Summary
On présente une méthode d’analyse par spectrométrie de masse de peptides endogènes dans le liquide céphalorachidien (LCR) humain. En utilisant la filtration de limite de poids moléculaire, fractionnement chromatographique de pré, analyse par spectrométrie de masse et une combinaison subséquente des stratégies d’identification de peptide, il était possible d’étendre la peptidome CSF connu presque décuplé par rapport à des études antérieures.
Abstract
Ce protocole décrit une méthode mise au point pour identifier les peptides endogènes dans le liquide céphalorachidien (LCR) humain. Pour ce faire, une méthode déjà élaborée basée sur la filtration de coupure (MWCO) de poids moléculaire et analyse par spectrométrie de masse a été combinée avec une étape de pré fractionnement HPLC hors ligne pH élevé en phase inverse.
Sécrétion dans le CSF est la principale voie d’élimination des molécules répandu par les cellules du système nerveux central. Ainsi, de nombreux processus dans le système nerveux central sont consignées dans le LCR, en rendant un précieux fluide diagnostique. CSF a une composition complexe, contenant des protéines qui couvrent une gamme de concentrations de 8-9 ordres de grandeur. En plus des protéines, des études antérieures ont également démontré la présence d’un grand nombre de peptides endogènes. Tandis que les moins étudiés que les protéines, elles conserveront également susceptibles d’intéresser comme biomarqueurs.
Les peptides endogènes ont été séparés de la teneur en protéines par le biais de filtration MWCO CSF. En supprimant la majorité de la teneur en protéines de l’échantillon, il est possible d’augmenter le volume de l’échantillon étudié et ainsi le montant total des peptides endogènes. La complexité du mélange peptide filtrée a été adressée en incluant une phase inverse étape avant fractionnement (CLHP) à pH alcalin avant l’analyse de LC-MS. Le fractionnement a été combiné avec un schéma simple concaténation où 60 fractions ont été regroupées en 12, consommation de temps d’analyse pourrait ainsi être réduite en évitant encore largement élution Co.
Peptide automatisé identification a été réalisée à l’aide de trois programmes de logiciel d’identification différents peptides/protéines et ensuite combiner les résultats. Les différents programmes sont complémentaires et non comparable avec moins de 15 % des identifications avec chevauchement entre les trois.
Introduction
Biomarqueurs dans le liquide céphalorachidien (LCR) transforment actuellement recherche dans les maladies neurodégénératives. Dans la maladie d’Alzheimer, la maladie neurodégénérative plus commune, affectant plus 60 millions de personnes dans le monde1,2, un triplet de biomarqueurs de la bêta-amyloïde de peptide, stabilisation des microtubules protéine tau et un phosphorylée forme tau, capable de détecter la maladie avec une spécificité et une sensibilité élevée et a été inclus dans les critères de recherche diagnostique3. Dans d’autres maladies neurodégénératives, telles que la maladie de Parkinson et la sclérose en plaques, des études protéomiques ont identifié de nombreux candidats de biomarqueurs, dont certains sont actuellement en cours d’évaluation dans les études cliniques4,5 ,6.
Aux côtés de protéines, CSF contient également une abondance de peptides endogènes7,8,9,10,11,12. Constituant des produits de clivage de nombreuses protéines encéphales, ces peptides représentent également une source potentiellement importante de biomarqueurs de la maladie. Pour augmenter l’inventaire des peptides endogènes identifiés dans le LCR humaine et que les analyses endopeptidomic CSF dans les études cliniques, il a développé une méthode pour la préparation des échantillons et l’analyse de LC-MS (un schéma de protocole bref a été inclus dans la Figure 1 ). L’application de cette méthode dans une étude récente a permis l’identification de presque 16 400 peptides endogènes de CSF dans les échantillons de LCR mise en commun de plusieurs individus de diagnostic non spécifique, élargissant l’endopeptidome CSF connu dix fois13. La méthode peut éventuellement être utilisée parallèlement aux isobare approche étiquetage pour la quantification.
