Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Rask stråling Biodosimetry automatisert for Dicentric kromosom identifikasjon (ADCI) og Dose estimering

Published: September 4, 2017 doi: 10.3791/56245
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1,3
1CytoGnomix Inc., 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Western University, 3Department of Biochemistry, Western University
* These authors contributed equally

Summary

Cytogenetic dicentric kromosom (DC) analysen kvantifiserer eksponering for ioniserende stråling. Automatisert Dicentric kromosom ID og Dose Estimator programvaren anslår nøyaktig og raskt biologiske dose fra DCs i metaphase celler. Det skiller monocentric kromosomene og andre objekter fra DCs og anslår biologiske stråledose fra frekvensen av DCs.

Abstract

Biologiske stråledose kan estimeres fra dicentric kromosom frekvenser i metaphase celler. Utføre disse cytogenetic dicentric kromosom analyser er tradisjonelt en manuell, arbeidskrevende prosess ikke vel egnet til å håndtere volumet av prøver som krever undersøkelse i kjølvannet av en masse havari hendelse. Automatisert Dicentric kromosom ID og Dose Estimator (ADCI) programvare automatiserer denne prosessen ved å undersøke sett av metaphase bilder med maskinen læring-basert image bearbeiding teknikker. Programvare velger passende bilder for analyser avfjerner upassende bilder, klassifiserer hvert objekt som en centromere inneholder Kromosom eller ikke-kromosom, videre skiller kromosomene som monocentric kromosomene (MCs) eller dicentric kromosomene (DCer), bestemmer DC frekvens innenfor en prøve, og anslår biologiske stråledose ved å sammenligne DC samplingfrekvens kalibrering kurver ved hjelp kalibrering prøver. Denne protokollen beskriver bruken av ADCI programvare. Vanligvis importeres både kalibrering (kjent dose) og test (ukjent dose) sett metaphase bilder for å utføre riktig dose estimering. Optimale bilder for analyse finner automatisk bruker forhåndsdefinerte image-filtre eller kan også filtreres gjennom manuell inspeksjon. Programmet behandler bilder i hvert utvalg og DC frekvenser er beregnet på ulike nivåer av stringens for å kalle DCs, bruker en maskin lære tilnærming. Lineær-kvadratiske kalibrering kurver genereres basert på DC frekvenser i kalibrering prøver utsatt for kjente fysiske doser. Doser av testprøvene utsatt for usikker stråling er beregnet fra DC frekvenser ved hjelp av disse kalibrering kurver. Rapporter kan genereres på forespørsel og gir sammendrag av resultatene av en eller flere prøver, av en eller flere kalibrering kurver eller dose estimering.

Introduction

Stråling biodosimetry bruker biologiske markører, hovedsakelig chromosomal avvik som dicentric kromosomene (DCs) og kromosom translocations å måle Stråledoser som individer er utsatt. En biologisk absorbert dose kan være forskjellig fra fysisk dose målt ved instrumenter på grunn av variasjon mellom individer. Tilsvarende kan stråling av en bestemt fysisk dose produsere ulike biologiske eksponeringer på grunn av underliggende fysiologisk eller miljømessige tilstander. Kunnskap om biologiske dosen er spesielt viktig for både diagnose og behandling.

DC analysen er gullstandarden av Verdens helseorganisasjon (WHO) og internasjonale atomenergibyrået (IAEA) for å vurdere biologiske stråling i mennesker. Det var første analysen anbefalt av IAEA, og som for stråling dose vurdering. DC frekvens er relativt stabil i ca 4 uker etter stråling eksponering1 og deres kvantitative sammenheng med slippes ut stråledose er nøyaktig, som gjør DCs den ideelle biomarkør. Forholdet mellom stråledose (referert i grått [Gy] enheter) og DC frekvens (referert til som antall DCs per celle) kan uttrykkes som en lineær-kvadratisk funksjon.

Cytogenetic DC analysen er industristandarden for 55 år2. Det har vært utført manuelt, krever 1-2 dager til å analysere mikroskop data fra en enkelt blodprøve. Flere hundre til flere tusen bilder for å nøyaktig beregne stråling avhengig av dose3. Ved doser overstiger 1 Gy, anbefaler IAEA minimum 100 DCs oppdages. Undersøkelse av 250-500 metaphase bilder er vanlig praksis i biodosimetry cytogenetic laboratorier. For prøver med eksponeringer < 1 Gy, 3,000-5,000 bilder foreslås på grunn av lavere sannsynligheten for DC-formasjonen. Uansett er det en Ap-intens aktivitet.

Cytogenetic biodosimetry laboratories opprette egne i vitro stråling biodosimetry kalibrering kurver før vurdere biologiske doser i test prøver. Blodprøver fra normalt, kontroll individer er utsatt for stråling og lymfocytter er kultivert og forberedt for metaphase kromosom analyse. Bruk disse prøvene, er biologiske doser mottatt kalibrert på kjente fysiske doser slippes ut av en standard strålingskilder. Etter metaphase celle bilder registreres, eksperter undersøke bilder, telle DCs og beregne DC frekvenser for hvert utvalg. En kalibreringskurven bygges ved å montere en lineær-kvadratiske kurve til DC frekvenser på alle doser. Deretter kan eksponeringer i testprøven fra enkeltpersoner utledes ved å matche DC frekvensene på kalibrert doser på kurven eller ved å angi dem i tilsvarende lineær kvadratiske formelen.

Vi har automatisert både påvisning av DCs og dose å fremskynde denne fremgangsmåten bruker programvaren. Automatisert Dicentric kromosom identifikator og Dose Estimator (ADCI) bruker maskinen læring-baserte image bearbeiding teknikker til å oppdage og diskriminere dicentric kromosomene (DCs) fra monocentric kromosomene (MCs) og andre objekter og automatiserer stråling dose estimering. Programvaren har som mål å reduserer eller eliminerer behovet for manuell kontroll av DC teller og akselerere dose estimering gjennom automatisering. Det har blitt utviklet med involvering av referanse biodosimetry laboratories på Health Canada (HC) og kanadiske kjernefysiske Laboratories (CNL). Deres tilbakemelding vil sikre at ytelsen vil fortsette å møte IAEA kriterier for denne analysen.

Programvaren utfører følgende funksjoner: 1) filtrering DCs velge optimal metaphase celle bilder for analyse, 2) kromosom anerkjennelse, DC gjenkjenning og DC frekvens besluttsomhet og 3) beregner stråledose fra dose kalibrert, cytogenetic stråling data. Denne programvaren behandler grupper av metaphase bilder fra samme individ (kalt et utvalg), teller antall DCs i hver bruker bilde prosessering teknikker, og returnerer den estimerte stråledose mottatt av hvert utvalg i enheter gråtoner (Gy).

Programvaren er utviklet for å håndtere en rekke kromosom strukturer, teller og tettheter. Imidlertid utfører algoritmen optimalt i metaphase bilder som inneholder en nær komplette komplettere godt atskilt, lineær kromosomene4. Bilder som inneholder svært overlappende sett chromosomes, flere celler, ufullstendig metaphase celler, søster chromatid separasjon, kjerner, ikke-chromosomal objekter og andre defekter kan redusere nøyaktigheten av algoritmen. Dedikert bildet utvalg modeller og andre objekt segmentering terskler kan filtrere ut fleste sub-optimale bilder og falske positive DCs.

Dicentric kromosom gjenkjenning er utført når et bilde blir behandlet. Algoritmen prøver å finne ut hvilke objekter i et bilde er kromosomene og deretter lokaliserer de to regionene mest sannsynlig å være centromeres på hver kromosom. Så, en serie av ulike støtte vektor maskin (SVM) lære modeller skille kromosomene som DCs eller normal, monocentric kromosomer. SVM-modellene skiller i sensitivitet og spesifisitet av DC (se trinn 3.1.4 nedenfor), som kan påvirke DC frekvensene som bestemmes i et utvalg.

