感度、迅速かつ信頼性の高い方法を提供します。もっと重要なは、このメソッドでは、各時点での動物の犠牲のない BF ポスト震とう性科学に関する縦断的研究ができます。
能力が組織の BF と刺激の間に血流の急激な変化を評価するため、測定肝16,などの他の組織と同様、脳 BF14,15を評価するこのプロトコルを適用することが可能です。17、肌18,19、および腸20。ラット一過性中大脳動脈閉塞モデル、レーザーのドップラー測定値が虚血性ペナンブラ14に期待されているレベルに BF 率の適切な削減を確保するため使用されました。肢虚血 (CLI) 誘導を受けたラット、レーザーのドップラー スキャン前に CLI 処理後と治療21後さまざまな期間中に後肢 BF を観察する適用しました。また、バイオアベイラビリティといくつかの薬物の代謝クリアランスは、LDF16によって検出された肝 BF に依存。したがって、LDF は実験モデル、薬力学及び薬物動態学的評価で広く使用できます。
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Protocol
実験動物を含む動物のプロトコルは健康国立研究所 (NIH) によって確立されたガイドラインに従い、動物のケアと使用首都医科大学委員会によって承認されました。
科学を導入し、レーザー以下ドプラ装置による脊髄の BF を測定の手順は、発行された研究1で使用されました。
1. 手術の準備
- 生理食塩水でペントバルビ タール ナトリウム ソリューション 3% (w/v) を準備し、35 mg/kg の投与量で管理します。
注意: ペントバルビ タール ナトリウムは管理された物質です。詳細な記録を保持する必要があります、ソリューションは安全なロックされた場所に保存されます。 - 装置を殺菌し、切開部を準備します。
- 次の手順と手術装置きれい: クリーニング、30 分のための 121 ° c のオートクレーブは、一晩 60 ° C のオーブンで乾燥し、75% エタノール。75% アルコールで切開部を消毒します。
2. ラットの手術のための準備
- ペントバルビ タール ナトリウム 35 mg/kg の腹腔内注入ラットを麻酔します。全体の手順は、30-40 分の手術、BF 測定、縫合糸などを取る必要があります。
- 首に腰からラット背側部を剃る。髪の毛は、できるだけ短くカットする必要があります。一定の体温を維持するためにパッドを加熱 40 ° C にラットを配置します。
3. 椎弓切除術および脊髄に脳震盪
注: 偽のグループに対してのみ、椎弓切除術を実行、3.1 から 3.6 の手順に従います。
- 動物の背側を配置します。75% アルコール滅菌綿球を使用して続いてヨウ素と剃毛の一部を殺菌します。メスで皮膚切開 (4 cm) をカバー T7、t11 胸椎椎弓切除術サイトに譲る。
- ラミナ、棘突起、椎間関節を公開する T10 に両側 T8 から接続されている筋肉をカットします。
- メスを使用して、T10、T11 間の接合部を切断の切開を行います。さらに骨をさらしたに筋層を切り裂くと、慎重にによる接合を公開します。
- 板から、小さなはさみで茎の周りの筋肉をさらにクリアにはさみを使用します。これは T10 で脊椎と T11 の間の小さなスペースを開きます (図 1 a)。ゆっくりと繊細なこのギャップに 1 つ止血鉗子を挿入し、椎弓根 (図 1 b) を破る。鉗子の曲率は、常にコードから離れて、横方向、配置されることを確認します。反対側に繰り返します。
- 脊髄 (図 1) を公開し慎重に持ち上げ、板を断ちます。任意の無料やギザギザの骨片を残ししないようにします。
- さらに T9 と T8 のラミナを削除する手順を繰り返します。
- インパクター装置テーブルに動物を移動、T7、T11 の棘突起に動物の背骨を安定させるためにテーブルにアタッチ アドソン鑷子のペアを使用し、(図 1) の背骨をまっすぐに鉗子を調整します。
- インパクターの下で動物を入れて露出脊髄の中心にストライキ ロッドを目指して、脊髄の表面の 3-5 mm 以内にロッドを下げます。
- 衝撃力などの影響を与えるパラメーターを設定 (160 KD) と滞留時間 (1 秒)
- SCI を誘発するソフトウェア インターフェイスで「実験を開始」ボタンをクリックしてして自動的影響を開始する次のインタ フェースで「はい」をクリックします。影響の後ソフトウェアが設定されているパラメーターの横にある影響の実際のデータを表示、設定点 (図 1E) のすぐ近くだったことを確認するデータを確認してください。
注: 実験の成功のための典型的な記号は影響の後不随意テール スイングを手足の動きの短い期間をだった。刺激尾肢反射をチェックすることができるも。しかし、通奏低音、ビーティー、ブレスナハン (BBB) の運動スケール22,23など歩行の評価は引き起こされた損傷の効果を判断する必要。
- SCI を誘発するソフトウェア インターフェイスで「実験を開始」ボタンをクリックしてして自動的影響を開始する次のインタ フェースで「はい」をクリックします。影響の後ソフトウェアが設定されているパラメーターの横にある影響の実際のデータを表示、設定点 (図 1E) のすぐ近くだったことを確認するデータを確認してください。
4. レーザー ドップラー スキャン
- 本研究で使用されるレーザーのドップラー スキャナーの詳細については、材料の表を参照してください。公開されている脊髄をスキャンするには、非反射、黒い背景の上ラット背側に置きます。
- パラメーターをスキャンの設定:スキャン ソフトウェアを開き、「メジャー」スキャナー セットアップ インターフェイスを開く「スキャナーの設定」ボタンをクリックして測定グラフィカル ユーザー インターフェイスを入力する] をクリックします。この実験のようにこのような小さな領域をスキャンする「高解像度」」スキャン サイズとの表示オプション「罰金スキャン モードの下で高い解像度 (256 × 256 ポイント 4 × 10 cm2をカバー) を選択 (図 2 a)。スキャンの境界 (図 2 b) を確認する「イメージをスキャン」オプションをクリックします。
- ライブのビデオ画像をチェックする「ビデオと距離」オプションをクリックしてします。スキャナーの位置外科ウィンドウとセンター スキャン] ウィンドウ (図 2) で公開されている脊髄への動物と背景の上 10-13 cm。
- "Auto 遠い"関数を使用して、問題なくスキャンの高さを調整、図 2の実験ではすべての測定値間一貫したスキャンの高さは保持する必要がありますに注意してください。
- ウィンドウと無反射カバーを使用して、さらにバック グラウンドを最小限にし、動物の方向を示す外科領域のみを公開します。
- 「繰り返しスキャン」をクリックして、スキャン (この場合使用 8 繰り返しスキャン) の数を設定、繰り返しスキャン インターフェイスを開くには"OK"をクリックします。スキャンを開始するスタート ボタンをクリックし、全体のプロセスは約 3 〜 4 分 (図 2 D) になります。
5. レーザー ドップラー監視
- 時間をかけてモニター BF という2 VP3 鈍針 end 配信プローブとスキャナー モニターを使用しました。監視装置を設定する脳定位固定装置に垂直レーザー ドップラー プローブを接続します。
- 脳定位固定装置背側ラットを入れ、アンダーレイの露出の脊髄を平準化する必要があるときは発泡スチロールの小片を持つ動物。
- BF のモニターに脊髄にプローブを下げます。
注: ステップ 5.3 データ測定プローブに適用される圧力に敏感であるので測定の再現性に重大である、それ故に余分な注意が必要にない以上- または下の位置をプローブします。- 切開部を確認し、余分な液体や血滅菌綿のパッドを使用して削除します。
- 装置の X および Y 軸を使用して 2 mm 露出脊髄の中心点に吻側にプローブを見つけるまたは病変ポイントし中心静脈を避けます。
- Z 軸を使用して、脊髄の表面に触れるだけのレベルにプローブをゆっくりと下ろします。プローブだけないので緩やかなに接触点の側から脱出する明るい光を許可するが、脊髄の表面に触れる必要があります。
-
データ記録
- データ集録ソフトウェアを開き、セットアップのインターフェイスを開く「新しい実験」ボタンをクリックします。「一般」の選択の下でシステム構成の確認しクリックして「次へ」(図 3 a)、ディスプレイの設定で BF のためのチャネルを選択します。 その2とクリック"次へ"(図 3 b)。
- ファイルの情報を入力、データ記録インターフェイスを入力、プローブ (図 3 D) からデータの記録を開始する緑の三角形のボタンをクリックして「次へ」(図 3) をクリックします。
- 信号が 8 連続分、安定したレコードのデータです。その後、プローブを持ち上げて、切開部を縫合し、手術後のケアに動物を入れて脳定位固定装置から動物を取り外します。
6. 縫合糸と術後ケア
- 切開部を縫合: 切開の両側に筋に縫合針を挿入します。組織を一緒に引っ張り、それにより削除されたラミナのサイトで公開されている脊髄をカバー、糸を引き出します。ニードル ホルダーを使用して、フォームを介して全体のスレッド 3 スクエア ノットをプルし、できるだけノットに近いスレッドをトリムします。
- 切開、縫合と同じ方法で 3-4 スクエア ノットと皮膚を縫合し、結び目からスレッド約 1 cm をトリムします。
- 場所そのケージの側ラット手術サイトとおりの底の間の接触を避けます。ケージは、パッドを加熱に配置する必要があります。
- 手術後の出血を防ぐために麻酔から覚めるし、縫合糸が閉じたまままで、動物を監視します。
- 手術、120 mg/kg/日の 3 日後までラットのベンジル ペニシリン ナトリウムを皮下注入します。腹腔内手術およびすべて 6 時間後に手術後すぐに 1 日ブプレノルフィン (0.05 mg/kg) を挿入します。
- 動物に十分な食料と水へのアクセスがあることを確認するために、拡張噴出水のボトルに合うし、檻の中に動物に近い食べ物を置きます。
注: 我々 は動物が誘導損傷によって麻痺したように BBB スコア 0、上記の動物を除外するのには、動物の 24 h の受傷後の後肢の運動機能を評価する評価尺度を BBB を行われます。 - 手術の後、必要ならば軽く 1 日 2 回、腹部にその圧力を適用することによって膀胱の空でマニュアルを提供します。
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Representative Results
LDPI は、直線プロファイル (図 4) を抽出することによって脊髄の尾側吻側軸に沿って定量化された脊髄の BF を測定に使用されました。図 5 aと図 5 bは、偽のグループおよび SCI グループの脊髄の磁束イメージングをそれぞれ表します。図 5と図 5は、偽のグループおよび SCI グループの脊髄の尾側吻側軸に沿って変更 BF をそれぞれ表します。図 5 aと図 5 bの比較実証科学が BF の減少を誘発、震源の BF だったコードの吻側と尾側コードよりも低かった。
LDPM 時間領域 LD 信号を示しだから2と図 6図を取得し、LDPM データの処理。データが記録された後の継続的な関心領域 (ROI) データ 8 分ストレッチ選ばれたこれは、組み込みフィルターによってフィルターされた非生体信号を最小限に抑えること。その後、投資収益率を統計的に調べた、raw データ形式でエクスポートされた結果。図 7は、BF の周期的な変化を記録したと偽のグループおよび SCI グループで時間をかけてその2 。図 7Aのように、有意に減少した SCI グループの脊髄 BF は sham 群と比較。同時に、脊髄のなど2は傷害の後 BF の変化と一致している (図 7 b) 脊髄脳震盪後は著しく低かった。障害を減らすためには、測定を繰り返し撮影され、データが正規化されました。
図 1。椎弓切除術、脊椎に脳震盪。(A)は、T10、T11 間の接合部を外します。(B)は、茎を破るに鉗子を挿入します。(C)は板を破るし、脊髄を公開します。(解剖学の模式図)(D)は、実験テーブルに脊椎を安定させます。(E)初期影響ソフトウェアとチェック データを使用します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。一歩一歩レーザースキャニング ドップラーのためのセットアップします。(A)をスキャンするための一般的なセットアップ。(B)画像のスキャン パラメーターのインターフェイスを設定します。(C)は、ビデオと距離のインタ フェースを設定します。(D)は、繰り返しスキャンするためのインターフェイスを設定します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。レーザーのドップラー監視のセットアップのステップバイ ステップです。(A)は、新しい実験を開始します。(B)は、チャンネルの表示を選択します。(C)は、件名の詳細を入力します。(D)はデータ記録を開始します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。レーザー血流画像化します。(A) 8 連続スキャン偽のグループのラットをスキャンすることによって派生します。(B)連続スキャンの平均像。(C, D)地域の利益率 (ROI) は背骨の中心軸に沿って強度プロファイルを抽出する赤外線イメージに基づいて選ばれました。インセット ボックスには、投資収益率のプロファイル結果が表示されます。カラー バーを示した潅流単位レーザー ドップラー スキャナー下限値を表す青、赤が最高値を表します。楽器は、血流、すなわち「フラックス」相対値を検出しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。脊髄の BF がレーザー血流イメージングを用いた検出されました。(A, B)5 mm の投資収益率は、吻側から尾側の脊髄背骨の軸に沿ってフラックス地図に描かれました。(C, D)脊髄軸の中心線に沿って各 ROI の強度プロファイルは、定量化のため抽出しました。
図 6。レーザー血流を監視するプロセス。(A)時間マーカーが出発点を示された生データを記録。(B)各種 8 分投資収益率です。(C)選択したデータが内蔵フィルターによってフィルター処理。(D) の投資収益率の統計解析。(E) raw データのエクスポート。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7。脊髄灌流を行ったレーザー血流を監視します。(A) A 15 の偽のグループから SCI グループ生血液流量出力のサンプルです。(B) A 15 の偽のグループから SCI グループ生酸素飽和出力のサンプルです。レーザーのドップラー プローブの位置が中間点に吻方 2 mm、中心静脈の右側に脊髄の表面上だけのレベル。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
いくつかの詳細は、このプロトコルを実行するときに気づいたする必要があります。まず、麻酔や手術のプロセス実施されなければならない限り迅速かつエレガントな動物に導入されたストレスを最小限に抑えるため可能な限り。結果への影響を減らすためには、比較的平和で安定した状態で動物を飼います。第二に、血が読み取りを妨げている可能性があるのでレーザー ドップラー装置を用いた測定時の出血にもっと注意を支払われる必要があります。最後に、データ記録中に動物が温度分散による一貫性のない結果を避けるために温度制御された環境で保管する必要があります。
研究者がレーザーのドップラー スキャンを使用するときに考慮すべきいくつかの重要な要因があります。プロトコルに記載され、スキャンの距離は同等の結果を実験で一貫して保管すべき。小領域の高解像度の BF の信頼性の高いデータを生成する複数のスキャンとお勧めします。さらに、滅菌ガーゼだけ背景をさらに減らすために背骨を公開する小さなウィンドウで外科領域をカバーする動物のマークの方向に置くことをお勧めします。
プローブ位置決めは、適応と監視プロトコルの実装で重要な考慮事項です。プローブは測定面に垂直にする必要があります、過度の圧力を避けるべき。この目標を達成するためにラット背骨がまっすぐし、必要な場合は発泡スチロールで基本的な動物によって破壊された装置を使用してプローブを配置する必要があり、座標を確認して測定を行うことは、大体同じエリアから取得されます。
私たちの以前の記事1で説明したようにこの技術は、絶対流れと運動成果物24に感度校正の障害などいくつかの制限があります。もう一つよく気づいた制限ゼロの信号-信号なし BF25,26の存在は、生物は。結果にこれらの制限の影響を最小限に抑えるために測定を繰り返し撮影する必要があります、正規化が妨害を減らすために推奨されます。
BF 測定用放射性微粒子法とドップラー超音波法などその他の技術を開発されています。ただし、前者はリアルタイムで放射性物質を血液中に注入する必要がありますので組織測定27の摘出する必要があります。コントラストの技術として強化超音波イメージング、LDF のような非侵襲的、造影剤 (マイクロバブル) を静脈内注射する必要があります、頸静脈または大腿静脈のカテーテルは一貫性のある気泡注入に必要です28します。 これらの手法と比較して、LDF は非侵襲的組織の微小循環のフラックスの測定が可能。
LDF 信号は時間と周波数の両方のさまざまな機能から成っています。これらの機能をキャプチャするには、ウェーブレット解析とフーリエ解析の方法は定期的な周波数変動29,30を明らかに適用されています。これらの振動は、心打つ、呼吸の影響、血管平滑筋の筋活動を組み込み、血管壁の内皮細胞関連代謝活動31,32神経因性の活動を明示しました。基礎研究の臨床応用、LDF は、のみ、BF の信号を得ることができないが、また微小血管の BF の評価の微小血管障害より一般的には、病原性を調査するプラットフォームを提供血管の病気。
現在の研究では、LDF の両方のメソッドは、脊髄で BF を評価に適用しました。LDPI のデータは、周辺灌流の概要を与え、別の場所で BF の比較分析を実行を可能にした BF の地理的分布を提供します。時間をかけて計測プローブ領域ない激しく、LD の監視によって得られたデータ提供エリアに BF のより深い理解を得るために、ウェーブレット解析スペクトルなどの詳細な分析ができ、局所の血流の詳細な説明、有望な未来の研究のトピックであります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者の謝辞があります。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser Doppler Line Scanner | Moor Instruments | moorLDLS2 | |
| Laser Doppler Monitor | Moor Instruments | moorVMS-LDF | |
| Probe for Monitor | Moor Instruments | VP3 | Blunt needle end delivery probe |
| Impactor | Precision Systems and Instrumentation | IH-0400 | |
| Phenobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Buprenorphine | Sigma-Aldrich | B-908 | |
| Syringe | Becton Dickinson Medica (s) Pte.Ltd | 300841 | |
| Surgical suture needles with thread | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd | 18T0329 (batch number) /4-0 | |
| Scalpel | Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd. | J11030 4# | |
| Scalpel blade | Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd. | J12130 20# | |
| Ophthalmic forceps | Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd. | JD1040 | |
| Hemostatic forceps | Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd. | J31050 | |
| Benzyl penicillin sodium | North China Pharmaceutical Co., Ltd | F6072116 (batch number) | |
| 75% alcohol | Dezhou Anjie Gaoke disinfection products Co., Ltd | 150421R (batch number) | |
| Iodine | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd | 20170102 (batch number) | |
| Rat | Laboratory Animal Center, The Academy of Millitery Medical Sciences | Sprague-Dawly (rat strain) |
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