Préparation des échantillons
La principale source de masse des protéines dans le LCR est constituants du plasma (par ex. albumine et des immunoglobulines) passant sur le sang cerveau barrière14,15. Leur abondance gêne la détection des composants de l’échantillon faible-abondant, dérivé du cerveau. Les peptides endogènes peuvent être aisément séparées des protéines haute-abondantes, permettant ainsi un volume beaucoup plus important d’extrait peptide CSF à utiliser pour l’analyse de LC-MS, permettant la détection des peptides moins abondantes.
Dans le protocole présenté ici, filtration de coupure (MWCO) de poids moléculaire a été utilisée pour séparer les peptides de CSF de la fraction protéique ; une méthode qui a été utilisée dans plusieurs précédentes études8,9,10,11,12,16. L’étape de filtration a été suivie d’une étape de fractionnement avant RP HPLC hors connexion effectuée sur un gradient de phase mobile pH élevé. En effectuant deux étapes de RP HPLC en tandem, avec pH étant la principale distinction, la différence de sélectivité entre les deux étapes provient essentiellement de rétention des peptides modifiés par suite de peptides différents États de charge. La demande de fractionnement pre peptide pH élevé avant SM-dans des conditions acides s’est avérée efficace en augmentant la peptide identification17,18et même à être supérieure à cette fin dans le complexe biologique échantillons par rapport aux plus séparation orthogonale modes19, tels que chat-ions forts exchange (SCX) et PR20. Pour raccourcir le temps d’analyse, un plan de concaténation a été utilisé, mise en commun de chaque fractionth 12 (p. ex., fractions 1, 13, 25, 37 et 49), qui, en raison de la puissance de haute résolution de RP HPLC, encore largement évité co élution de peptides à partir de différents fractions dans la SM-étape20,21.
Identification de peptide
Identification de peptide dans les études de peptidomic diffère de celle des études protéomiques car aucun clivage enzymatique ne peut être spécifié dans la recherche de la base de données, et en conséquence, le taux d’identification sont habituellement inférieur à11. Une récente étude13 ont montré que les tarifs d’identification pour les peptides endogènes obtenus avec Sequest et mascotte ont été sensiblement améliorées lorsque la valeur par défaut marquant l’algorithme du logiciel respectif a été modifiée à l’aide de la notation adaptative algorithme de percolateur, indiquant que les algorithmes de notation optimales pour les peptides endogènes diffèrent de celle des peptides tryptiques13. À cet étude, identification basée sur le séquençage de novo de peptide automatique en utilisant le logiciel pics (BSI) s’est avéré pour être complémentaires aux moteurs de recherche axée sur les empreintes digitales deux fragment ions, résultant en un ensemble beaucoup plus important d’identifiés peptides.
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Protocol
Le protocole décrit ci-dessous est une version améliorée de celle utilisée dans une étude antérieure où une grande quantité de peptides endogènes ont été identifiés en humain CSF15. Mises à jour de l’original du protocole impliquent des modifications mineures au prétraitement chimique du FSC ainsi qu’optimisation du dégradé utilisé à être fractionné avant RP HPLC pH élevé en mode hors connexion.
Considérations éthiques
Toutes les études du suédois patient et contrôle des matériaux ont été approuvés par les comités d’éthique : Göran St. (Réf. 2005-554-31/3). Échantillons de LCR de la cohorte de démence d’Amsterdam et des échantillons prélevés à l’hôpital National de neurologie et de neurochirurgie, de Londres ont été utilisés pour la recherche avec l’accord écrit de tous les patients participants et l’approbation des comités régionaux d’éthique. Le matériel utilisé ici principalement composé de restes de LCR d’échantillons prélevés aux fins de diagnostic et il était dépersonnalisée avant étant inclus dans nos études. Il n’y a aucune possibilité de remonter l’échantillon à tout donateur individuel ou un groupe de bailleurs de fonds.
1. extraction des humains le liquide céphalorachidien (LCR) :
- Extraire des CSF par ponction lombaire (qui doit être effectuée par un médecin dûment formé) en utilisant un protocole normalisé22.
- Éliminer les débris cellulaires et autres matériaux non soluble par centrifugation à 2 500 g pendant 20 min.
- Inspecter visuellement la LCR pour la décoloration, ce qui peut indiquer la contamination de sang résultant de la ponction des saignements. La concentration de protéine significativement plus élevée dans le sang et la présence de protéases peut considérablement affecter les résultats des analyses.