ADCI behandler sett med Giemsa - (eller DAPI-) farget metaphase digitale bilder (i TIFF- eller JPG-format) for én eller flere utvalg. Programvaren analyserer DCs både kalibrering prøver og test prøver. Den fysiske doser (i Gy) av kalibrering prøver er kjent og brukes til generering av en kalibreringskurven. Den fysiske og biologiske doser av personer med ukjent eksponeringer er avledet av programvaren fra maskin-generert kalibreringskurven. Selv om laboratorier bruke sammenlignbare teknikker, varierer kalibrering kurvene fra forskjellige laboratories ofte3. Begge kalibrering kurve og test prøver fra samme laboratorium bør behandles for nøyaktig dose anslag i test prøver.

Denne programvaren gir hastighet, nøyaktighet og skalerbarhet hvilke adresser produktiviteten må håndtere en hendelse der mange mennesker må samtidig testes. Den ble utviklet fra 2008-20174,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Bruker nyere maskinvare, dette skrivebordetPC-programvare kan behandle og anslag stråledose i en pasient prøve av 500 metaphase genomet ekvivalenter i 10-20 min 4. Koden er basert på et sett av proprietære bildesegmentering og maskin læring algoritmer for kromosom analyse. Expert analyse av hver kromosom utsatt for 3 Gy stråling ga sammenlignbare beskrevne til ADCI. I et sett med 6 utvalgene av ukjent eksponeringer (tidligere brukt i en internasjonal ferdigheter øvelse), anslått programvaren doser i 0,5 Gy verdiene ved manuell vurdering av samme data fra HC og CNL, oppfylle IAEAS krav til triage biodosimetry. Videre anslår inter-laboratory standardisering og til slutt reproduserbarhet av dose nytte har en felles, automatisert DC scoring algoritme. Likevel tillater programvaren tilpassing av bildet filtrering og utvalg kriterier, aktivere forskjeller i kromosom forberedelse metoder og kalibrering strålekilder tas hensyn.

Denne programvaren er et grafisk brukergrensesnitt (GUI) - basert system som analyserer sett av kromosom bilder som inneholder Giemsa (eller DAPI) - farget metaphase celler for avvik som skyldes eksponering for ioniserende stråling. Image-sett er digitalt fotografert med en lys (eller epifluorescent) mikroskop og hvert sett tilsvarer en annen prøve. Programvaren utnytter bildebehandlingen teknikker for å oppdage og diskriminere DCs fra MCs og andre objekter. Empirisk-avledet segmentering filtre deretter eliminere automatisk falske positive DCs uten å påvirke sant DCs. Til slutt, programvaren automatisk filtrerer ut uønskede bilder basert på ulike egenskaper fant dårlig kvalitet metaphase bilder med precomputed (eller brukerdefinert) bildet utvalg modeller. Disse bildene inkluderer de som inneholder overdreven eller utilstrekkelig antall "støyende" objekter, flere overlappende kromosomer, bilder mangler metaphase kromosomer, overdreven antall søster chromatids4. Automatisk kuratert bildedataene brukes til å generere dose kalibreringskurven fra utvalg av kjente stråledose og brukes til å beregne eksponeringer av testprøvene utsatt for ukjent doser.

Produksjon av programvaren kan vises og lagret som: 1) tekstbasert utgang vises i konsollen, 2) tomter som kan være lagret som bilder og 3) rapporter i HTML-format. Kan tilpasses mange aspekter av programvaren som passer behovene til forskjellige laboratorier. Individuelle laboratorier gir vanligvis både kalibrering og test prøver forberedt og samlet inn basert på cytogenetic protokollen validert i at laboratoriet. Dette opprettholder ensartethet eksempel forberedelser og tillater kalibrering kurver generert fra kalibrering prøver brukes meningsfullt for å test prøver avledet bruke samme protokoll. Kalibrering kurver kan også opprettes fra kurven koeffisienter eller DC frekvenser på definerte doser. De mest nøyaktige dose anslagene er oppnådd ved å filtrere ut lavere kvalitet bilder og falske positive DCs (FPs). Utvalg av optimale bildet undergrupper innenfor hvert utvalg gjøres ved hjelp av "Bilde valget modeller" som eliminerer subpar bilder som pleier å introdusere FPs. En rekke pre-validert modeller er inkludert i programvaren, men flere modeller med tilpassede terskler og filtre kan opprettes og lagret av brukeren.

Når programvaren er lastet inn, det viktigste grafiske brukergrensesnittet (GUI) er presentert (se figur 1). Fra dette grensesnittet, prøver, hver bestående av en mappe med metaphase bildefiler for cellen, kan valgt og behandles for å identifisere DCs kalibrering kurver kan opprettes og forhold og eksponering stråledose prøver bestemmes.

Figure 1
Figur 1: The Hovedsektorene grafisk bruker grenseflate inkluderer: en liste over eksempler (1), en liste over kalibrering kurver (2), prosessen køen (3), som overvåker statusen til DC påvisning i hvert av hver prøve, et plott vise (4), som oppsummerer statistiske eller andre kvantitative egenskaper av bilder i eksempler eller kalibrering kurver og en konsollen (5) som inneholder beskrivende tekst som resultatene av hver operasjon utført av programmet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

1. import og prosessen prøver

  1. Klikk ' prøver ' i menylinjen og velg ' nye eksempler '. Bla til en passende katalog som inneholder en gruppe metaphase bilder og klikk ' Velg mappe '.
  2. Skriver du inn en unik ID for prøven i den ' angi en unik ID for den nye prøven ' tekstfelt. Denne IDen identifiserer eksemplet i arbeidsområdet. Eksempel-IDer må inneholde alfanumeriske ' _ ', eller '-' tegn bare. Inkludering av kilde laboratorie- og fysiske dose (for kalibrering prøver) i prøve-ID er kjent.
  3. (Valgfritt) Angi en beskrivelse av prøven eventuelt innen den ' beskrivelse av prøven (valgfritt) ' tekstområdet.
  4. Klikk ' OK ' til nye utvalget til arbeidsområdet.
  5. Gjennta punkt 1.1 gjennom 1.4 legge flere eksempler. Lag minst 3 kalibrering prøver (sju eller flere er anbefalt 3 av ulike eksponeringer) og minst én testprøven utføre dose estimering.
  6. Merker alle prøver opprettet i trinn 1.1 til 1,5 i den ' prøver ' og klikker ' legge til prøven (e) til prosessen køen ' (Graphic 5) ikonet.
  7. Klikk ' behandle alle prøvene i køen ' (Graphic 6) ikon å behandle alle prøver sekvensielt i køen - en ' ADCI behandling ' dialogboksen vises med alle prøvene i køen med en fremgang stang
  8. Når alle prøver har fullført behandling, klikk på Graphic 9. Lagre prøver nå, eller klikk ' lagre en behandlet prøve en ADCI eksempelfilen ' (Graphic 7)-ikonet for å lagre en behandlet prøve senere.

2. visning og valg av bilder (valgfritt, anbefales trinn)

Merk: dette trinnet beskriver bruken av Metaphase Image Viewer og etablering av et bilde utvalget modell. Noen godkjente bildet utvalg modeller er inkludert i programvaren som kan brukes i kalibrering kurve generasjon og dose estimering. Dette trinnet er dermed ikke nødvendig, men det kan brukes som en guide som beskriver trinnene nødvendig hvis ønskelig.

  1. Markere et utvalg innen den ' prøver ' klikker ' prøver ' i menyen stang, og velge ' bildevisningen ' å åpne den ' Metaphase Image Viewer ' .
  2. Navigere blant bildene
    1. velge en image fra dropdown-boksen til å vise et bestemt bilde. Klikk på venstre og høyre pilikonene å bla gjennom bildene.
    2. Velg en SVM Sigma verdi fra rullegardinlisten for å vise DC-søkeresultatene på Sigma verdien. Velg " Unprocessed " fra dropdown-boksen til å vise raw-bilder uten kromosom kantlinjer.
    3. Sjekk det ' Inverter ' for å invertere verdiene for farge og lysstyrke for hvert bildepunkt i bildet.
  3. Sjekk den ' bildet i listen ' for å legge til synlige bildet til en ' se listen '. Klikk ' lagre se listen til en tekstfil ' (Graphic 3) ikonet lagre navnene på alle bilder i overvåkingslisten til en tekstfil.
  4. Bildet utvalg modeller
    1. Klikk ' vise alle bilder ' (standardvalg) inkludere alle bildene i bildet utvalg dropdown-boksen. Observere teksten ved ' bilder ' å oppdage brøkdel av bildene valgt av brukte bildet utvalg modellen.
    2. Klikk ' vise tatt bilder ' med bare disse bilder som ikke er ekskludert av bildet utvalg modellen i boksen.
    3. Klikk ' Vis utelukket bilder ' ta med bilder som har blitt ekskludert av utrullet avbildning utvalg modellen i boksen.
    4. Sjekk det ' utelukke ' boksen manuelt utelate et enkeltbilde.
      Merk: Manuelt ekskluderte bilder, gjenopprettes til det valgte bildet hvis en bildet utvalg modellen brukes senere.
    5. Lagre et utvalg av bilder ved å klikke på ' Lagre merket område i ' knappen. Angi et filnavn for den lagrede markeringen når du blir spurt. Klikk ' Load utvalg ' bruke en tidligere lagret markering.
    6. Klikk ' bruk bilde filtre ' å åpne den ' bruk Filter-baserte Image utvalget modell gjeldende utvalg ' dialogboksen som skaper, lagrer eller bruker kriteriene for å velge metaphase bilder i et utvalg.
    7. Velg en bildet utvalg modellen fra listen forhåndsutfylt. Klikk ' OK ' å bruke den gjeldende modellen.
    8. Angir du en beskrivelse for en ønsket ny modell, definere ' bilde utelukkelse filtre ', definere ' bilde rangering og inkludering ', og klikk ' lagre utvalg modell ' å lage et bilde Utvalget modell.
      Merk: Definisjoner av ' bilde rangering og inkludering ' metoder og hver ' utelukkelse bildefilteret ' finnes i programvaren elektronisk dokumentasjon 14.

3. Kurven generasjon

  1. (Recommended optional step) kurve kalibrering veiviser
    1. sikre minst tre kalibrering prøver finnes i arbeidsområdet før du fortsetter. Klikk ' veivisere ' i menylinjen og velg ' kurve kalibrering ' å åpne veiviseren kurve kalibrering.
      Merk: Selv om bare tre eksempler er matematisk nødvendig å passe og beregne en kalibreringskurven, sju eller flere eksempler som spenner over en rekke eksponeringer mellom 0 og 5 Gy er anbefalt. Ekstra prøvene er å tilpasse kalibreringskurven til en lineær-kvadratiske dose-respons, men optimal Sigma verdiene kan være lavere for å få brukbare for lav dose estimering kurver (< 1 Gy); optimal Sigma verdiene for doser over denne terskelen er forskjellige (se trinn 3.1.4).
    2. Fortsett gjennom veiviseren innledende skjermen og sett et merke ved hvert ønsket kalibrering utvalg. For hver kalibrering prøve valgt på denne måten, kan du angi den fysiske dosen (i Gy) prøven ble utsatt i det tilstøtende tekst-feltet. Fortsett til neste veiviserskjermbilde.
    3. Velge en image utvalget modell hvis ønskelig fra listen over modeller som inneholder forhåndsinnstilte bildet utvalg modeller leveres med programvaren i tillegg til noen manuelt opprettede modeller. Fortsett til neste veiviserskjermbilde.
    4. Velg en SVM Sigma verdi fra dropdown-boksen. Fortsett til neste veiviserskjermbilde .
      Merk: En SVM Sigma verdi på 1.4 eller 1,5 anbefales for dose anslår > 1 Gy og verdien 1.0 for estimater under 1 Gy ( figur 2).
    5. Se gjennom alle tidligere valgt i oversikt og klikker ' Finish ' å fullføre veiviseren, forårsaker en prepopulatEd ' opprette en kurve ' dialogboks vises.

Figure 2
figur 2: visualisering av effekten av skiftende SVM Sigma verdien fra algoritmen på ekte Positive (TP) og falske Positive (FP) DC teller, positiv prediktiv Calue (PPV), og sann positiv Rate (TPR). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. opprette en kurve dialog.
    1. (Hopp over dette trinnet hvis veiviseren ble brukt) klikk ' kurver ' i menylinjen og velg ' nye kurven '. Velg ' montering kurve Dose-respons data ' fra dropdown-boksen vises i dialogboksen, og klikk ' OK '.
    2. Angir en unik identitet for kurven i den ' angir en unik identitet for den nye kurven ' tekstboksen i den ' opprette en kurve ' dialogboksen.
    3. (Valgfritt) Skriv beskrivelsen for den nye kurven i den ' legge til en kort beskrivelse av kurve opprettes ' tekstboksen.
    4. (Hopp over følgende trinn Hvis veiviseren kurve ble brukt til å opprette en kalibreringskurven) Angi kurve verdier.
      Merk: Veiviseren kurve kalibrering som beskrevet i trinn 3.1 forhåndsutfyller felt i den ' opprette en kurve ' dialogboksen. Trinnene nedenfor beskriver hvordan du manuelt fylle disse feltene. Hvis du brukte veiviseren, kan fortsatt noen trinnene nedenfor følges hvis ønskelig, legge til eller fjerne flere data.
      1. Velge en SVM Sigma verdi fra alternativene i den ' SVM ' dropdown-boksen - det anbefales sterkt at Sigma verdien valgt her samsvarer med Sigma verdi velges når denne kurven utføre dose estimering.
      2. (Valgfritt) Angi en bildet utvalg modellen ved å klikke på ' angi fil ' knappen.
      3. Klikk ' Input ' å legge til en ny tom oppføring i listen dose-respons under overskriften ' inn svar-Dose data for å opprette en kurve '.
      4. Angir dosen av en kalibrering prøve i Gy under overskriften ' Dose '.
      5. Enter ' svaret (DC/celle) ' trukket fra eksempel på utdata i konsollen når et utvalg er merket. Finn den riktige DC/celleverdien for tidligere valgte SVM Sigma verdien i konsollen eller fra den tilsvarende eksempelrapport (trinn 5.1, hvis tilgjengelig) og angir det i dette feltet.
      6. Gjenta de tre foregående trinnene til alle kalibrering prøvene er lagt.
    5. Trykk ' validere Data ' for å sikre innholdet i svar-dosen listen formateres riktig – Kontroller alle feltene i listen Svar-Dose er uthevet grønn angir gyldige data.
    6. Trykk ' OK ' å fullføre opprettelsen av kurven. Lagre nye kurven i den ' lagre kurven? ' dialogboksen som vises ved å trykke ' OK '. Eller klikk ' lagre kurven til en ADCI kurve fil ' (Graphic 4) symbolet uthevet i den ' kurver ' listen senere.