2. prétraitement de CSF (1,5 mL Volume d’échantillon, aucune Quantification) :
- Décongeler les 1,5 mL d’aliquotes de la CSF à température ambiante (RT), transvaser son contenu dans les tubes en polypropylène 10 mL et ajouter 80 µL de 1 M bicarbonate de triéthylammonium (TEAB) comme un agent tampon.
- Ajouter le chlorhydrate de guanidine 0,65 mL 8 M (GdnHCl) (concentration active GdnHCl : 2,4 M) et vortex doucement à la droite pendant 10 min.
Remarque : L’agent chaotropique, GdnHCl, affecte la viscosité du solvant et interagit avec la chaîne de polypeptide, qui se traduit par la protéine déroulement étant énergétiquement favorables23. Ainsi, GdnHCl dissout les agrégats de protéines et augmente la récupération de peptides endogènes lors de la filtration subséquente. - Ajouter 60 µL de 200 mM de l’humeur aqueuse tris(2-carboxyethyl) chlorhydrate de phosphine (TCEP) (concentration active PTCE : 6 mM) et incuber à 55 ° C pendant 1 h afin de réduire les disulfures de cystéine.
- Ajouter 35 µL de 400 mM iodoacétamide (IAA) (concentration active IAA : 4 mM) et incuber à RT dans l’obscurité pendant 30 min à alkylat cystéines. L’ajout d’un groupement alkyle veille à ce que les résidus de cystéine ne peuvent pas constituer spontanément nouveaux ponts disulfure à tout moment lors de la préparation de l’échantillon suivant.
- Ajouter 3,25 mL d’eau désionisée et vortexer brièvement pour diluer l’échantillon avant la filtration MWCO, résultant en un volume de l’échantillon total de 5,5 mL. Cette étape sert à diluer GdnHCl à moins de 1 M car une concentration plus élevée a été observée parfois causer la lixiviation des substances polymériques par les appareils de filtre.
3. prétraitement de CSF (Volume 10 x 150 µL de l’échantillon, étiquetage-quantification isobare) :
- Décongeler 150 µL d’aliquotes de CSF de 10 individus au RT et ensuite transférer le contenu à tubes à centrifuger de micro faible liaison individuelle 1,5 mL et ajouter 8 µL de 1 M TEAB comme agent de mise en mémoire tampon.
- Ajouter 65 µL de 8 M GdnHCl (concentration active GdnHCl : 2,4 M) et vortex doucement à la droite pendant 10 min.
- Ajouter 6 µL de 200 mM de PTCE aqueux (concentration active PTCE : 6 mM) et une incubation à 55 ° C pendant 1 h afin de réduire les disulfures de cystéine.
- Ajouter 3,5 µL 400 mM aqueuse IAA (concentration active IAA : 6 mM) et incuber à RT et l’obscurité pendant 30 min à alkylat cystéines.
- Préparer le kit d’étiquetage isobare (e.g., balise de masse Tandem 10plex isobare réactif). Permettre l’isobares étiquetage-flacons rejoindre RT avant de les ouvrir pour éviter hydratation réactif inutiles, ajouter 41 µL de qualité HPLC acétonitrile (AcN) et dissoudre par agitation douce pendant 5 min.
- Transférer 30 µL de solution d’étiquetage-réactif isobare vers l’exemple correspondant et incuber pendant 1 heure à ta sous agitation modérée. L’isobare réactif inclut un groupe de NHS-ester qui réagit avec les amines primaires présents au peptide N-termini ainsi qu’avec les résidus de Lysine.
- Ajouter 8 µL de l’hydroxylamine 5 % (hydroxylamine concentration active : 0,16 %) et l’agiter doucement à RT pendant 20 min pour étancher la réaction d’étiquetage. Puisque les échantillons marqués séparément doivent être combinées, veiller à ce que la réaction d’étiquetage est piégée. Par addition d’une abondance de groupes amine sous la forme de l’hydroxylamine, l’isobare reste réactif réagit et est ainsi rendu inerte.
- Combiner le contenu de chacun des 10 échantillons étiquetés individuellement dans un tube unique de 15 mL en polypropylène.