4. Dosen estimering

  1. (Recommended optional step) Dose estimering veiviser
    1. Klikk ' veivisere ' i menylinjen og velg ' Dose estimering '.
    2. Fortsett gjennom innledende veiviserskjermbildet, og velg en tidligere opprettet kalibreringskurven fra dropdown-boksen - egenskapene vises nedenfor. Fortsett til neste veiviserskjermbilde.
    3. Sett et merke ved testprøvene ukjent eksponering å inkludere dem i dose estimering. Fortsett til neste veiviserskjermbilde.
    4. Observere beskrivelse og egenskaper for bildet utvalg modellen brukes under kalibrering kurve generasjon. Observere at samme bildet utvalg modellen brukes på valgte testprøvene. Fortsett til neste veiviserskjermbilde.
      Merk: Under beskrivelsen av bildet utvalg modellen, den samme modellen er ferdigutfylt og gjelder for testprøvene utvalg. Samme bildet utvalg modell gjelder kalibrering og test prøver. Mens det er mulig å bruke annet bilde utvalg modeller ved å velge en annen modell fra rullegardinlisten, dette anbefales ikke.
    5. Velg en SVM Sigma verdi fra rullegardinlisten. Fortsett til neste veiviserskjermbilde.
      Merk: SVM Sigma verdien brukes under kalibrering kurve generasjon er ferdigutfylt. Det anbefales at denne verdien forblir uendret.
    6. Gjennomgå tidligere valgene på sammendraget skjermen og klikk ' Finish ' å fullføre veiviseren - en forhåndsutfylt ' Dose kalkulator ' dialogboks.
  2. Dose kalkulator
    1. (hopp over dette trinnet hvis du brukte veiviseren) markere en kalibreringskurven fra listen over kurver under overskriften ' kurver ', klikk ' kurver ' i menyen stang, og velge ' Beregne Dose ' å åpne den ' Dose kalkulator ' dialogboksen.
    2. (Hopp over disse trinnene hvis veiviseren ble brukt) angi verdier for dose estimering.
      Merk: Veiviseren Dose estimering som beskrevet i trinn 4.1 forhåndsutfyller felt i den ' Dose kalkulator ' dialogboksen. Trinnene nedenfor beskriver hvordan du manuelt fylle disse feltene. Hvis du brukte veiviseren, kan fortsatt noen trinnene nedenfor følges hvis ønskelig, legge til eller fjerne flere data.
      1. Klikk ' Bruk prøven (e) i arbeidsområdet fylle DC frekvenser ' (Graphic 8) ikon og høydepunkt test prøver i den ' behandlet prøver ADCI Arbeidsområdet ' listen til de valgte prøvene den ' DC frekvenser for Dose estimering ' listen.
      2. Velg en SVM Sigma verdi og bildet utvalg modell for disse prøvene fra dropdown.
        Merk: En SVM Sigma verdi matchende Sigma feltverdi i kalibrering kurve generasjon er nødvendig for riktig dose estimering. Sigma verdien forbundet med kalibreringskurven vises nederst i ' Dose kalkulator ' dialogboksen.
      3. (valgfritt) Legg til ekstra test prøver ved å gjenta de forrige to trinnene. Også legge til flere eksempler samtidig ved å merke flere eksempler i den ' behandlet prøver i arbeidsområdet ' listen.
      4. (valgfritt) klikk på ' inndataverdi en FM-frekvens ' (Graphic 1) ikon å skrive inn en DC frekvens ikke forbundet med noen prøve hvis ønskelig - ny DC frekvensen vil bli lagt til den ' DC avvik for Dose estimering ' listen.
      5. (valgfritt) dobbel falle i staver det ' navn ' på en manuelt angitt FM-frekvens til å endre navnet.
      6. (valgfritt) høydepunkt riktig prøver og klikk ' fjerne FM-frekvens ' (Graphic 2) Ikon fjerne prøver som er lagt til den ' DC Avvik for Dose estimering ' listen feil.
    3. Klikk ' OK ' å lukke den ' Dose kalkulator ' og utføre dose estimering - resultatene er produksjon å konsollen.
    4. Som dose estimering vises i konsollen i tabellformat for hver test prøve, observere ' FM-frekvens ', ' SVM ', ' estimert Dose ' (inneholder beregnet biologiske dose av prøven i Gy), og ' brukt bildet utvalg Model ' felt.

5. Rapportering

Merk: måten du nevne en rapport og velg en katalog som lagres er felles for alle rapporttyper. A ' navn ' må angis. Når det genereres en rapport, opprettes en mappe som inneholder filene med dette navnet automatisk. Denne mappen blir plassert innenfor er de ' rapportmappen '. Som standard i ' rapportmappen ' er en katalog som heter ' rapporter ' finnes i datamappen som er angitt under installasjonen.

  1. -Eksempelrapport
    1. Klikk ' rapport ' i menylinjen og velg ' eksempelrapport ' å åpne den ' generere eksempelrapport ' dialogboksen.
    2. Inn et navn for rapporten i det ' navn ' tekstfelt. Klikk ' bla ' å endre det ' rapportmappen ' hvis ønskelig.
    3. Velg minst én behandlet prøve å være med i rapporten ved å plassere en hake ved siden av passende prøver av ' Velg prøver ' listen.
    4. Angir et utvalg av SVM Sigma verdiene for å generere DC distribusjon plott ved å velge verdier i ' Min ' og ' Max ' dropdown boksene i den ' distribusjon av DCs i prøve ' området. Utelate DC distribusjon tomter fra rapporten ved å fjerne den ' inkluderer ' boksen i den ' distribusjon av DCs i eksemplet ' området.
    5. Angir hvilke plott som inneholder filtrering statistikken skal tas med i rapporten ved å plassere merket ved passende tomter i den ' Velg tomter ' området. Klikk ' OK ' å generere rapporten.
  2. Kurve rapport
    1. Klikk ' rapport ' i menylinjen og velg ' kurve rapporten ' å åpne den ' generere kurve rapport ' dialogboksen.
    2. Inn et navn for rapporten i det ' navn ' tekstfelt. Klikk ' bla ' endre den ' rapportmappen ' hvis ønskelig.
    3. Velg minst en kurve skal tas med i rapporten ved å plassere en hake ved siden av aktuelle kurver i den ' Velg kurver i rapporten ' listen. Klikk ' OK ' å generere rapporten.
  3. Dose estimering rapport
    1. utføre dose estimering fremgangsmåten beskrevet i delen 4.
      Merk: Dose estimering rapporter genereres fra resultatene som er angitt i handlingen og konsollen. Dermed en dose estimering tomten må være tilstede i plotteområdet samtidig en rapporten genereres.
    2. Klikk ' rapport ' i menylinjen og velg ' Dose estimering rapport ' å åpne den ' Generer dose estimering rapport ' dialogboksen.
    3. Inn et navn for rapporten i det ' navn ' tekstfelt. Klikk ' bla ' endre den ' rapportmappen ' hvis ønskelig.
    4. Klikk ' OK ' å generere rapporten.

6. Overvåke evner

Merk: programvaren registrerer alle operasjoner utført under en økt i en loggfil. Programmet gir et tilbehør program som muliggjør loggfilene skal vises, søkte, brukes til å vurdere integriteten analysert og i noen tilfeller, å gjenopprette eksempeldataene fra ufullstendig eller tidlig avsluttet økter.

  1. Klikk ' å ' i menylinjen og velg ' se logger ' åpne stokk arkiv seer supplerende programvare.
  2. Sikre loggfiler vises i sidepanelet på venstre side av vinduet. Hvis ingen filer er synlig, klikker du ' fil ', velg ' Velg loggfilmappe ', og blar til en mappe som inneholder loggfiler.
  3. Dobbeltklikk navnet på en loggfil i sidepanelet for å vise Loggfilinnholdet i den ' seer ' kategorien
  4. Velg den ' søk ' kategorien og input søkeord søke en eller flere loggfiler.
    1. Input søkeparameterne hvis ønskelig i den ' fra ', ' til ', ' bruker ', ' lisens ', ' operasjonen ', og ' Parametere ' felt.
    2. Bruk glidebryteren for å velge den ' Max søkeresultater for hver fil '.
      Merk: Noen søk parametere, for eksempel brukernavn, vil returnere mange resultater i hver samsvarende loggfil. Denne parameteren begrenser antall søkeresultater vises i hver loggfilen.
    3. Sett en hake i den ' Søk bare understreket filer ' boksen (alle Logg søkes etter filer med standard) og høydepunkt loggfiler i sidepanelet for å søke bare et delsett av loggfilene.
    4. Sjekk det ' utfører Integritetskontroll ' boksen (aktivert som standard) å undersøke hver loggfilen som er kvalifisert til å søke etter feil relatert til en uventet programvare avslutning.
    5. Klikk ' søk ' å søke loggfiler og observere søk resultater på høyre side av vinduet.
    6. Klikk på ' vise loggfilen ' knappen ved siden av et søkeresultat for å markere og Vis angitt i den ' seer ' kategorien
  5. Logg filen integritetsproblemer
    1. Klikk på ' integritet ' kategorien for å vise feil funnet under integritetskontrollen (Hvis sjekken ble forespurt).
      Merk: Et søk må utføres for å undersøke loggfilene for integritetsproblemer. Utføre en Integritetskontroll uten søker loggfilene for eny søketermer, lar alle søkefelt parameteren svart i den ' søk ' kategorien, sikre det ' utfører Integritetskontroll ' er sjekket, og klikk ' søk '. Hvis integritetsproblemer finnes, den ' integritet ' kategorien bakgrunnsfargen blir red.
    2. Løse integritet problemer (utgang er gruppert etter loggfilen) mulig.
      Merk: For mer informasjon om fremgangsmåten for å løse integritetsproblemer med, se den elektroniske dokumentasjon 14.

7. Kurven og Dose estimering statistikk alternativer

  1. Klikk ' innstillinger ' i menylinjen og velg ' statistikk alternativer ' å åpne den ' statistikk alternativer ' dialogboksen.
  2. Velg en kalibreringskurve metoden (minste kvadraters eller maksimal sannsynlighet) fra dropdown-boksen.
  3. Sett et merke ved ' vise kalibrering kurve 95% CI, eventuelt ' vise 95% konfidensintervall når plotte en kalibreringskurven.
  4. Sett et merke ved ' Dose estimering beregner 95% CI på grunn av Poisson ' til å beregne 95% tillit grenser på dose estimater basert på Poisson av DC yield.
  5. Sett et merke ved ' Dose estimering beregner 95% CI på grunn av kurven, eventuelt ' til å beregne 95% tillit grenser på dose estimater basert på usikkerhet knyttet til kalibreringskurven.

Representative Results

Testing av programvaren ble gjennomført med metaphase kromosom bildedata HC og CNL. Blodprøver ble bestrålt av en XRAD-320 enhet (250 kV røntgenbilder, 12.5 mA, 2mm Al filtrering, dosehastighet: 0,92 eller 1,7 Gy/min) kalibrert med en ion kammer på HC og behandlet på begge laboratorier. Perifert blod lymfocytter prøver ble kultivert, fast og farget ved ifølge etablerte protokoller3,15. Metaphase bilder fra Giemsa-farget lysbilder ble tatt uavhengig av hver lab med et automatisert mikroskopi system. Eksperter i hvert laboratorium scoret DCs i flere av disse prøvene manuelt, bygget sin egen kalibrering kurver og anslått doser av test prøver av ukjent eksponeringer. En detaljert beskrivelse av disse datasett er gitt i tabell 1.

Fysisk Dose Formål HC forberedelse CNL forberedelse
Refererte navn antall bilder Refererte navn antall bilder
0 Gy Kalibrering HC0Gy 731 CNL0Gy 798
0,1 Gy Kalibrering HC01Gy 2162 NA NA
0,25 Gy Kalibrering HC025Gy 1826 NA NA
0,5 Gy Kalibrering HC05Gy 1054 CNL05Gy 1532
0,75 Gy Kalibrering HC075Gy 1233 NA NA
1 Gy Kalibrering HC1Gy 1566 CNL1Gy 841
2 Gy Kalibrering HC2Gy 1147 CNL2Gy 996
3 Gy Kalibrering HC3Gy 1212 CNL3Gy 1188
4 Gy Kalibrering HC4Gy 909 CNL4Gy 1635
5 Gy Kalibrering HC5Gy 1019 NA NA
3.1 Gy Test HCS01 540 CNLS01 500
2.3 Gy Test HCS08 637 CNLS08 500
1.4 Gy Test HCS10 708 NA NA
1.8 Gy Test HCS04 600 CNLS04 957
2.8 Gy Test HCS05 1136 CNLS05 1527
3.4 Gy Test HCS07 477 CNLS07 735

Tabell 1: Kilder av bildedata leveres av HC og CNL for evaluering av programvaren.
Fotnote: Endret fra tabell 1 Rogan et al., 20164. Bare manuelt forhåndsvalgte bildene var tidligere tilgjengelig for oss fra CNL. Ufiltrert bilder har blitt tilgjengelig og bilde teller oppdatert tilsvarende. I tillegg, nylig kjøpt HC prøver (0.25Gy, 0.75Gy og 5Gy) presenteres her.

Automatisk bildet utvalg i prøver

Bildekvaliteten er avgjørende for riktig DC gjenkjenning i DC analyse. Bildet utvalg av cytogenetic spesialister er vanligvis utført manuelt i konvensjonelle DC analyse. ADCI bruker kvantitative bilde kriterier for å velge automatisk bildene før DC frekvens beregning16. Brukere kan enten filtrere ut bilder basert på bestemte kromosom morphologies og/eller sortere cellene etter relative proporsjonene i lengder av objekter i henhold til kjente lengder cytogenetic-definerte grupper av kromosomer i en normal menneskelig karyotype (kalt den gruppe-bin avstand metode). Den tilgjengelige morfologiske filtre bruker hensyn til skalering terskler avvise celle bilder med ufullstendig kromosom sett eller flere metaphases, med prometaphase kromosomer, med fremtredende søster chromatid dissosiasjon, med svært bøyd og vridd kromosomer, med objekter som har glatt konturer karakteristisk for intakt kjerner, og de som færre objekter er anerkjent som kromosomer. Figur 3 (a) og (b) vise eksempler på valgte bilder, mens Figur 3 (c) og (d) er eksempler på bilder som filtreres av programvaren. Disse bildene er avledet fra sample HCS05 (beskrevet i tabell 1), og er valgt av den forhåndsdefinerte bilde utvalg modellen som rangerer alle bilder med gruppen bin avstand, så velger de beste 250 bildene. Kromosomer i Figur 3 (A), (b) er godt atskilt, og viser tilfredsstillende morfologi. Figur 3 (c) inneholder overdreven antall overlappende kromosom klynger. Figur 3 (d) viser alvorlige søster chromatid separasjon. Søster chromatids er helt atskilt for minst 8 av kromosomene centromeric constrictions er i de fleste andre kromosomene.


Figure 3
Figur 3: eksempler på Metaphase bilder i prøve HCS05 (forstørrelse: 63 X), både valgt og valgt av modellen 'Gruppe Bin avstand, topp 250 bilder'. (A) og (B) er valgte bilder. (C) og (D) er bilder som har blitt eliminert av modellen. (C) ble utelukket fordi den inneholdt for mange overlappende kromosomer, og (D) hadde overdreven antall atskilt søster chromatids. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Effekten av å bruke disse bildet utvalg modellene er tydelig ved å undersøke konfidenskoeffisienten for DC gjenkjenning i et utvalg. Forekomster av DCs i en populasjon av celler fra en bestrålt prøve følger en Poisson-fordelingen. Chi-kvadrat godhet av fit test sammenligner den observerte DC fordelingen til forventet tilpassing for Poisson-fordelingen. Modeller at riktig filter eksempeldata ha DC frekvenser ikke vesentlig forskjellig fra den forventede Poisson avledet verdier (vanligvis signifikansnivået > 0,01). Figur 4 viser DC forekomster og tilhørende passer til Poisson distribusjoner for HC4Gy utvalget av alle bilder vs bare bilder valgt av "gruppe bin avstand, øverste 250 bilder" modellen. Figur 4 (b) viser en bedre passer til Poisson-fordelingen. P-verdien (0,36) av det filtrerte settet med bilder betydelig høyere enn for ufiltrert DC fordelingen i Figur 4 (a). 5% eller 1% betydning nivåer, ufiltrert eksemplet i Figur 4 (a) er mindre pålitelige, fordi den inneholder lavere kvalitet DC data, som nullhypotesen Poisson fordelingen av DCs er avvist.