- Ajouter 6,4 mL d’eau déminéralisée à l’échantillon combiné et vortexer brièvement pour réduire la concentration d’AcN de 12 % à 3 % et à la concentration de GdnHCl GdnHCl à moins de 1 M car une concentration plus élevée a été observée parfois causer la lixiviation des substances polymériques les dispositifs de filtre.
4. poids moléculaire limite Filtration
- Afin d’éliminer le potentiel contaminants, condition le MWCO filtres en chargeant les 10 mL de solution aqueuse 1 M GdnHCl, 25 mM TEAB et centrifugation pendant 15 minutes à 2 500 x g et RT, jetez le cheminement (FT).
- Chargez le volume de l’ensemble de l’échantillon sur le filtre (5 mL non étiquetés CSF (étape 2.5) ou 10 mL isobare marqué CSF (étape 3,9)) et centrifuger pendant 30 min à 2 500 x g et RT, le cheminement (FT) dans le récipient de collecte. Le résultat de la filtration, c’est que les petites protéines et peptides soient séparés des protéines et résidus de débris cellulaires. Cette étape peut être considérée comme l’équivalent à l’utilisation de la digestion protéolytique des protéines peptidomic pour générer des peptides dans les expériences de la protéomique.
- Charger 5 mL de 25 mM TEAB (aqueuse) sur les filtres et la centrifugeuse à 2 500 x g pendant 15 minutes et RT, afin d’augmenter la récupération des peptides.
- Vortex les FTs combinées des deux étapes précédentes (total 10 mL de non étiquetés ou 15 mL de l’échantillon marqué isobare) et passez à l’acidification de l’échantillon.
5. le salage et l’échantillon nettoyage par Extraction en Phase solide
- Acidifier l’échantillon filtré de l’étape 4.4 avant extraction en phase solide (SPE). L’acidification est effectuée afin d’améliorer l’interaction du soluté (peptide) avec la phase stationnaire de la SPE-cartouche.
- Pour l’échantillon non marquée (volume 10 mL) : Ajouter 550 µL de 1 % d’acide trifluoroacétique (TFA) - volume total de l’échantillon : 10,55 mL avec 0.05 % TFA.
- Pour l’échantillon marqué isobare (volume 15 mL) : ajouter 20 mL 0,1 % TFA pour acidifier et descendre AcN concentration de 3 % à 1 % - volume total de l’échantillon : 30 mL avec 0,066 % TFA.
NOTE : TFA est également ajouté à sa fonction comme un réactif de paires d’ions, qui améliore la rétention des peptides pas eux-mêmes susceptibles d’interaction hydrophobe suffisamment forte avec le matériel d’emballage de la cartouche SPE à conserver. - Si pH > 3, titrer l’échantillon à 20 % d’acide phosphorique, jusqu'à ce que le pH de l’échantillon est < 3.
- Conditionner les cartouches SPE par addition de 1 mL de 84 % AcN, 0,1 % d’acide formique (FA) et jeter les pieds répètent une seule fois. Conditionnement de la cartouche filtrante est nécessaire pour retirer les substances indésirables qui seraient autrement éluer avec les peptides dans les étapes suivantes ; en outre, conditionnement augmente la perméabilité du filtre.
- Equilibrez la cartouche SPE par addition de 1 mL de 0.1 % TFA, jeter FT. répéter une fois. S’assurer que le filtre ne fonctionne pas sèche après la dernière étape de l’équilibration - garder un petit volume sur le dessus du filtre. L’équilibration de la cartouche filtrante est effectuée afin de préparer le filtre pour retenir les peptides en enlevant la substance hydrophobe (acétonitrile) à gauche de l’étape du conditionnement.
- Chargez le volume de l’ensemble de l’échantillon (10,55 mL pour les échantillons non étiquetés ou 30 mL pour échantillons marqués isobare), dans plusieurs portions si nécessaire et laissez le FT en déchets. Veiller à ce que la cartouche ne pas fonctionner à sec entre les cycles de chargement et après que le dernier volume de l’échantillon a été chargé - garder un petit volume sur le dessus du filtre.
- Passer de 1 mL de 0.1 % TFA sur les filtres pour enlever les sels et les réactifs et jeter la répétition de pi une fois. S’assurer que la cartouche ne fonctionne pas sèche après chaque lavage - garder un petit volume de liquide sur le dessus de la cartouche.