Figure 4
Figur 4: Skjermbilder av forholdsmessige DC frekvenser passer til Poisson Dstributions for eksempel HC4Gy i programvaren. (A) alle bilder er inkludert, (B) bare bilder valgt av modellen (gruppe bin avstand, 250 beste bilder) er inkludert. Legenden (øverst til høyre) viser statistikk for Tilpass til Poisson-fordelingen (spredning indeks, Mu test og Lambda) og chi-kvadrat godhet av fit test (p-verdi) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Dicentric kromosom (DC) oppdagelsen

Nøyaktig oppdagelse av DC er kritisk nødvendig behovet av ADCI. Riktig oppdaget DCs og de savnet av programvaren er henholdsvis definert som sann positive (TPs) og falske negative (FNs). Objekter som er ikke DCs, men feil oppdaget DCs, kalles falske positiver (FPs). FPs inkluderer monocentric kromosomer, kromosom fragmenter, atskilt søster chromatids, overlappende kromosom klynger og ikke-chromosomal objekter. Figur 5 viser resultatene av DC i to metaphase bilder. Objekter 1 og 3 er TPs, mens 4 er FP består av to atskilte monocentric kromosomene siamesiske langs armene kort. I figur 5 (a) objektet 2 var opprinnelig FP, men senere korrigert av FP filtre i programvaren. Objekt 5 og 6-objekt i figur 5 (b) er sannsynligvis eksempler på FNs.

Figure 5
Figur 5: Skjermbilder viser Metaphase kromosom klassifisering av potensielle DCs. (A) Et bilde i prøve CNL1Gy (forstørrelse: 63 X) viser 1 TP, objekt "1"; og 1 korrigert FP, objekt "2". (B) et bilde i prøve CNL4Gy (forstørrelse: 63 X) viser 1 TP, objekt "3"; 1 FP, objekt "4"; og 2 potensielle FNs, objekter "5" og "6". TPs, korrigert FPs, normal monocentric og Uklassifisert kromosomer er henholdsvis beskrevet med rød, gul, grønn og blå konturer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Dose estimering av Test prøver

Det endelige resultatet av ADCI analyser er dosen anslår av prøver avledet fra kalibrering kurver. Dose beregninger gjort av programvaren for testprøvene i tabell 1 angis i tabeller 2 og 3. Til sammenligning den fysiske stråledose utsendt og manuell scoret doser av eksperter på HC for prøver HCS01, HCS08 og HCS10 er angitt. Tilsvarende vises fysisk og manuell scoret doser av CNL eksperter for CNLS04, CNLS05 og CNLS07.

Figur 6 viser kalibrering kurver med stråling dose anslag for Health Canada biodosimetry laboratorium prøver HCS01, HCS08, HCS10, HCS04, HCS05 og HCS07. Kalibreringskurven genereres utvalg HC0Gy, HC1Gy, HC2Gy, HC3Gy og HC4Gy. Bildet utvalg modellen inneholder 3 Z-resultat-baserte filtre + "gruppe bin avstand, 250 beste bilder" brukes alle prøvene. Dose estimater sammen med tilknyttede statistiske analyser er vist i tabell 2.

Figure 6
Figur 6: Skjermbilde av Dose estimering av HC testprøvene. Svarte firkanter representerer kalibrering prøver. Bilder i test prøver og kalibrering prøver er valgt av modellen (3 FP filtre + gruppe bin avstand, øverste 250 bilder). Tykk prikkete representerer tilordningen av DCs/Metaphase gjennom kalibreringskurven til anslagsvis dose. Tynn prikkete angi øverst og 95% tillit grense for DCs/Metaphase. Fargekoder for testprøvene: rød, HC S01 (fysisk dose: 3.1Gy, HC utledes dose: 3.4Gy, ADCI: 3Gy); mørk grønn, HC S04 (fysisk dose: 1.8Gy, ADCI: 1.85Gy); lys blå, HC S05 (fysisk dose: 2.8Gy, ADCI: 2.95Gy); mørk blå, HC S07 (fysisk dose: 3.4Gy, ADCI: 2.35Gy); mørk rød, HC S08 (fysisk dose: 2.3Gy, HC utledes dose: 2.5Gy, ADCI: 2Gy); lys grønn, HC S10 (fysisk dose: 1.4Gy, HC utledes dose: 1.4Gy, ADCI: 0.95Gy). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Prøver Fysisk Dose HC utledes Dose ADCI anslått Dose Anslått Dose LCL Anslått Dose UCL P-verdi *
HCS01 3.1 3.4 3 2.3 3.8 0.117
HCS08 2.3 2.5 2 1.4 2.7 0.815
HCS10 1.4 1.4 0,95 0,5 1,55 0.211
HCS04 1.8 NA 1,85 1.25 2.55 0.0293
HCS05 2.8 NA 2,95 2,25 3,75 0.00354
HCS07 3.4 NA 2,35 1.7 3.1 0.0002

Tabell 2: Dose estimering resultatene av HC testprøvene.
Fotnote: Endret fra tabell 3 Rogan et al., 20164. ADCI dose estimater tidligere rapportert bygger på ufiltrert og montering kurve ble utført ved hjelp av minste kvadraters metode. Her kalibreringskurven var passer med metoden Maksimal sannsynlighet og en bildet utvalg modellen inneholder 3 FP filtre + "gruppe bin avstand, 250 beste bilder" ble brukt før dose estimering. Anslått dose UCLog LCL se dose estimat øvre og lavere 95% tillit grenser basert på Poisson natur DC avkastning. * Chi kvadrat godhet av fit teoretisk Poisson-fordelingen; NA: Resultatene av manuelt tiltenkt dose ble ikke oppgitt.

Stråledose estimater for prøver fra kanadiske kjernefysiske laboratorier CNLS04, CNLS05, CNLS07, CNLS01 og CNLS08 er vist i figur 7. Kalibreringskurven genereres utvalg CNL0Gy, CNL0.5Gy, CNL1Gy, CNL2Gy, CNL3Gy og CNL4Gy. Vi brukt en bildet utvalg modell som består av 6 FP filtre til alle prøvene. Resultatene med statistiske analyser vises i tabell 3.

Figure 7
Figur 7: Skjermbilde av Dose estimering av CNL testprøvene. Svarte firkanter representerer kalibrering prøver. Bilder i test prøver og kalibrering prøver er valgt med 6 FP-filtre. Tykk prikkete representerer tilordningen av DCs/Metaphase gjennom kalibreringskurven til anslagsvis dose. Tynn prikkete angi øverst og 95% tillit grense for DCs/Metaphase. Fargekoder for testprøvene: rød, CNL S04 (fysisk dose: 1.8Gy, CNL utledes dose: 1.7Gy, ADCI: 1.95Gy); mørk rød, CNL S05 (fysisk dose: 2.8Gy, CNL utledes dose: 2.7Gy, ADCI: 3.05Gy); lys grønn, CNL S07 (fysisk dose: 3.4Gy, CNL utledes dose: 3.1Gy, ADCI: 3.4Gy); mørk grønn, CNL S01 (fysisk dose: 3.1Gy, ADCI: 3.75Gy); blå, CNL S08 (fysisk dose: 2.3Gy, ADCI: 2.8Gy). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Prøver Fysisk Dose CNL utledes Dose ADCI anslått Dose Anslått Dose LCL Anslått Dose UCL P-verdi *
CNLS04 1.8 1.7 1,95 1.25 2.45 0.0545
CNLS05 2.8 2.7 3.05 2,75 3,35 0.325
CNLS07 3.4 3.1 3.4 3 3,75 0.473
CNLS01 3.1 NA 3,75 3,35 > 4 7.63E-11
CNLS08 2.3 NA 2.8 2,25 3.3 0.777

Tabell 3: Dose estimering resultatene av CNL test prøver.
Fotnote: Endret fra tabell 3, Rogan et al., 20164. ADCI dose estimater tidligere rapportert var basert på ufiltrert (HC) eller valgt manuelt (CNL) bilder og montering kurve ble utført ved hjelp av minste kvadraters metode. Her kalibreringskurven var passer med metoden Maksimal sannsynlighet og en bildet utvalg modellen inneholder 3 FP filtre + "gruppe bin avstand, 250 beste bilder" ble brukt før dose estimering. Anslått dose UCL og LCL, henholdsvis se dose anslagsvis øvre og lavere 95% tillit grenser basert på Poisson natur DC avkastning.
* Chi kvadrat godhet av fit teoretisk Poisson-fordelingen; NA: Resultatene av manuelt tiltenkt dose var ikke tilgjengelig.

Estimering av stråledose innen lineær kalibreringskurven (< 1 Gy) kan utføres med programvare, men en Sigma verdien av 1.0 anbefales er å redusere frekvensen av feilklassifiserte DCs (Figur 8).


Figure 8
Figur 8: Skjermbilder av to kalibrering kurver avledet fra HC kalibrering eksempler på forskjellige Sigma verdier. (A) HC kalibrering eksempler: 0Gy, 2Gy, 3Gy, 4Gy, og 5Gy på Sigma = 1.5. (B) HC kalibrering eksempler: 0Gy, 0.25Gy, 0.5Gy, 0.75Gy, 1Gy, 2Gy, 3Gy, 4Gy, og 5Gy bruker SVM Sigma = 1.0. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Disse analysene indikerer at det er små, men akseptabelt forskjellene mellom fysisk og biologisk tiltenkt dose tolket av eksperter og programvaren. Forskjellen mellom enten manuell eller estimering fra fysisk dose er referert til som "feil". Feil i den tiltenkte doser av prøver manuelt scoret av HC og CNL er ≤0.3 Gy. Automatisk behandling av programvaren er mindre nøyaktig enn eksperter, men generelt innenfor IAEA angitt triage ± 0,5 Gy3. For de fleste av testprøvene tabeller 2 og 3produsert programvaren riktige resultater innen denne terskelen. Men viser HCS07 og CNLS01 en dårlig godhet-av-fit for Poisson-fordelingen, antyder at det var potensielle problemer i bildet og DC kvalitet i prøvene som ikke ble løst ved bildet og FP utvalg modeller. P verdi betydning terskelen synes å være altfor strenge ved HCS05, der programvaren nøyaktig bestemt riktig dosering.

Discussion

Mulighetene og begrensningene i programvaren

Protokollen beskrevet i denne hvitboken introduserer typisk step-wise prosedyren brukes i ADCI importere og behandle cytogenetic metaphase bilder, opprette stråling kalibrering kurver, og beregne biologiske dose i enkeltpersoner eller prøver utsatt for ukjent stråling. Men er det ikke nødvendig å utføre instruksjonene sekvensielt. For eksempel mange test prøver av ukjent dose kan behandles og analysert ved hjelp av samme precomputed kalibreringskurven. Videre, når behandlingen er fullført, bildet utvalg og DC filtrering modeller kan være iterated av brukeren. Anvendelsen av en aktuelle bildet utvalg modell, avhenger av egenskapene og kvalitet av metaphase bildet, som igjen avhenger både på laboratoriet protokollen som brukes til å klargjøre celler og stringens kriteriet å merker celler med automatisert metaphase fange systemer. Kromosom morphologies vil variere mellom biodosimetry og cytogenetic laboratories, og dermed bildet utvalg modellene bør vurderes av brukeren for å finne ut om de forhåndsdefinerte bilde utvalg modellene leveres med programvaren vil være tilstrekkelig til å produsere nøyaktig dose anslag, eller om egendefinert modeller med brukerdefinerte terskler må opprettes. Basert på vår erfaring, er effektiviteten av bildet utvalg modeller påvirket av kilde- og kvaliteten på cellen bildene. Brukere kan designe sitt eget bilde utvalgskriterier bruker forskjellige kombinasjoner av filtre for å eliminere falske positive DCs og bildet utvalg modeller, og de tilsvarende terskelverdiene for å velge ønsket bilder. Det er fleksibilitet i input av kalibrering kurver og dose estimering, som koeffisientene til lineær-kvadratiske kurven og DC frekvenser kan endres eller manuelt angitt.

Selv om programvaren er helautomatisk, kan bilder manuelt gjennomgått og valgt. Denne funksjonen er tilgjengelig for å inkludere eller fjerne individuelt behandlet bilder gjennom funksjonen mikroskop seer i viktigste GUI. Likevel, på grunn av automatisering, programvaren er betydelig mer effektiv sammenlignet med manuell scoring av metaphase bilder og teller DCs. Et utvalg bestående av 1000 bilder kan behandles i 20 (tiff) til 40 (jpg) min på en flerkjerners arbeidsstasjon. Denne programvaren vil være spesielt nyttige i viktige eller arbeidskrevende situasjoner, for eksempel hendelser der flere personer har vært utsatt eller var mistenkt for å ha vært utsatt for stråling, eller hvor tidssensitiv diagnoser og behandling beslutninger er avgjørende.

Presis og nøyaktig høy gjennomstrømning påvisning av DCs samt dose estimering er nødvendig for uovervåket stråling vurdering. Andre tilgjengelige alternativer til programvaren oppfylle ikke begge disse kravene. En bruker-assistert, bildebaserte cytogenetic analyse (DCScore, Metasystems17) systemet krever manuell kontroll av kandidaten DCs, på grunn av en høy rate tilskrives uncorrected overlapper mellom kromosomer, og systemet ikke kan bestemme stråledose. DCScore ville ikke være så effektiv som ADCI i stråling hendelse som involverer en rekke potensielt utsatte individer. Stor blenderåpning mikroskop systemer kan samle bilder av flere metaphase celler18, men de analysere ikke dem. "CABAS"19 og "Dose estimat"20 programvare kan generere kalibrering kurver og anslag dose, men ikke scorer DCs. Andre biodosimetry analyser som ikke er basert på DC analyse inkluderer H2AX fluorescens, fluorescens i situ hybridisering med DNA sonder målrettet mot bestemte kromosomer, genekspresjon, micronucleus analysen, og urin og respiratoriske biomarkers. Disse metodene er mindre spesifikk og mindre sensitive for ioniserende stråling, kan være dyrere, i noen tilfeller, er mer tidkrevende og generelt ikke er standardisert over flere referanse laboratorier. De fleste av disse teknikkene ikke oppdager stabil stråling svar, så de ikke kan brukes for langsiktig vurdering (> 7 dager etter eksponering) av stråling dose. Derimot, dette kan vurdere individer opp til 90 dager etter eksponering og kan behandle dataene fra alle cytogenetics laboratorium mikroskop tenkelig system. Men hvis et utvalg er trukket > 4 uker etter eksponering, følsomheten reduseres på grunn av forfall dicentric avvik1,2,3 og programvare løser ikke foreløpig DC frekvenser for forsinkelser i utvalg utsatt individer.

Denne programvaren har noen begrensninger. Eksisterende bildet utvalg modeller velger mest akseptable metaphase bilder, men i noen tilfeller mislykkes å eliminere utilfredsstillende bilder, som kan redusere nøyaktigheten av DC. Det er fortsatt et åpent spørsmål hvordan du utformer et tilfredsstillende bilde utvalget modell som fjerner alle uegnet metaphase celler. Programvaren gir nøyaktig anslag for prøver utsettes for høyere strålingsdoser (≥ 2 Gy). Til tross for betydelig fremgang i å redusere antall falske positive DCs16, har objektene ikke blitt eliminert. Lavere kvalitet metaphase cellene på lav stråledose (spesielt < 1 Gy) er mer utsatt for falske positiver DC. Derfor ble lav dose prøver ikke inkludert når du genererer kalibreringskurven brukes for dose estimering av HC test prøver. Men hvis en kurve med lav dose prøver, en lavere verdi for SVM Sigma reduserer falske positive teller i lav dose prøver men kan resultere i lavere DC avkastning i høy dose prøver. Figur 8 sammenligner HC kurven brukes for dose estimering (Sigma = 1.5) med en kalibreringskurven passer med ekstra lav dose samples ved lavere SVM sigma verdi (1.0). I prøvene med utilstrekkelig antall metaphase celler og/eller dårlig kvalitet metaphase bilder, kan det ikke være mulig å nøyaktig beregne biologiske eksponeringer på lav dose, noe som kan resultere i avvik fra fysisk dose over 0,5 Gy.