- 1.5 de la place du micro liaison faible mL centrifuger les tubes sous la cartouche et éluer l’échantillon en passant de 1 mL de 84 % AcN, 0,1 % FA sur la cartouche.
- Éliminer les solvants de l’échantillon hors salée par évaporation dans une centrifugeuse vide sans chauffage actif jusqu’au sec, conserver à-80 ° C ou procéder immédiatement à pH élevé fractionnement entrer.
6. hors ligne pH élevé Reverse Phase HPLC échantillon fractionnement
-
Préparer les phases mobiles aqueuse pH élevé (HpH) :
HpH tampon A: Eau Pure
HpH tampon b : 84 % AcN
HpH tampon C: 25 mM NH4OH
Tampon de chargement HpH : 2,5 mM NH4OH, 2 % AcN
Remarque : Tampon de charge HpH est utilisée comme tampon solution et échantillon de transport - Dissoudre à nouveau l’échantillon dans 16 µL de tampon HpH chargement par une agitation modérée pendant 20 min
- Charger 15 µL de l’échantillon sur un système HPLC avec un collecteur de fraction interne pour plaques 96 puits-profonds configuré selon mohamed al. 20 avec des modifications mineures. Fractionner un débit de 100 µL/min sur une colonne de séparation stable à pH (C18 3,5 µm, 2,1 x 250 mm) et de recueillir une fraction / min sur un gradient linéaire de 60 min.
- Utiliser les temps-points de dégradé suivants : t = 0 min, B = 1 %, C = 10 % ; t = 4 min, B = 1 %, C = 10 %, collection de fraction de départ ; t = 76 min, B = 70 %, C = 10 % ; collection de fraction de fin ; t = 76,5 min, B = 85 %, C = 10 % ; t = 80 min, B = 85 %, C = 10 % ; t = 80,5 min, B = 1 %, C = 10 % et t = 90 min, B = 1 %, C = 10 %.
- Recueillir des fractions répétitivement dans 12 puits dans un motif circulaire ainsi concaténer fractions espacées de 12 min, entraînant 12 fractions, chacun contenant 6 sous-fractions concaténées.
- Enlever le solvant provenant d’échantillons par centrifugation sous vide à RT et 3000 tr/min à sec et stocker les échantillons à-80 ° C avant l’analyse de LC-MS.
7. LC-MS
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Préparer les phases aqueuses de mobiles :
Mémoire tampon A: 0,1 % FA
Mémoire tampon b : 0,1 % FA, 84 % AcN
Tampon de charge : 0.05 % TFA, 2 % AcN
Remarque : Chargement mémoire tampon est utilisé comme solution de transport, de tampon et de phase mobile pour la pompe de chargement. - Chacun des 12 fractions dissoudre à nouveau par l’addition de 6 µL de tampon de chargement et en agitant à ta pendant 20 min
- Échantillon de charge 5 µL sur un nano-débit HPLC, opérant dans la configuration de piège colonne (colonne de piège : 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å taille de pore, de granulométrie de 3 µm ; colonne de séparation : C18, 75 µm x 500 mm, 100 Å taille des pores, de granulométrie de 2 µm et d’effectuer la séparation de peptide à un débit de 150 nL/min en utilisant le gradient suivant : t = 0 min, B = 2 % ; t = 10 min, B = 2 % ; t = 11 min, B = 7 % ; t = 100 min, B = 26 % ; t = 170 min, B = 45 % ; t = 175 min, B = 80 % ; t = 181 min, B = 2 % et t = 210 min, B = 2 %.
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Effectuer MS sur le spectromètre de masse haute résolution hybride relié à l’HPLC via une interface de nano-ESI. Enregistrer les spectres complets en MS mode à un paramètre de résolution de 120 000 (cible AGC 2.0e5) sur la plage de m/z 350-1 400.
- Exploiter le spectromètre de masse en mode d’acquisition dépendant des données, sélectionnez les spectres MS/MS dans les haut de la page dix pics plus intenses avec m/z > 150 et au sein de la gamme intensité 1.0e4-1.0e5 pour l’analyse des ions fragments. Isoler les ions précurseurs à l’aide d’une fenêtre d’isolement quadripolaire de 1 m/z, le temps d’injection maximal de 100 ms et l’objectif de RF à 60 %.
- Appliquer une exclusion dynamique avec un délai d’exclusion de 15 s, avec une tolérance de m/z de ±10 ppm. Effectuer la fragmentation dans la cellule de dissociation (HCD) d’énergie plus élevée collision et enregistre les acquisitions SM/SM dans l’Orbitrap valant à un paramètre de résolution de 50 000 (valeur de cible AGC 5.0e4).
8. peptide Identification
-
Pour l’identification de peptide soumettre les .raw-fichiers résultants de l’analyse par spectrométrie de masse à un moteur de recherche protéomique appliquant les paramètres suivants :
Remarque : Dans notre précédente étude15, trois moteurs de recherche ; Mascotte v2.4 Sequest HT et pics v7.5 servaient en parallèle et les paramètres spécifiés ici travaillaient tous les trois moteurs de recherche, sauf indication contraire. La majorité des paramètres réglables est universelle pour l’identification des peptides/protéines et devrait avoir les paramètres correspondants dans n’importe quel moteur de recherche donné.
Sélecteur de spectre :
Précurseurs des min. masse : 350 Da
Max. précurseur de masse : 5 000 Da
Scan type : complet
Seuil de signal/bruit : 1,5
Recherche de base de données de séquence
Base de données : UniProt_SwissProt [version2015_11]
Taxonomie : Homo sapiens
Enzyme : aucun
Max. raté les clivages : 0
Instrument (mascotte uniquement) : ESI-Trap
Longueur min. de peptide (SequestHT seulement) : 6
Max. longueur de peptide (SequestHT seulement) : 144
Tolérance de masse précurseur : 15 ppm
Fragment de tolérance masse : 0,05 Da
Modifications statiques : Carbamidomethyl (C) ; [Si] TMT10plex (N-Term)
Les modifications dynamiques : oxydation (M) ; [Si] TMT10plex (K)
Peptide-spectre match validateur (PSM)
Percolateur (mascotte et Sequest HT seulement) ou Fusion de leurre (pics seulement)
Cibler les FDR : 0,01
Validation basée sur : q-valeur
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Representative Results
La méthode décrite ici a été appliquée et évaluée dans trois études avant l’instauration du fractionnement de l’échantillon (tableau 1). La première étude utilisé hors connexion LC pour repérer des fractions de CSF sur une plaque de mire MALDI et abouti à 730 peptides endogènes identifié11. Dans les deux études, étiquetage isobare travaillait. Surtout dans une étude cas/témoins étudier simultanément pour l’identification et la caractérisation des biomarqueurs potentiels dans le CSF endopeptidome et proteome24et dans la deuxième étude isobare étiquetage a été utilisé pour surveiller les effets du traitement in vivo d’un inhibiteur de la γ-secretase sur l’expression de peptide dans le LCR plus de 36 h16. Dans l’étude de cas/témoins 437 peptides endogènes ont été identifiés, 64 dont significativement altéré de concentration entre les personnes atteintes de la ma et les témoins sains. Le troisième, étude de traitement, identifié les peptides endogènes de 1798, 11 des peptides surveillées pourrait être montré à répondre au traitement.
Dans la quatrième étude, l’objectif était d’augmenter le nombre de peptides de CSF identifiés, notamment pour identifier les peptides moins abondantes. Par conséquent, fractionnement préalable de peptide par chromatographie HpH-RP a été inclus et un volume d’échantillon CSF 10 fois plus grand on a utilisé, pour l’identification de peptides 16 395. Dans cette étude, aucun étiquetage isobare a été réalisée. En plus de fractionnement de l’échantillon, l’étude la plus récente employée une identification combinée peptide approcher, attendu que dans les trois premières études a été effectuée seulement une recherche de base de données unique, permettant à certains comptes de mesure pour le plus grand nombre de peptides identifiés. En comparant les résultats obtenus par les moteurs de recherche individuels (mascotte, Sequest HT ou pics) de l’étude la plus récente indique que les algorithmes utilisés sont en quelque sorte complémentaire depuis une quantité relativement faible, moins de 15 % (2440), des peptides sont identifié par tous les moteurs de recherche trois (Figure 2). En outre, la de novo-séquençage recherche moteur pics a été le plus efficace dans l’identification de peptides endogènes, mais plus que 5 400 peptides n'auraient pas identifiés si seulement les sommets avaient été utilisés (Figure 2). L’application de plusieurs moteurs de recherche sur la même matière a potentiel des questions tests multiples et ceci a été adressé avec un test d’identification de justesse13. Les données acquises de la SM/SM brutes, ainsi que tous les résultats obtenus dans les recherches de protéomique de l’essai plus récent ont été mis à la disposition dans le référentiel de données de fierté via ProteomeXchange avec l’identificateur PXD004863.
Figure 1 : un schéma de protocole visualisant les principales étapes de la méthode. Extraction du liquide céphalo-rachidien par ponction lombaire suivie par centrifugation pour enlever le matériau non soluble, 2) ajout de GdnHCl à l’échantillon de dissocier les agrégats de peptides-protéines, une augmentation de la récupération de peptides endogènes ; réduction et alkylation de disulfures de cystéine ; filtration de poids moléculaire étiquetage isobarique pour la quantification de peptide (en option) 3) pour séparer les peptides endogènes de protéines, 4) extraction en phase solide pour éliminer les sels et autres contaminants polaires, 5) fractionnement avant RP HPLC, alcalin gradient de phase mobile et concaténation de chaque fraction deth 12, 6) gradient de phase mobile CLHP/SM, acides, chaque fraction concaténée exécuter consécutivement, 7) identification de peptide interprétée par envoi de données de MS/MS de toutes les séries de 12 analyse comme un seul échantillon pour les moteurs de recherche, par la suite peptide IDs ont été comparées et un résumé de tous unique peptide IDs a été effectuée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Résumé de l’étude | TMT étiquetage (o/n) | Fractionnement de HpH-RP (o/n) | Volume correspondant de LCR par MS-analyse (µl) | Nombre de peptides identifiés | Commentaire | Référence |
| Analyse exploratoire de peptidome CSF | n | n | 500 | 730 | Préparation de cible en mode hors connexion LC MALDI, MALDI-MS ; évaluation des filtres MWCO | 4 |
| Comparaison quantitative de peptides de CSF ; échantillons de 20:00 + Ctrl 8 | y | n | 200 | 437 | HPLC-IEN ; peptidomic combiné et protocole de protéomique | 25 |
| Étude de traitement AD gamma SECRÉTASE inhibiteur | y | n | 300 | 1798 | HPLC-IEN ; CSF extraite à six points dans le temps après le traitement | 17 |
| Expansion de la peptidome de CSF | n | y | 750-1000 | 18.031 | HPLC-IEN ; combinaison de logiciels d’identification de peptide | 15 |
Tableau 1 : Une compilation des études récentes menées par ce groupe qui s’applique à filtration poids moléculaire et analyse par spectrométrie de masse pour l’identification des peptides endogènes dans le LCR humaine.
Figure 2 : un diagramme de Venn comparant les résultats d’identification peptide provenant de chacun des moteurs de trois recherche mascotte, Sequest HT et sommets. Un total de 16 395 peptides endogènes ont été identifiés. Le de novo-séquençage des pics de moteur de recherche identifiés 10 967 peptides endogènes ; les moteurs de recherche axée sur les empreintes digitales de fragment-ion mascotte et Sequest HT identifié les peptides endogènes 8118 et 7304 respectivement. Le consensus d’identification entre tous les moteurs de recherche trois s’élevait à 2440 peptides endogènes, soit 14,8 %. Il y avait un chevauchement d’identification relativement importantes entre mascotte et HT Sequest, correspondant à 70 % de leurs identifications peptide combinée. PICS avaient une identification relativement petite se chevauchent avec mascotte et Sequest HT ; 20,5 % et 18,9 % respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’introduction d’un pH élevé RP HPLC avant fractionnement pas un protocole développé antérieurement pour la récupération de peptides endogènes de poids moléculaire ultrafiltration11 échantillon relative complexité réduite et ainsi autorisé pour un 5 fois plus grand volume de l’échantillon à étudier. Ceci, à son tour, augmente la concentration du sous-ensemble des peptides présents dans chacune des fractions et ainsi amélioré les chances de détecter les faibles peptides abondantes.
En effectuant une stratégie d’identification pour les peptides endogènes qui employait trois logiciels de protéomique en parallèle, il était possible d’étendre l’endopeptidome CSF connu plus de 10 fois. Un total de 16 395 peptides endogènes ont été identifiées dans un essai préliminaire sur un échantillon de CSF mis en commun. Parmi les identifications étaient un grand nombre de peptides endogènes dérivés de protéines mentionnés précédemment dans le contexte des troubles neurodégénératifs. Plusieurs peptides identifiés dans les études susmentionnées sont actuellement évalués comme biomarqueurs dans notre laboratoire. Ce processus implique plusieurs étapes, y compris la vérification des identités des peptides par CSF de fortification avec des analogues synthétiques marqués avec des isotopes lourds, mise en place de ciblées dosages par spectrométrie de masse, évaluation de la stabilité de peptide pendant le stockage et gel-dégel cycles et analyser différentes cohortes cliniques.
Modifications ont été apportées au protocole original afin d’éviter l’introduction de contaminants (mesures 2,5 et 3,5) suite à une forte concentration de GdnHCl dans l’échantillon pendant MWCO-filtration. Une mise à jour au dégradé avant fractionnement (étape 6.3.1) a été effectuée, le gradient linéaire, prolongé, de capacité.
Les principales causes des pertes d’analyte dans le protocole décrit ici peuvent être attribuées à deux étapes chromatographiques RP ainsi que la filtration MWCO et échantillon SPE étape de nettoyage.
Le peptide pertes dues à l’interaction avec le filtre MWCO, ou protéines conservées à ce sujet, lors de la filtration sont difficiles à éviter et peuvent être une source d’inter variation de l’échantillon.
Plus sélectives pertes susceptibles de surgissent lors des étapes de RP par chromatographie en phase. Hydrophobicité de peptide étant dépendante du pH, effectuer deux étapes chromatographiques RP consécutives à haute et basse pH, respectivement, peut entraîner des pertes du sous-ensemble des peptides qui sont trop hydrophile à pH ≥ 9 à retenir sur la colonne et l’autre de la même façon sous-ensemble trop hydrophile à pH ≤3 à conserver.
Par rapport aux méthodes précédemment utilisées, l’emploi de fractionnement pre a conduit à une multiplication par 10 en identification de peptides endogènes. Il a permis pour la détection réussie d’un grand nombre de peptides non identifiés auparavant et est donc un outil précieux pour l’étude et l’exploration de la CSF peptidome et peut-être d’autres échantillons biologiques complexes aussi bien.
Combiné avec étiquetage isobare multiplexé que le protocole est destiné à être appliqué plus loin pour identifier les biomarqueurs candidats pour divers troubles neurodégénératifs dans le tissu de la CSF, sang et le cerveau.
Récupération de variable dans les étapes de préparation d’échantillon contribue à la variation analytique pour l’analyse des peptides et des protéines de CSF par LC-Mme Performing isobare étiquetage des peptides à un stade précoce dans les diminutions de préparation d’échantillon l’influence d’un tel variation grandement. Par rapport aux protocoles de préparation d’échantillon a déjà été indiqué, la mise en œuvre de fractionnement préalable de peptide pH élevé en phase inversée a augmenté le nombre de peptides identifiés par un facteur 5. Identification des peptides endogènes de données/MS-MS a été considérablement améliorée quand on combine les programmes de logiciel d’identification différents peptides, employant des algorithmes de recherche différents.
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Disclosures
Aucun des intérêts concurrents, financières ou autres, entre les auteurs n’ont été signalés.
Acknowledgments
Un grand Merci Tanveer Batth et ses collègues pour obtenir des conseils à mettre en place la méthode de fractionnement préalable.
Ce travail a été financé par le Conseil de recherche suédois, le Wallström et Sjöblom Foundation, le pistolet et Bertil Stohne Fondation Stiftelse, la Fondation de Bergwall Magnus, la Åhlén Foundation, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, Knut et Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen et FoU-Västra Götalandsregionen.
Les principaux bénéficiaires du financement de ce projet ont été Kaj Blennow, Henrik Zetterberg et Johan Gobom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
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