Programvaren kan ikke nøyaktig vurdere stråling typer hvis dose-respons kurver best passer en lineær eller nær-lineær modell. Så langt, har det blitt testet bare med prøver X - og gammastråling. Hvis en annen strålingskilder er undersøkt, må brukerne sikre både kalibrering og test prøver er utsatt for samme type stråling. Programvaren bruker maksimal sannsynlighet eller minste kvadraters passende for å konstruere en dose-respons kurve ved hjelp av en lineær-kvadratiske modell. Det er for øyeblikket ingen mulighet til å innføre en streng lineær kurve, egnet for høy energi partikkel eksponeringer, men slik funksjonalitet vil være tilgjengelig i fremtiden.

Fremtidig utvikling

Våre pågående arbeid er fokusert på å forbedre bildet utvalg modeller og nøyaktig dose måling, spesielt av prøver utsettes for lave strålingsdoser. Etterfølgende programvareversjoner vil gi standardfeil målinger på dose estimater og tillit intervaller på kalibrering kurver. I tillegg er en høy-ytelse-computing versjon av programvaren for blå genet (BG/Q, IBM) superdatamaskinen under utvikling for rettidig evaluering av individer i en masse-havari stråling hendelse. Noen deler av programvaren er allerede testet og distribueres på denne plattformenlass = "xref" > 11.

Disclosures

PKR og JHMK etablert CytoGnomix, som er kommersialisere ADCI og relaterte patenter. YL og BCS er ansatte i CytoGnomix. ADCI er kopibeskyttet og metoden centromere lokalisering i ADCI er patentert (oss Pat. Nr. 8,605,981; Tyske Pat. Nei 112011103687).

Acknowledgments

Vi er takknemlige til Dr. Ruth Wilkins, Radiobiology og beskyttelse divisjon Health Canada, og Farrah Flegal, Canadian Nuclear laboratorier og deres laboratoriepersonell for tilgang til metaphase bildedata fra deres cytogenetic biodosimetry laboratories. Dette papiret ble støttet av en kontrakt fra bygge i Canada innovasjon Program CytoGnomix (Serienr. EN579-172270/001/SC). Den første versjonen av ADCI og utvikling av algoritmer ble støttet av Western Innovation fondet; Naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (NSERC Discovery Grant 371758-2009); US Public Health Service (DART-DOSE CMCR, 5U01AI091173-0); det kanadiske stiftelsen for innovasjon; Canada forskning stoler og CytoGnomix Inc.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated Dicentric Chromosome Identifier and Dose Estimator (ADCI) CytoGnomix NA ADCI software is released in a binary installation package file for Microsoft Windows 7, 8, 8.1 and 10; 235 Mb of disk storage are required for a typical installation. The software has been tested with Intel or AMD x86-64 processors; at least 1 Gb RAM is recommended. Analyses have been benchmarked on a computer configured with an Intel I7 processor and 16 Gb RAM. Operation of ADCI requires an active license and a USB-based hardware dongle, which must remain plugged in while the software is executing. The dongle encodes the software expiry date. Each time the software is started, this date is read. The software will allow access to the program if the current date and time precedes the expiration time-date stamp. Extending an expired software license can be accomplished by obtaining a new dongle or by renewing the license with an updated key at startup.
Digital images of metaphase cell nuclei Examples: Metasystems, Leica Microsystems M-Search (Metasystems), Cytovision (Leica) software High resolution TIFF format; typically >250 digital images generated with a microscope imaging capture system (minimum 63X magnification objective, 10X magnification ocular).
MSI Leopard Pro (recommended, optional) Micro-Star International MSI GP62 6QF 480CA Leopard Pro Multi-core performance workstation.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brewen, J. G., Preston, R. J., Littlefield, L. G. Radiation-Induced Human Chromosome Aberration Yields Following an Accidental Whole-Body Exposure to60 Co γ-Rays. Radiat Res. 49 (3), 647-656 (1972).
  2. Bender, M. A., Gooch, P. C. Persistent Chromosome Aberrations in Irradiated Human Subjects. Radiat Res. 16 (1), 44-53 (1962).
  3. INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY. Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies. , IAEA: Vienna. (2011).
  4. Rogan, P. K., Li, Y., Wilkins, R. C., Flegal, F. N., Knoll, J. H. M. Radiation Dose Estimation by Automated Cytogenetic Biodosimetry. Radiat Prot Dosimetry. 172 (1-3), 207-217 (2016).
  5. Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Knoll, J., Khan, W., Rogan, P. An image processing algorithm for accurate extraction of the centerline from human metaphase chromosomes. 2010 IEEE International Conference on Image Processing. , 3613-3616 (2010).
  6. Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Knoll, J., Khan, W., Rogan, P. An Accurate Image Processing Algorithm for Detecting FISH Probe Locations Relative to Chromosome Landmarks on DAPI Stained Metaphase Chromosome Images. 2010 Canadian Conference on Computer and Robot Vision. , 223-230 (2010).
  7. Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Rogan, P. K., Knoll, J. H. M. Intensity integrated Laplacian algorithm for human metaphase chromosome centromere detection. 2012 25th IEEE Canadian Conference on Electrical and Computer Engineering (CCECE). , 1-4 (2012).
  8. Li, Y., et al. Towards large scale automated interpretation of cytogenetic biodosimetry data. 2012 IEEE 6th International Conference on Information and Automation for Sustainability. , 30-35 (2012).
  9. Ranjan, R., Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Automatic Detection of Pale Path and Overlaps in Chromosome Images using Adaptive Search Technique and Re-thresholding. International Conference on Computer Vision Theory and Applications. , 462-466 (2017).
  10. Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Intensity Integrated Laplacian-Based Thickness Measurement for Detecting Human Metaphase Chromosome Centromere Location. IEEE Trans Biomed Eng. 60 (7), 2005-2013 (2013).
  11. Rogan, P. K., et al. Automating dicentric chromosome detection from cytogenetic biodosimetry data. Radiat Prot Dosimetry. 159 (1-4), 95-104 (2014).
  12. Li, Y., Knoll, J. H., Wilkins, R. C., Flegal, F. N., Rogan, P. K. Automated discrimination of dicentric and monocentric chromosomes by machine learning-based image processing. Microsc Res Tech. 79 (5), 393-402 (2016).
  13. Subasinghe, A., et al. Centromere detection of human metaphase chromosome images using a candidate based method. F1000Res. 5, 1565 (2016).
  14. Shirley, B. C., Li, Y., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Online manual for the Automated Dicentric Chromosome Identifier and Dose Estimator, Version 1.2. , Available from: http://adciwiki.cytognomix.com (2017).
  15. Wilkins, R. C., et al. Evaluation of the annual Canadian biodosimetry network intercomparisons. Int J Radiat Biol. 91 (5), 443-451 (2015).
  16. Liu, J., Li, Y., Wilkins, R., Flegal, F., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Accurate Cytogenetic Biodosimetry Through Automation Of Dicentric Chromosome Curation And Metaphase Cell Selection. F1000Research. 6, 1396 (2017).
  17. Schunck, C., Johannes, T., Varga, D., Lörch, T., Plesch, A. New developments in automated cytogenetic imaging: unattended scoring of dicentric chromosomes, micronuclei, single cell gel electrophoresis, and fluorescence signals. Cytogenet Genome Res. 104 (1-4), 383-389 (2004).
  18. Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. S. High-throughput sample processing and sample management; the functional evolution of classical cytogenetic assay towards automation. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2015, 132-141 (2015).
  19. Deperas, J., et al. CABAS: a freely available PC program for fitting calibration curves in chromosome aberration dosimetry. Radiat Prot Dosimetry. 124 (2), 115-123 (2007).
  20. Ainsbury, E. A., Lloyd, D. C. Dose estimation software for radiation biodosimetry. Health Phys. 98 (2), 290-295 (2010).

Tags

Genetikk problemet 127 Cytogenetics biodosimetry støtter vektor maskiner stråling bildeanalyser metaphase dose-respons bildesegmentering medisinske beredskapen yrkesmessig eksponering stråling sikkerhet
Rask stråling Biodosimetry automatisert for Dicentric kromosom identifikasjon (ADCI) og Dose estimering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shirley, B., Li, Y., Knoll, J. H.… More

Shirley, B., Li, Y., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation. J. Vis. Exp. (127), e56245, doi:10.3791/56245 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter