Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Fremskyndet stråling Biodosimetry automatiseret ved Dicentric kromosom identifikation (ADCI) og dosis estimering

doi: 10.3791/56245 Published: September 4, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Cytogenetisk dicentric kromosom (DC) analysen kvantificerer udsættelse for ioniserende stråling. Den automatiserede Dicentric kromosom id og dosis Estimator software skøn hurtigt og præcist biologiske dosis fra DCs i metafase celler. Det adskiller monocentric kromosomer og andre objekter fra DCs og skøn biologiske stråledosis fra hyppigheden af DCs.

Abstract

Biologiske strålingsdosis kan estimeres ud fra dicentric kromosom frekvenser i metafase celler. Udfører disse cytogenetisk dicentric kromosom assays er traditionelt en manuel, arbejdskrævende proces ikke velegnet til at håndtere mængden af prøver, som kan kræve undersøgelse i kølvandet af en masse casualty begivenhed. Automatiseret Dicentric kromosom id og dosis Estimator (ADCI) software automatiserer denne proces ved at undersøge sæt af metafase billeder ved hjælp af machine learning-baseret afbildning forarbejdningsteknik. De software vælger passende billeder i analyse ved at fjerne upassende billeder, klassificerer hvert objekt enten som en centromer-holdige kromosom eller ikke-kromosom, yderligere adskiller kromosomer som monocentric kromosomer (MCs) eller dicentric kromosomer (DCs), bestemmer DC frekvens i en prøve, og skøn biologiske strålingsdosis ved at sammenligne samplefrekvens DC med kalibreringskurverne er beregnet ved hjælp af kalibrering prøver. Denne protokol beskriver brugen af ADCI software. Typisk, både kalibrering (kendte dosis) og test (ukendt dosis) sæt af metafase billeder importeres til at udføre nøjagtig dosis skøn. Optimale billeder for analyse kan findes automatisk ved hjælp af forudindstillede billede filtre eller kan også blive filtreret gennem manuel kontrol. Softwaren behandler billeder i hver prøve og DC frekvenser er beregnet på forskellige niveauer af strenghed for at kalde DCs, ved hjælp af en maskine lære tilgang. Lineær-kvadratisk kalibreringskurverne genereres baseret på DC frekvenser i kalibrering prøver udsat for kendte fysiske doser. Doser af prøveemner, udsat for usikre strålingsniveauer er anslået fra deres DC frekvenser ved hjælp af disse kalibreringskurver. Rapporter kan oprettes efter anmodning og give Resumé af resultaterne af en eller flere prøver, én eller flere kalibreringskurverne eller dosis skøn.

Introduction

Stråling biodosimetry bruger biologiske markører, for det meste kromosomforandringer som dicentric kromosomer (DCs) og kromosom omplantninger til at måle strålingsdoser, at individer er udsat for. En biologisk absorberede dosis kan være forskellig fra den fysiske dosis målt af instrumenter som følge af variabiliteten mellem enkeltpersoner. Tilsvarende kan stråling af en visse fysiske dosis producere forskellige biologiske engagementer, der skyldes underliggende fysiologiske eller miljømæssige forhold. Kendskab til de biologiske dosis er af særlig betydning for både diagnose og behandling.

DC assay er guldstandarden af World Health Organization (WHO) og Internationale Atomenergiagentur (IAEA) for at vurdere biologisk stråling i mennesker. Det var første analysen anbefalet af IAEA og der for stråling dosis vurdering. DC frekvens er relativt stabilt for ca. 4 uger efter stråling eksponering1 og deres kvantitative korrelation med udsendte stråledosis er præcis, som gør DCs den ideelle biomarkør. Forholdet mellem strålingsdosis (refereret i grå [Gy] enheder) og DC frekvens (henvises til som antallet af DCs pr. celle) kan udtrykkes som en lineær-kvadratisk funktion.

Cytogenetisk DC analysen har været branchens standard for omkring 55 år2. Det er udført manuelt, der kræver 1-2 dage til at analysere mikroskop data fra en enkelt blodprøve. Flere hundrede til flere tusinde billeder er nødvendige for at præcist skøn stråling afhængig af dosis3. Ved doser over 1 Gy, anbefaler IAEA mindst 100 DCs påvises. Undersøgelse af 250-500 metafase billeder er almindelig praksis i biodosimetry cytogenetisk laboratorier. For prøver med engagementer < 1 Gy, 3.000-5.000 billeder er foreslået på grund af de lavere sandsynligheder for DC dannelse. I begge tilfælde er det en labor-intens hverv.

Cytogenetisk biodosimetry laboratorier oprette deres egen in vitro- stråling biodosimetry kalibreringskurverne før vurderingen af biologiske doser i analyseprøverne. Blodprøver fra normal, kontrol personer udsættes for stråling og lymfocytter er derefter kulturperler og forberedt til metafase kromosomanalyse. Ved hjælp af disse prøver, er biologiske doser modtaget kalibreret til de kendte fysiske doser udsendes af en standard lyskilden. Efter at metafase celle billeder er optaget, eksperter undersøge billeder, tælle DCs og beregne DC frekvenser for hver prøve. En kalibreringskurve er bygget ved at montere en lineær-kvadratisk kurve til DC frekvenser på alle doser. Derefter, engagementer i prøven fra enkeltpersoner kan udledes ved at matche DC frekvenserne til de kalibrerede doser på kurven eller ved at angive dem i den tilsvarende lineære kvadratiske formel.

Vi har Automatiseret påvisning af DCs og dosis vilje til at fremskynde denne procedure ved hjælp af software. Automatiseret Dicentric kromosom id og dosis Estimator (ADCI) bruger maskinen læring-baseret billed oparbejdelse teknikker til at opdage og diskriminerer dicentric kromosomer (DCs) fra monocentric kromosomer (MCs) og andre objekter og automatiserer stråling dosis skøn. Programmet sigter mod at betydeligt reducere eller eliminere behovet for manuel kontrol af DC tæller og fremskynde dosis skøn gennem automatisering. Det er blevet udviklet med inddragelse af biodosimetry laboratorier på Health Canada (HC) og canadiske nukleare laboratorier (CNL). Deres feedback vil sikre, at ydeevnen vil fortsat opfylde IAEA kriterier for denne analyse.

Softwaren udfører følgende funktioner: 1) filtrering DCs og valg af optimale metafase celle billeder til analyse, 2) kromosom anerkendelse, DC opdagelse og DC frekvens bestemmelse, og 3) estimering stråledosis fra dosis-kalibreret, cytogenetisk stråling data. Denne software behandler grupper af metafase billeder fra den samme individuelle (kaldes en prøve), tæller antallet af DCs i hver bruger image databehandling, og returnerer den anslåede strålingsdosis modtaget af hver prøve i enheder af grå (Gy).

Softwaren er blevet designet til at håndtere en række kromosom strukturer, tæller og tætheder. Men algoritmen, der udfører optimalt i metafase aftryk indeholdende en i nærheden af komplet supplement af godt adskilt, lineær kromosomer4. Billeder, der indeholder yderst overlappende sæt af kromosomer, flere celler, ufuldstændige metafase celler, søster chromatid adskillelse, kerner, ikke-kromosomale objekter og andre defekter kan reducere nøjagtigheden af algoritmen. Dedikeret billede valg modeller og andre objekt segmentering tærskler kan bortfiltrere fleste sub-optimale billeder og falsk positive DCs.

Dicentric kromosom detektion udføres, når et billede behandles. Algoritmen forsøger at afgøre, hvilke objekter i et billede er kromosomer og så lokaliserer de to regioner, der er mest sandsynligt at være centromeres på hvert kromosom. Derefter, en serie af forskellige støtte vektor maskine (SVM) læring modeller skelne kromosomer som enten DCs eller normal, monocentric kromosomer. SVM modeller varierer i følsomheden og specificiteten af DC opdagelse (Se trin 3.1.4 nedenfor), som kan påvirke de DC frekvenser, der bestemmes i en prøve.

ADCI processer sæt af Giemsa - (eller DAPI-) farvede metafase digitale billeder (i TIFF eller JPG format) for en eller flere prøver. Programmet analyserer DCs i både kalibrering prøver og prøveemner. De fysiske doser (i Gy) af kalibrering prøver er kendt og anvendes i generation af en kalibreringskurve. De fysiske og biologiske doser af personer med ukendte engagementer er udledes af software fra maskin-genereret kalibreringskurven. Selv om laboratorier anvender sammenlignelige teknikker, varierer kalibreringskurver fra forskellige laboratorier ofte3. Begge kalibrering kurve og test prøver fra samme laboratorium skal behandles til nøjagtig dosis estimering i analyseprøverne.

Denne software tilbyder hastighed, nøjagtighed og skalerbarhed som adresser produktivitet forpligtet til at håndtere en begivenhed, hvor mange personer skal samtidig afprøves. Det var udviklet fra 2008-20174,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Ved hjælp af de seneste computerhardware, dette desktopPC-software kan behandle og skøn strålingsdosis i en patient prøve 500 metafase genom ækvivalenter i 10-20 min. 4. Koden er baseret på et sæt af proprietære billedsegmentering og machine learning algoritmer til kromosomanalyse. Ekspert analyse af hvert kromosom udsat til 3 Gy stråling gav sammenlignelige nøjagtigheder til ADCI. I et sæt af 6 prøver af ukendte engagementer (tidligere anvendte i en internationale færdighed øvelse), anslået softwaren doser inden for 0,5 Gy af de værdier, der er fremstillet ved manuel gennemgang af de samme data af HC og CNL, opfylder IAEAS krav til triage biodosimetry. Derudover skøn sammenlignende standardisering og i sidste ende reproducerbarhed af dosis drage fordel af at have en fælles, automatiseret DC scoring algoritme. Ikke desto mindre, softwaren tillader tilpasning af billede filtrering og udvælgelse kriterier, gør det muligt for forskelle i kromosom præparationsmetoder og kalibrering strålekilder skal tages i betragtning.

Denne software er en grafisk brugergrænseflade (GUI) - baseret system, som analyserer sæt af kromosom aftryk indeholdende Giemsa (eller DAPI) - farves metafase dataceller ved abnormaliteter, der skyldes udsættelse for ioniserende stråling. Billede sæt er digitalt fotograferet med en lys (eller epifluorescerende) mikroskop system og hvert sæt svarer til en anden prøve. Softwaren benytter billedbehandling teknikker til at opdage og diskriminere DCs fra MCs og andre objekter. Empirisk afledte segmentering filtre derefter fjerne automatisk falsk positive DCs uden at påvirke sande DCs. Endelig, programmet automatisk filtrerer uønskede billeder baseret på forskellige egenskaber for billede fundet dårlig kvalitet metafase billeder med precomputed (eller bruger-specificeret) billede valg modeller. Disse billeder omfatter dem, der indeholder overdreven eller utilstrækkelige antal "støjende" objekter, flere overlappende kromosomer, billeder mangler metafase kromosomer, overdreven numre af Søster kromatider4. Automatisk kurateret billeddata, der bruges til at generere dosis kalibreringskurven fra prøver af kendte stråledosis og bruges til at beregne engagementer af prøveopløsninger udsat for ukendte doser.

Output af softwaren kan ses og gemt som: 1) tekst-baseret produktion set i konsollen, 2) plots, som kan gemmes som billeder og 3) rapporter i HTML-format. Mange aspekter af softwaren kan tilpasses til de specifikke behov af forskellige laboratorier. Enkelte laboratorier giver normalt både kalibrering og test prøver forberedt og indsamlet baseret på cytogenetisk protokollen valideret på dette laboratorium. Dette fastholder ensartethed til forberedelse af prøven og giver kalibreringskurverne genereret fra kalibrering prøver anvendes meningsfuldt for at teste prøver fremstillet ved hjælp af den samme protokol. Kalibreringskurverne kan også oprettes fra enten kurve koefficienter eller DC frekvenser på definerede doser. De mest præcise skøn over doser opnås ved at frafiltrere lavere kvalitetsbilleder og falsk positive DCs (FPs). Valg af optimal billede delmængder inden for hver prøve er udført ved hjælp af 'Billede valg modeller', der eliminerer subpar billeder, som har tendens til at indføre FPs. En serie af forud validerede modeller er inkluderet i softwaren, men yderligere modeller med tilpassede tærskler og filtre kan oprettet og gemt af brugeren.

Når softwaren held belastninger, de vigtigste grafiske brugergrænseflade (GUI) præsenteres (Se figur 1). Fra denne grænseflade, prøver, hver består af en mappe i metafase celle billedfiler, kan være udvalgt og behandlet for at identificere DCs kalibreringskurverne kan skabt og sammenlignet og eksponering strålingsdosis prøver kan bestemmes.

Figure 1
Figur 1: Den store sektorer af det grafiske bruger Interface omfatter: en liste over prøver (1), en liste over kalibrering kurver (2), processen kø (3), som overvåger status for DC påvisning i hvert sæt af billeder af hver prøve, et plot display (4), som opsummerer statistiske eller andre kvantitative egenskaber af et sæt af billeder i prøver eller kalibreringskurverne og en konsol (5) , som indeholder beskrivende tekst som output for hver operation, som udføres af programmet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

1. import og processen prøver

  1. Klik ' prøver ' i den menu advokatstanden og sluttet ' ny prøve '. Find en passende mappe, der indeholder en gruppe af metafase billeder og klik på ' skal du vælge mappen '.
  2. Skriv et entydigt ID for prøven inden for den ' Angiv et entydigt ID for den nye prøve ' tekstfelt. Dette ID vil identificere prøven i arbejdsområdet. Prøve-id'er skal indeholde alfanumeriske, ' _ ', eller '-' kun af tegn. Inddragelse af kilde-laboratorium og fysiske dosis (for kalibrering prøver) i prøven ID vides.
  3. (Valgfrit) Angiv en beskrivelse af prøven, hvis det ønskes inden for den ' beskrivelse af prøven (valgfrit) ' tekstområdet.
  4. Klik ' OK ' at tilføje den nye prøve til arbejdsområdet.
  5. Gentag trin 1.1 til 1.4 tilføje yderligere prøver. Oprette et minimum af 3 kalibrering prøver (syv eller flere anbefales 3 forskellige engagementer) og mindst én prøve at udføre dosis estimering.
  6. Fremhæve alle prøver har oprettet i trin 1,1 til 1,5 i den ' prøver ' liste og klik på ' tilføje stikprøveudvælgelsen til processen kø ' (Graphic 5) ikonet.
  7. Klik ' behandle alle prøver i køen ' (Graphic 6)-ikonet for at behandle alle prøver sekventielt i kø - en ' ADCI forarbejdning ' dialogboks, der indeholder alle prøver i kø sammen med et fremskridt bar
  8. Når alle prøver har afsluttet behandlingen, klik på den Graphic 9. Gemme prøver nu, eller klik på ' gemme en forarbejdede prøve til en ADCI eksempelfilen ' (Graphic 7) ikon hen til opspare en forarbejdede prøve senere.

2. visning og valg af billeder (valgfri, anbefales Step)

Bemærk: dette trin beskriver brugen af metafase Image Viewer og oprettelsen af et image valg model. Nogle validerede billede valg modeller er inkluderet i softwaren, som kan bruges i kalibrering kurve generation og dosis skøn. Således, dette trin er ikke påkrævet, men det kan bruges som en guide, der beskriver nødvendige skridt til at gøre dette hvis det ønskes.

  1. Fremhæve en prøve inden for de ' prøver ' liste, skal du klikke på ' prøver ' i menuen bar, og vælg ' billedvisning ' at åbne den ' metafase Image Viewer ' .
  2. Navigering blandt billeder
    1. skal du vælge et billede fra dropdown boksen at se et bestemt billede. Klik på ikonerne for venstre og højre piletasterne til at rulle gennem billeder.
    2. Vælg en SVM Sigma værdi fra dropdown boksen at se DC opdagelse resultater på denne Sigma værdi. Vælg " Unprocessed " fra dropdown boksen at se raw-billeder uden kromosom konturer.
    3. Tjek den ' invertere ' afkrydsningsfeltet for at invertere farven og lysstyrken værdier for hver pixel i billedet.
  3. Check den ' billedet i overvågningsliste ' afkrydsningsfelt for at føje det synlige billede til en ' overvågningsliste '. Klik på ' gemme the uret listen til en tekstfil ' (Graphic 3) ikon hen til gemme navnene på alle billeder i uret listen til en tekstfil.
  4. Billede valg modeller
    1. Klik ' Se alle billeder ' (standardindstillingen) til at omfatte alle billeder i billedet udvalg dropdown boks. Observere teksten støder op til ' billeder inkluderet ' at opdage brøkdel af billeder udvalgt af den aktuelt anvendte billede valg model.
    2. Klik ' Se inkluderet billeder ' at medtage kun disse billeder, som ikke er blevet udelukket af modellens billede valg i dropdown boksen.
    3. Klik ' Se udelukket billeder ' at medtage billeder, som er blevet udelukket af modellen anvendt afbildning valg i dropdown boksen.
    4. Check den ' udelukke ' afkrydsningsfeltet manuelt udelukke et enkelt billede.
      Bemærk: Gendannes manuelt udelukkede billeder til det valgte billede, hvis et billede valg model anvendes efterfølgende.
    5. Gemme et udvalg af billeder ved at klikke på den ' Gem markering i ' knappen. Angiv et filnavn til de gemte markering når du bliver spurgt. Klik på ' indlæse udvalg ' at anvende en tidligere gemt markering.
    6. Klik ' anvende billede filtre ' at åbne den ' Anvend Filter-baserede Image valg Model til nuværende prøve ' dialog, som skaber, gemmer, eller gælder kriterierne for udvælgelse af metafase billeder i en stikprøve.
    7. Vælg en billede valg model på listen forudfyldes. Klik på ' OK ' at anvende den aktuelle model.
    8. Indtast en beskrivelse til en ønskede nye model, definerer ' billede udstødelse filtre ', definere ' billede placering og integration ', og klik på ' Gem markering Model ' til at oprette et billede Valg af Model.
      Bemærk: Definitioner af ' billede placering og integration ' metoder og hver ' billede udstødelse Filter ' kan findes i softwaren onlinedokumentationen 14.

3. Kurven Generation

  1. (Recommended optional step) kurve Calibration Wizard
    1. at sikre et minimum af tre kalibrering prøver findes i arbejdsområdet, før du fortsætter. Klik på ' guider ' i den menu advokatstanden og sluttet ' kurve kalibrering ' at åbne kurve Calibration Wizard.
      Bemærk: Selvom kun tre prøver er matematisk forpligtet til at passe og beregne en kalibreringskurve, anbefalede syv eller flere prøver der spænder over en række engagementer mellem 0 og 5 Gy. De yderligere prøver er nødvendige for at passe kalibreringskurven til en lineær-kvadratisk dosis svar, men den optimale Sigma værdier kan være lavere for at opnå kurver, der er anvendelige til lav dosis skøn (< 1 Gy); den optimale Sigma værdier for doser over denne tærskel er forskellige (Se trin 3.1.4).
    2. Fortsæt gennem guiden indledende skærmen og Placer et hak ved siden af hver ønskede kalibrering prøve. For hver kalibrering prøve markeret på denne måde, angive den fysiske dosis (i Gy) stikprøven blev udsat for inden for dets tilstødende tekstfelt. Fortsætte til det næste skærmbillede i guiden.
    3. Vælg en billede valg model hvis det ønskes fra listen over modeller indeholder forudindstillede billede valg modeller bundlet med software ud over enhver manuelt oprettede modeller. Fortsætte til det næste skærmbillede i guiden.
    4. Vælg en SVM Sigma værdi fra dropdown boksen. Fortsætte til det næste skærmbillede i guiden .
      Bemærk: En SVM Sigma værdi på 1.4 eller 1.5 anbefales for dosis anslår > 1 Gy, og en værdi på 1,0 til skøn under 1 Gy ( figur 2).
    5. Gennemgå alle tidligere valg på oversigtsskærmen, og klik ' Finish ' at fuldføre guiden, forårsager en prepopulatEd ' oprette en kurve ' dialogboks vises.

Figure 2
figur 2: visualisering af effekten af at ændre SVM Sigma værdi fra algoritme af sandt Positive (TP) og falsk positiv (FP) DC tæller, positiv prædiktiv Calue (PPV), og sandt Positive kurs (TPR). venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Opret en kurve dialog.
    1. (Spring dette trin, hvis guiden blev brugt) Klik på ' kurver ' i den menu advokatstanden og sluttet ' nye kurve '. Vælg ' montering kurve til dosis-respons-data ' fra dropdown boksen præsenteret i dialogboksen og klik ' OK '.
    2. Angiv et entydigt id til kurven i den ' Angiv et entydigt id for den nye kurve ' tekstboks inden for den ' opretter en kurve ' dialogboksen.
    3. (Valgfrit) Type en beskrivelse for den nye kurve inden for den ' tilføje en kort beskrivelse af kurven skal oprettes ' tekstboks.
    4. (Spring over følgende trin Hvis guiden kurve blev brugt til at oprette en kalibreringskurve) angive kurve værdier.
      Bemærk: Guiden kurve kalibrering beskrevet taktfast 3.1 udfylder felterne i den ' opretter en kurve ' dialog. Nedenstående fremgangsmåde beskriver, hvordan du manuelt udfylde disse felter. Hvis guiden blev brugt, skal nogle nedenstående trin kan stadig følges, hvis det ønskes, tilføje eller fjerne yderligere data.
      1. Vælg en SVM Sigma værdi indstillinger i den ' SVM ' dropdown boksen - det anbefales stærkt, at Sigma værdien valgt her svarer til Sigma værdien valgt når ved hjælp af denne kurve til at udføre dosis estimering.
      2. (Valgfrit) Angiv en billede valg model ved at klikke på den ' angive fil ' knap.
      3. Klik ' Input ' at tilføje en ny tom post til listen dosis-respons under overskriften ' Input respons-dosis data til at oprette en kurve '.
      4. Indtast dosis af en kalibrering prøve i Gy under overskriften ' dosis '.
      5. Enter ' svar (DC/celle) ' drages eksempeloutput i konsollen, når en stikprøve er fremhævet. Find passende DC/celle værdien for det tidligere valgte SVM Sigma værdi inden for konsollen eller fra tilsvarende sample rapport (trin 5.1, hvis den er tilgængelig), og skriv det i feltet.
      6. Gentag de forrige tre trin, indtil alle kalibrering prøver er blevet tilføjet.
    5. Presse ' validere Data ' for at sikre, at indholdet af svar-dosis liste er formateret korrekt – kontrollere alle felter i listen svar-dosis er fremhævet grøn angiver gyldige data.
    6. Tryk ' OK ' at færdiggøre oprettelsen af kurven. At gemme den nye kurve i den ' Gem kurve? ' dialogen som vises ved at trykke på ' OK '. Eller klik ' Gem kurve til en ADCI kurve fil ' (Graphic 4) ikonet fremhævet i den ' kurver ' liste senere.

4. Dosis vurdering

  1. (Recommended optional step) dosis skøn Wizard
    1. Klik ' guider ' i den menu advokatstanden og sluttet ' dosis skøn '.
    2. Fortsæt gennem indledende guideskærmbilledet, og vælg en tidligere oprettet kalibreringskurven fra dropdown boksen - dens egenskaber vises nedenfor. Fortsætte til det næste skærmbillede i guiden.
    3. Placer et hak ved siden af prøver af ukendt eksponering at medtage dem i dosis vurdering. Fortsætte til det næste skærmbillede i guiden.
    4. Overholde beskrivelse og egenskaber af modellens billede udvælgelse anvendes under kalibrering kurve generation. Iagttage, at den samme billede valg model anvendes til de valgte analyseprøverne. Fortsætte til det næste skærmbillede i guiden.
      Bemærk: Nedenstående beskrivelse af modellens billede udvælgelse, den samme model er udfyldt på forhånd og vil blive anvendt til udvælgelse klargjorte prøver. Anvende den samme billede valg model til kalibrering og teste prøver. Mens det er muligt at anvende forskellige billede valg modeller ved at vælge en anden model fra dropdown, det anbefales ikke.
    5. Vælg en SVM Sigma værdi fra rullemenuen. Fortsætte til det næste skærmbillede i guiden.
      Bemærk: SVM Sigma værdi bruges under kalibrering kurve generation er udfyldt på forhånd. Det anbefales, at denne værdi forbliver uændrede.
    6. Gennemgå de tidligere valg på Resumé skærmen og klik på ' Finish ' at fuldføre guiden - en forudfyldes ' dosis regnemaskine ' dialogboks vises.
  2. Dosis regnemaskine
    1. (Spring dette trin, hvis guiden blev brugt) fremhæve en kalibreringskurve fra listen over kurver under overskriften ' kurver ', klik på ' kurver ' i menuen bar, og vælg ' Beregne dosis ' at åbne den ' dosis regnemaskine ' dialogboks.
    2. (Springe disse trin Hvis guiden blev brugt) angive værdier for dosis estimering.
      Bemærk: Guiden dosis skøn beskrevet taktfast 4.1 udfylder felterne i den ' dosis regnemaskine ' dialog. Nedenstående fremgangsmåde beskriver, hvordan du manuelt udfylde disse felter. Hvis guiden blev brugt, skal nogle nedenstående trin kan stadig følges, hvis det ønskes, tilføje eller fjerne yderligere data.
      1. Klik ' Brug stikprøveudvælgelsen i arbejdsområdet til at fylde DC frekvenser ' (Graphic 8) ikon og Fremhæv teste prøver inden for den ' behandlet prøver i ADCI Arbejdsområdet ' listen for at føje de valgte prøver med den ' DC frekvenser for dosis skøn ' listen.
      2. Vælg en SVM Sigma værdi og image valg model for disse prøver fra boksene dropdown.
        Bemærk: En SVM Sigma værdi svarer til Sigma værdi bruges i kalibrering kurve generation er nødvendig for nøjagtig dosis skøn. Sigma værdien forbundet med kalibreringskurven er listet i bunden af den ' dosis regnemaskine ' dialogboks.
      3. (valgfrit) Tilføj yderligere test prøver ved at gentage de forrige to trin. Alternativt kan du tilføje flere prøver samtidig ved at fremhæve flere prøver i de ' behandlet prøver i arbejdsområdet ' listen.
      4. (valgfri) Klik på den ' inputværdi en DC frekvens ' (Graphic 1) ikon hen til manuelt at indtaste et DC frekvens ikke forbundet med nogen prøve, hvis det ønskes - den nye DC frekvens vil blive føjet til den ' DC afvigelser for dosis vurdering ' listen.
      5. (valgfrit) runde falde i hak den ' navn ' felt af en manuelt angivne DC frekvens til at ændre sit navn.
      6. (valgfrit) Fremhæv relevante prøver og klik ' fjerner DC frekvens ' (Graphic 2) ikon hen til ophæve prøver, der er blevet tilføjet til den ' DC Afvigelser for dosis vurdering ' liste i fejl.
    3. Klik ' OK ' til at lukke den ' dosis regnemaskine ' og udføre dosis skøn - resultater er output til konsollen.
    4. Som dosis skøn resultater vises i konsollen i tabelformat for hver prøve, observere ' DC frekvens ', ' SVM ', ' anslåede dosis ' (indeholder den anslåede biologiske dosis af prøven i Gy), og ' anvendes billede valg Model ' felter.

5. Rapportering

Bemærk: metoden bruges til at navngive en rapport og vælg et bibliotek, hvor det er gemt er fælles for alle rapporttyper. A ' rapportnavn ' skal oplyses. Når en rapport er oprettet, oprettes en mappe, der indeholder rapportfiler benytter dette navn automatisk. Dette register vil blive placeret inden for er den ' betænkning mappen '. Som standard, den ' rapportmappe ' er en mappe med navnet ' rapporter ' fundet i datamappen angivet under installationen.

  1. Sample rapport
    1. Klik ' rapport ' i den menu advokatstanden og sluttet ' Sample rapport ' at åbne den ' generere eksempelrapport ' dialogboksen.
    2. Angiv et navn til rapporten i den ' rapportnavn ' tekstfelt. Klik på ' Browse ' til at ændre den ' rapportmappe ' hvis det ønskes.
    3. Mindst én forarbejdede stikprøve skal medtages i rapporten ved at placere et flueben ved siden af passende prøver i den ', udtage ' listen.
    4. Angiver en vifte af SVM Sigma værdier for at generere DC distribution parceller ved at vælge værdier i ' Min ' og ' Max ' dropdown kasser inden for den ' Distribution af DCs i prøve ' område. Udelukke DC distribution parceller fra rapporten, hvis det ønskes af unchecking den ' omfatter ' checkhæfte i den ' Distribution af DCs i prøve ' område.
    5. Angiver hvilke parceller der indeholder filtrering statistikker skal medtages i rapporten ved at sætte flueben ved siden af passende grunde i den ' Vælg parceller ' område. Klik på ' OK ' til at generere rapporten.
  2. Kurve rapport
    1. Klik ' rapport ' i den menu advokatstanden og sluttet ' kurve rapport ' at åbne den ' generere kurve rapport ' dialogboksen.
    2. Angiv et navn til rapporten i den ' rapportnavn ' tekstfelt. Klik på ' gennemse ' til at ændre den ' rapportmappe ' hvis det ønskes.
    3. Vælg mindst én kurve skal medtages i rapporten ved at placere en markering ud for passende kurver i den ' Vælg kurver skal medtages i rapporten ' liste. Klik på ' OK ' til at generere rapporten.
  3. Dosis skøn rapport
    1. udføre dosis skøn trin, der beskrives i afsnit 4.
      Bemærk: Dosis skøn rapporter er genereret ud fra de resultater, der er angivet i områderne plot og konsol. Således, en dosis skøn plot skal være til stede i afbildningsområdet på det tidspunkt, en rapport genereres.
    2. Klik ' rapport ' i den menu advokatstanden og sluttet ' dosis skøn rapport ' at åbne den ' Generer dosis skøn rapport ' dialogboksen.
    3. Angiv et navn til rapporten i den ' rapportnavn ' tekstfelt. Klik på ' gennemse ' til at ændre den ' rapportmappe ' hvis det ønskes.
    4. Klik ' OK ' til at generere rapporten.

6. Audit Capabilities

Bemærk: softwaren registrerer alle operationer udføres under en session i en logfil. Programmet giver en tilbehør softwareprogram, der giver logfiler skal ses, søgte, bruges til at evaluere integriteten af en analyse og i nogle tilfælde, at genoprette prøve data fra ufuldstændig eller for tidligt afsluttes sessioner.

  1. Klik ' hjælpe ' i den menu advokatstanden og sluttet ' Se logfiler ' hen til lukke op den log fil viewer supplerende software.
  2. Sikre logfiler er angivet i indholdsoversigten i venstre side af vinduet. Hvis ingen filer er synlige, skal du klikke på ' fil ', vælge ' Vælg logfilmappe ', og gå til en mappe, der indeholder logfiler.
  3. Skal du dobbeltklikke på navnet på en logfil i indholdsoversigten til Se log filindhold i den ' fremviser ' tab.
  4. Vælg den ' Søg ' fanen og input søgeord til at søge en eller flere logfiler.
    1. Input søgeparametre hvis det ønskes i den ' fra ', ' til ', ' bruger ', ' licens ', ' Operation ', og ' Parametre ' felter.
    2. Brug skyderen til at vælge den ' Max Søg resultater for hver fil '.
      Bemærk: Nogle søgeparametre, såsom username, returnerer mange resultater i hver enkelt matchende logfil. Denne parameter begrænser antallet af søgeresultater vises i hver logfil.
    3. Placer et hak i den ' Søg kun fremhævet filer ' afkrydsningsfeltet (alle log filer der søges som standard) og Fremhæv logfiler i indholdsoversigten til Søg kun en delmængde af logfiler.
    4. Check den ' udfører integritetskontrol ' afkrydsningsfeltet (aktiveret som standard) til at undersøge hver støtteberettigede skal søges til fejl i forbindelse med en uventet software opsigelse logfilen.
    5. Klik ' Søg ' at søge logfiler og observere Søg resultater på højre side af vinduet.
    6. Klik på den ' Se logfilen ' knappen ved siden af et søgeresultat at fremhæve og se den angivne linje i den ' fremviser ' tab.
  5. Log fil integritet spørgsmål
    1. Klik på den ' integritet ' fane til at se fejl der findes under integritetskontrollen (Hvis checken var ønsket).
      Bemærk: En søgning skal udføres for at undersøge logfiler for integritet problemer. Til at udføre en integritetskontrol uden at søge logfiler for eny søgetermer, bare lade alle søgefelter parameter sorte i de ' Søg ' tab, sikre den ' udfører integritetskontrol ' er markeret, og klik på ' Søg '. Hvis integritet problemer findes, den ' integritet ' fane baggrundsfarve bliver red.
    2. Løse integritet problemer (output er grupperet efter logfilen) hvor det er muligt.
      Bemærk: Yderligere oplysninger om skridt til at løse problemer med integritet, konsultere onlinedokumentationen 14.

7. Kurve og dosis estimering statistik indstillinger

  1. Klik ' indstillinger ' i den menu advokatstanden og sluttet ' statistik indstillinger ' at åbne den ' statistik indstillinger ' dialogboks.
  2. Vælg en kalibreringskurve montering metode (mindste kvadraters eller maksimum-sandsynlighed) fra dropnedfeltet.
  3. Placer et hak ved siden af ' Display kalibrering kurve 95% CI, hvis gældende ' til at vise 95%-konfidensintervallerne når plotte en kalibreringskurve.
  4. Placer et hak ved siden af ' dosis forkalkulation beregner 95% CI på grund af Poisson ' til at beregne 95% sikkerhedsgrænser på dosis skøn baseret på Poisson karakter af DC udbytte.
  5. Placer et hak ved siden af ' dosis forkalkulation beregner 95% CI på grund af kurven, eventuelt ' til at beregne 95% sikkerhedsgrænser på dosis skøn baseret på usikkerheden kalibreringskurven.

Representative Results

Test af software blev udført med metafase kromosom billeddata indhentet fra HC og CNL. Blodprøver blev bestrålet af en XRAD-320 enhed (250 kV røntgenstråling, 12,5 mA, 2mm Al filtrering, dosering: 0.92 eller 1,7 Gy/min) kalibreret med et ion kammer ved HC og behandlet på begge laboratorier. Perifere blod-lymfocytter prøver var kulturperler, fast og farves på hvert anlæg efter fastlagte protokoller3,15. Metafase billeder fra Giemsa-farvede lysbilleder blev erobret uafhængigt af hvert lab ved hjælp af en automatiseret mikroskopi system. Eksperter i hvert laboratorium scorede DCs i flere af disse prøver manuelt, bygget deres egne kalibreringskurverne og anslået doser af test prøver af ukendte engagementer. En detaljeret beskrivelse af disse datasæt er fastsat i tabel 1.

Fysiske dosis Formål HC forberedelse CNL forberedelse
Nævnt navnet # af billeder Nævnt navnet # af billeder
0 Gy Kalibrering HC0Gy 731 CNL0Gy 798
0,1 Gy Kalibrering HC01Gy 2162 NA NA
0,25 Gy Kalibrering HC025Gy 1826 NA NA
0,5 Gy Kalibrering HC05Gy 1054 CNL05Gy 1532
0,75 Gy Kalibrering HC075Gy 1233 NA NA
1 Gy Kalibrering HC1Gy 1566 CNL1Gy 841
2 Gy Kalibrering HC2Gy 1147 CNL2Gy 996
3 Gy Kalibrering HC3Gy 1212 CNL3Gy 1188
4 Gy Kalibrering HC4Gy 909 CNL4Gy 1635
5 Gy Kalibrering HC5Gy 1019 NA NA
3.1 Gy Test HCS01 540 CNLS01 500
2.3 Gy Test HCS08 637 CNLS08 500
1.4 Gy Test HCS10 708 NA NA
1.8 Gy Test HCS04 600 CNLS04 957
2.8 Gy Test HCS05 1136 CNLS05 1527
3.4 Gy Test HCS07 477 CNLS07 735

Tabel 1: Kilder af billeddata fra HC og CNL for evaluering af softwaren.
Fodnote: Modificeret fra tabel 1 i Rogan et al., 20164. Kun manuelt forudvalgte billeder var tidligere tilgængelig til os fra CNL. Ufiltreret billeder er blevet tilgængelige og image tæller er opdateret i overensstemmelse hermed. Derudover, nyligt erhvervet HC prøver (0.25Gy, 0.75Gy og 5Gy) er præsenteret her.

Automatiske billede udvalg i prøver

Billedkvaliteten er afgørende for korrekt DC opdagelse i DC analyse. Billede udvalg af cytogenetiske specialister er normalt udføres manuelt i konventionelle DC analyse. ADCI bruger kvantitativ billede kriterier for automatisk at vælge billeder før DC frekvens beregning16. Brugere kan enten filtrere ud billeder baseret på specifikke kromosom morfologier og/eller sortere cellerne efter relative proportioner af længder af objekter efter kendte længder af cytogenetiske-definerede grupper af kromosomer i en normal human karyotype (betegnes den gruppe-bin afstand metode). De tilgængelige morfologiske filtre bruger skala-invariant tærskler afvise celle billeder med ufuldstændige kromosom sæt eller med flere metaphases, med prometaphase kromosomer, med fremtrædende søster chromatid dissociation, med meget bøjet og snoede kromosomer, med objekter, der har glatte konturer karakteristiske intakt kerner, og dem, hvor færre objekter er anerkendt som kromosomer. Figur 3 (a) og (b) viser eksempler på udvalgte billeder, mens figur 3 (c) og (d) er eksempler på billeder, der er filtreret ud af softwaren. Disse billeder stammer fra prøven HCS05 (beskrevet i tabel 1), og er udvalgt af den foruddefinerede billede valg model, som rangerer alle billeder af gruppen bin afstand, så vælger de bedste 250 billeder. Kromosomer i figur 3 (A), (b) er godt adskilt, og udviser tilfredsstillende morfologi. Figur 3 c indeholder overdreven antal overlappende kromosom klynger. Figur 3 (d) viser alvorlige søster chromatid adskillelse. Søster kromatider adskilles helt for mindst 8 af kromosomerne og de centromeric forsnævringer er tvetydig i de fleste af de andre kromosomer.


Figure 3
Figur 3: eksempler på metafase billeder i prøven HCS05 (forstørrelse: 63 X), både markeret og valgt af Model 'Gruppe Bin afstand, Top 250 billeder'. (A) og (B) er udvalgte billeder. (C) og (D) er billeder, der er blevet elimineret af modellen. (C) blev udelukket, fordi det indeholdt for mange overlappende kromosomer og (D) havde overdreven antallet af adskilte Søster kromatider. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Virkningerne af anvendelse disse billede valg modeller er indlysende ved at undersøge konfidensniveau DC påvisningsgrænse i en prøve. Forekomster af DCs i en population af celler fra en bestrålet prøve følge en Poisson fordeling. Chi-square godhed af fit test sammenligner den observerede DC hyppighed distribution til den forventede pasform til Poisson-fordelingen. Modeller at korrekt filter eksempeldata udstiller DC frekvenser ikke signifikant forskellig fra den forventede Poisson afledte værdier (typisk signifikansniveau > 0,01). Figur 4 viser DC hændelser og de tilsvarende passer til Poisson fordelinger for HC4Gy prøven af alle billeder vs kun billeder udvalgt af modellens "gruppe bin afstand, top 250 billeder". Figur 4 (b) viser en bedre passer til Poisson-fordelingen. P-værdi (0,36) af det filtrerede sæt af billeder betydeligt overstiger værdien af den ufiltrerede DC distribution i figur 4 (a). På enten 5% eller 1% betydning niveauer, ufiltreret prøven i figur 4 (a) er mindre pålidelige, fordi det indeholder lavere kvalitet DC data, som en Poisson fordeling af DCs nulhypotesen forkastes.

Figure 4
Figur 4: Screenshots af forholdsmæssig DC frekvenser passer til Poisson Dstributions af prøven HC4Gy i softwaren. (A) alle billeder er inkluderet, (B) kun billeder udvalgt af model (gruppe bin afstand, top 250 billeder) er inkluderet. Legend (øverst til højre) viser statistikken for Tilpas til Poisson-fordelingen (Dispersion indeks, Mu test og Lambda) og Chi-square godhed af fit test (p-værdi) venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Registrering af dicentric kromosom (DC)

Nøjagtig DC opdagelse er kritisk forudsætning kravet om ADCI. Genkendt rigtigt DCs og dem, der gik glip af softwaren er henholdsvis defineret som sandt positive (TPs) og falske negativer (FNs). Objekter, der ikke DCs, men fejlagtigt registreret som DCs, betegnes som falske positiver (FPs). FPs omfatter monocentric kromosomer, kromosom fragmenter, adskilt Søster kromatider, overlappede kromosom klynger og ikke-kromosomale objekter. Figur 5 viser resultaterne af DC opdagelse i to metafase billeder. Objekter 1 og 3 er TPs, mens objektet 4 er en FP, bestående af to særskilte monocentric kromosomer konjunktion langs deres korte arme. I figur 5 (a), objekt 2 var oprindeligt en FP, men efterfølgende korrigeret ved FP filtre i softwaren. Objekterne 5 og 6 i figur 5 (b) er sandsynligvis eksempler på FNs.

Figure 5
Figur 5: Screenshots tyder metafase kromosom klassificering af potentielle DCs. (A) Et billede i prøven CNL1Gy (forstørrelse: 63 X) viser 1 TP, objekt "1"; og 1 rettet FP, objekt "2". (B) et billede i prøven CNL4Gy (forstørrelse: 63 X) viser 1 TP, objekt "3"; 1 FP, objekt "4"; og 2 potentielle FNs, objekter, "5" og "6". TPs, korrigeret FPs, normal monocentric og uklassificerede kromosomer er henholdsvis skitseret med rød, gul, grøn og blå konturer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Dosis estimering af prøver

Det endelige resultat af ADCI analyser er dosis estimater af prøver udledes af kalibreringskurver. Dosis skøn foretaget af software for prøverne i tabel 1 er angivet i tabel 2 og 3. Til sammenligning, den fysiske strålingsdosis udsendes og de manuelle scorede doser af eksperter på HC for prøver, HCS01, HCS08 og HCS10 angives. På samme måde, de fysiske og manuel scorede doser af CNL eksperter er vist for CNLS04, CNLS05 og CNLS07.

Figur 6 viser kalibreringskurverne med skøn over strålingsdosis for Health Canada biodosimetry laboratorieprøverne HCS01, HCS08, HCS10, HCS04, HCS05 og HCS07. Kalibreringskurven er genereret ved hjælp af prøver, HC0Gy, HC1Gy, HC2Gy, HC3Gy og HC4Gy. Billede valg model indeholdende 3 Z-score-baseret filtre + "gruppe bin afstand, top 250 billeder" anvendes på alle prøver. Skøn over doser sammen med tilhørende statistiske analyser er vist i tabel 2.

Figure 6
Figur 6: Screenshot af dosis estimering af HC analyseprøverne. Sorte firkanter repræsenterer kalibrering prøver. Billeder i prøver og kalibrering prøver er udvalgt af model (3 FP filtre + gruppe bin afstand, top 250 billeder). Tyk stiplede linjer repræsenterer kortlægning af DCs/metafase gennem kalibreringskurven til anslåede dosis. Tynde stiplede linjer angiver øvre og lavere 95% sikkerhedsgrænser for DCs/metafase. Farve koder af prøveopløsninger: lys rød, HC S01 (fysiske dosis: 3.1Gy, HC udledes dosis: 3.4Gy, ADCI: 3Gy); mørkegrøn, HC S04 (fysiske dosis: 1.8Gy, ADCI: 1.85Gy); lyse blå, HC S05 (fysiske dosis: 2.8Gy, ADCI: 2.95Gy); mørkeblå, HC S07 (fysisk dosis: 3.4Gy, ADCI: 2.35Gy); mørk rød, HC S08 (fysiske dosis: 2.3Gy, HC udledes dosis: 2.5Gy, ADCI: 2Gy); lysegrønt, HC S10 (fysiske dosis: 1.4Gy, HC udledes dosis: 1.4Gy, ADCI: 0.95Gy). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Prøver Fysiske dosis HC udledes dosis ADCI anslået dosis Anslåede dosis LCL Anslåede dosis UCL P-værdi *
HCS01 3.1 3.4 3 2.3 3.8 0.117
HCS08 2.3 2.5 2 1.4 2.7 0.815
HCS10 1.4 1.4 0,95 0,5 1,55 0.211
HCS04 1.8 NA 1,85 1,25 2,55 0.0293
HCS05 2.8 NA 2,95 2.25 3.75 0.00354
HCS07 3.4 NA 2.35 1.7 3.1 0.0002

Tabel 2: Dosis skøn resultaterne af HC analyseprøverne.
Fodnote: Modificeret fra tabel 3 i Rogan et al., 20164. ADCI dosis skøn tidligere rapporteret var baseret på ufiltreret billeder og kurve montering blev udført ved hjælp af de mindste kvadraters metode. Her kalibreringskurven var egnet ved hjælp af metoden maksimum-sandsynligheden og et billede valg model indeholdende 3 FP filtre + "gruppe bin afstand, top 250 billeder" blev anvendt før dosis skøn. Anslåede dosis UCLog LCL refererer til dosis estimatet øvre og lavere 95% sikkerhedsgrænser baseret på Poisson karakter af DC udbytte. * Chi firkantede godhed af fit til teoretiske Poisson-fordelingen; NA: Resultater af manuelt afledt dosis blev ikke leveret.

Stråledosis vurderinger af prøver fra canadiske nukleare laboratorier CNLS04, CNLS05, CNLS07, CNLS01 og CNLS08 er vist i figur 7. Kalibreringskurven er genereret ved hjælp af prøver, CNL0Gy, CNL0.5Gy, CNL1Gy, CNL2Gy, CNL3Gy og CNL4Gy. Vi anvendte en billede valg model bestående af 6 FP filtre til alle prøver. Resultater med statistiske analyser er vist i tabel 3.

Figure 7
Figur 7: Screenshot af dosis estimering af CNL analyseprøverne. Sorte firkanter repræsenterer kalibrering prøver. Billeder i prøver og kalibrering prøver vælges ved hjælp af 6 FP filtre. Tyk stiplede linjer repræsenterer kortlægning af DCs/metafase gennem kalibreringskurven til anslåede dosis. Tynde stiplede linjer angiver øvre og lavere 95% sikkerhedsgrænser for DCs/metafase. Farve koder af prøveopløsninger: lys rød, CNL S04 (fysiske dosis: 1.8Gy, CNL udledes dosis: 1.7Gy, ADCI: 1.95Gy); mørk rød, CNL S05 (fysiske dosis: 2.8Gy, CNL udledes dosis: 2.7Gy, ADCI: 3.05Gy); lysegrønt, CNL S07 (fysisk dosis: 3.4Gy, CNL udledes dosis: 3.1Gy, ADCI: 3.4Gy); mørkegrøn, CNL S01 (fysiske dosis: 3.1Gy, ADCI: 3.75Gy); blå, CNL S08 (fysiske dosis: 2.3Gy, ADCI: 2.8Gy). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Prøver Fysiske dosis CNL udledes dosis ADCI anslået dosis Anslåede dosis LCL Anslåede dosis UCL P-værdi *
CNLS04 1.8 1.7 1,95 1,25 2,45 0.0545
CNLS05 2.8 2.7 3,05 2,75 3.35 0.325
CNLS07 3.4 3.1 3.4 3 3.75 0.473
CNLS01 3.1 NA 3.75 3.35 > 4 7.63E-11
CNLS08 2.3 NA 2.8 2.25 3.3 0.777

Tabel 3: Dosis skøn resultaterne af CNL testprøver.
Fodnote: Modificeret fra tabel 3, Rogan et al., 20164. ADCI dosis skøn tidligere rapporteret var baseret på ufiltreret (HC) eller manuelt valgt (CNL) billeder og kurve montering blev udført ved hjælp af de mindste kvadraters metode. Her kalibreringskurven var egnet ved hjælp af metoden maksimum-sandsynligheden og et billede valg model indeholdende 3 FP filtre + "gruppe bin afstand, top 250 billeder" blev anvendt før dosis skøn. Anslåede dosis UCL og LCL, henholdsvis, henvise til dosis anslåede øvre og lavere 95% sikkerhedsgrænser baseret på Poisson karakter af DC udbytte.
* Chi firkantede godhed af fit til teoretiske Poisson-fordelingen; NA: Resultaterne af manuelt afledt dosis var ikke tilgængelige.

Estimering af stråledosis inden for kalibreringskurvens lineære område (< 1 Gy) kan udføres med softwaren, men en Sigma værdi på 1,0 anbefales er for yderligere at reducere hyppigheden af forkert klassificerede DCs (figur 8).


Figure 8
Figur 8: Screenshots af to kalibreringskurverne stammer fra HC kalibrering prøver på forskellige Sigma værdier. (A) HC kalibrering prøver: 0Gy, 2Gy, 3Gy, 4Gy, og 5Gy på Sigma = 1,5. (B) HC kalibrering prøver: 0Gy, 0.25Gy, 0.5Gy, 0.75Gy, 1Gy, 2Gy, 3Gy, 4Gy, og 5Gy ved hjælp af SVM Sigma = 1,0. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Disse analyser indikerer, at der er små, men acceptabelt forskelle mellem fysisk og biologisk afledt dosis fortolket af eksperter og af softwaren. Forskellen mellem enten manuel eller software skøn fra den fysiske dosis er benævnt "fejl". Fejl i de afledte doser af prøver manuelt scoret af HC og CNL er ≤0.3 Gy. Automatiseret behandling af softwaren er mindre præcis end eksperter, men generelt inden for IAEA-angivet triage ± 0,5 Gy3. For de fleste af prøverne i tabel 2 og 3produceret software korrekte resultater inden for denne tærskel. Men HCS07 og CNLS01 udviser en dårlig godhed-af-fit til Poisson-fordelingen, tyder på, at der var potentielle problemer i billedet og DC kvalitet i disse prøver, der ikke blev løst ved anvendelse af billedet og FP udvalg modeller. Tærsklen p værdi betydning synes at være overdrevent strenge i forbindelse med HCS05, hvor softwaren præcist bestemt den korrekte dosis.

Discussion

Funktioner og begrænsninger i softwaren

Den protokol, der er beskrevet i dette papir introducerer den typiske trinvis fremgangsmåde, der anvendes i ADCI importere og behandle cytogenetisk metafase billeder, oprette stråling kalibreringskurver, og vurdere biologisk dosis i enkeltpersoner eller prøver udsat for ukendte strålingsniveauer. Det er dog ikke nødvendigt at foretage disse instruktioner sekventielt. For eksempel, mange prøver af ukendt dosis kan blive behandlet og analyseret ved hjælp af den samme precomputed kalibreringskurven. Desuden, når behandlingen er færdig, billede udvælgelse og DC filtrering modeller kan være itereret af brugeren. Anvendelsen af et passende billede valg model afhænger af egenskaberne og kvalitet af billeddata metafase, som igen bygger både på laboratoriet protokollen bruges til at forberede celler og strenghed kriterier bruges til at markere celler med automatiseret metafase capture systemer. Kromosom morfologier varierer blandt biodosimetry og cytogenetiske laboratorier, og dermed, billede valg modeller bør vurderes af brugeren til at afgøre, om de foruddefinerede billede valg modeller leveres med software vil være tilstrækkelig til at udarbejde præcise dosis skøn, eller om brugerdefinerede modeller med brugerdefinerede tærskler skal oprettes. Baseret på vores erfaringer, er effektiviteten af billede valg modeller påvirket af kilden og kvaliteten af billederne, celle. Brugere kan designe deres eget image udvælgelseskriterierne ved hjælp af forskellige kombinationer af filtre til at eliminere falske positive DCs og billede valg modeller, og de tilsvarende tærskelværdier for at vælge ønskede billeder. Der er fleksibilitet i input af kalibreringskurver og dosis skøn, som koefficienter af en lineær-kvadratisk kurve og DC frekvenser kan ændres eller manuelt indtastet.

Selvom softwaren er fuldautomatisk, kan billeder være manuelt gennemgået og valgt. Denne facilitet er tilgængelig til at medtage eller fjerne individuelt behandlede billeder via funktionen mikroskop seer i de vigtigste GUI. På grund af automatisering er softwaren dog betydeligt mere effektiv sammenlignet med den manuelle scoring af metafase billeder og tælle DCs. En stikprøve af 1000 billeder kan behandles i 20 (tiff) til 40 (jpg) min på en arbejdsstation med multi core-ydeevne. Denne software vil være særligt nyttige i tidskritiske eller arbejdskrævende situationer, som begivenheder, flere personer har været udsat eller var mistænkt for at have været udsat for stråling eller hvor tidsfølsomme diagnoser og behandling beslutninger er kritisk.

Præcise og nøjagtige høj overførselshastighed påvisning af DCs samt dosis skøn er nødvendige for automatiseret stråling vurdering. Andre tilgængelige alternativer til softwaren opfylder ikke begge disse krav. En bruger-assisteret, image-baserede cytogenetiske analyser (DCScore, Metasystems17) system kræver manuel kontrol af kandidat DCs, på grund af en høj fejl sats tilskrives ukorrigeret overlapper mellem kromosomer, og systemet ikke bestemme stråledosis. DCScore ville ikke være så effektiv som ADCI i en stråling begivenhed der involverer et stort antal potentielt udsatte personer. Stor blænde mikroskop systemer kan indsamle billeder af flere metafase celler18, men de analysere ikke dem. "CABAS"19 og "Dosis skøn"20 software kan generere kalibrering kurver og skøn dosis, men ikke score DCs. Andre biodosimetry assays, der ikke er baseret på DC analyse omfatter H2AX fluorescens, fluorescens i situ hybridisering med DNA sonder målrettet til specifikke kromosomer, Gen-ekspression, mikronucleusundersøgelse assay, og urin og luftvejs biomarkører. Disse metoder er mindre specifikke og mindre følsomme for ioniserende stråling, kan være mere dyrt, i nogle tilfælde, er mere tidskrævende og ikke generelt er blevet standardiseret på tværs af flere laboratorier. De fleste af disse teknikker ikke afsløre stabil stråling svar, så de ikke kan bruges til langsigtet vurdering (> 7 dage efter eksponering) af stråledosis. Derimod, dette kan vurdere personer op til 90 dage efter eksponering, og kan behandle data fra enhver cytogenetisk laboratorium mikroskop imaging system. Men hvis en stikprøve udtrækkes > 4 uger efter eksponering, følsomhed er reduceret på grund af forfald af dicentric aberrationer1,2,3 og softwaren ikke i øjeblikket korrekt DC frekvenser for forsinkelser i prøvetagning eksponerede personer.

Denne software har visse begrænsninger. Eksisterende billede valg modeller Vælg det meste acceptabelt metafase billeder, men i nogle tilfælde undlader at fjerne utilfredsstillende billeder, som kan reducere nøjagtigheden af DC opdagelse. Det er stadig et åbent spørgsmål hvordan man designer et tilfredsstillende billede valg model, der fjerner alle uegnede metafase celler. Softwaren giver nøjagtige skøn for prøver udsat for højere doser (≥ 2 Gy). Trods betydelige fremskridt med at reducere antallet af falsk positive DCs16, har disse objekter ikke elimineret. Lavere kvalitet metafase celler på lav stråledosis (især < 1 Gy) er mere tilbøjelige til falsk positive DC opdagelse. Derfor, lavdosis prøver var ikke medtages ved generering af kalibreringskurve anvendes til dosis estimering af HC-testprøver. Evt en kurve, der indeholder lav dosis prøver en lavere SVM Sigma værdi reducerer falske positive tæller i lav dosis prøver men kan resultere i lavere DC udbytter i høj dosis prøver. Figur 8 sammenligner HC kurven bruges til dosis skøn (Sigma = 1,5) med en kalibreringskurve fit med ekstra lav dosis prøver på lavere SVM sigma værdi (1,0). I prøver med et utilstrækkeligt antal metafase celler og/eller dårlig kvalitet metafase billeder, kan det ikke være muligt at præcist skøn biologiske engagementer på lav dosis, potentielt resulterer i afvigelser fra fysiske dosis overstiger 0,5 Gy.

Softwaren kan ikke præcist vurdere stråling typer hvis deres dosis-respons kurver bedst passe en lineær eller nær-lineær model. Hidtil er det blevet testet kun med prøver udsat for X- og Gamma stråler. Hvis en anden lyskilden er undersøgt, skal brugerne sikre både kalibrering og test prøver er udsat for den samme type af stråling. Softwaren bruger enten maksimale sandsynligheden eller mindste kvadraters montering for at konstruere en dosis-respons kurve ved hjælp af en lineær-kvadratisk model. Der er i øjeblikket ingen mulighed for at pålægge et strengt lineær kurve passer, passende for høj energi partikel engagementer, men sådan vil funktionen være tilgængelig i fremtiden.

Fremtidige udvikling

Vores igangværende indsats er fokuseret på at forbedre billedet udvalg modeller og nøjagtig dosis måling, især på prøverne udsat for lave strålingsdoser. Efterfølgende softwareversioner vil give standardfejl målinger på skøn over doser og konfidensintervaller på kalibreringskurver. Derudover er en high-performance computing version af softwaren til blå gen (BG/Q, IBM) supercomputeren under udvikling til rettidig evaluering af enkeltpersoners stråleudsættelse i en masse-casualty stråling begivenhed. Nogle komponenter af softwaren har allerede testet og indsat på denne platformLass = "xref" > 11.

Disclosures

PKR og JHMK cofounded CytoGnomix, som kommercialisere ADCI og indehaver af relaterede patenter. YL og BCS er medarbejdere i CytoGnomix. ADCI er ophavsretligt beskyttet, og metoden centromer lokalisering i ADCI er patenteret (os Pat. Nr. 8,605,981; Tyske Pat. No. 112011103687).

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for Dr. Ruth Wilkins, radiobiologi og beskyttelse Division på Health Canada, og Farrah Flegal, canadiske nukleare laboratorier og deres laboratoriepersonalet adgang til metafase billeddata fra deres cytogenetisk biodosimetry laboratorier. Dette papir blev støttet af en kontrakt fra bygge i Canada Innovation Program til CytoGnomix (Serienr. EN579-172270/001/SC). Den oprindelige version af ADCI og udvikling af algoritmer blev støttet af den vestlige innovationsfond; Naturvidenskab og Engineering Research Council of Canada (NSERC opdagelse Grant 371758-2009); US Public Health Service (DART-dosis CMCR, 5U01AI091173-0); den canadiske Foundation for Innovation; Canada forskning stole og CytoGnomix Inc.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated Dicentric Chromosome Identifier and Dose Estimator (ADCI) CytoGnomix NA ADCI software is released in a binary installation package file for Microsoft Windows 7, 8, 8.1 and 10; 235 Mb of disk storage are required for a typical installation. The software has been tested with Intel or AMD x86-64 processors; at least 1 Gb RAM is recommended. Analyses have been benchmarked on a computer configured with an Intel I7 processor and 16 Gb RAM. Operation of ADCI requires an active license and a USB-based hardware dongle, which must remain plugged in while the software is executing. The dongle encodes the software expiry date. Each time the software is started, this date is read. The software will allow access to the program if the current date and time precedes the expiration time-date stamp. Extending an expired software license can be accomplished by obtaining a new dongle or by renewing the license with an updated key at startup.
Digital images of metaphase cell nuclei Examples: Metasystems, Leica Microsystems M-Search (Metasystems), Cytovision (Leica) software High resolution TIFF format; typically >250 digital images generated with a microscope imaging capture system (minimum 63X magnification objective, 10X magnification ocular).
MSI Leopard Pro (recommended, optional) Micro-Star International MSI GP62 6QF 480CA Leopard Pro Multi-core performance workstation.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brewen, J. G., Preston, R. J., Littlefield, L. G. Radiation-Induced Human Chromosome Aberration Yields Following an Accidental Whole-Body Exposure to60 Co γ-Rays. Radiat Res. 49, (3), 647-656 (1972).
  2. Bender, M. A., Gooch, P. C. Persistent Chromosome Aberrations in Irradiated Human Subjects. Radiat Res. 16, (1), 44-53 (1962).
  3. INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY. Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies. IAEA: Vienna. (2011).
  4. Rogan, P. K., Li, Y., Wilkins, R. C., Flegal, F. N., Knoll, J. H. M. Radiation Dose Estimation by Automated Cytogenetic Biodosimetry. Radiat Prot Dosimetry. 172, (1-3), 207-217 (2016).
  5. Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Knoll, J., Khan, W., Rogan, P. An image processing algorithm for accurate extraction of the centerline from human metaphase chromosomes. 2010 IEEE International Conference on Image Processing. 3613-3616 (2010).
  6. Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Knoll, J., Khan, W., Rogan, P. An Accurate Image Processing Algorithm for Detecting FISH Probe Locations Relative to Chromosome Landmarks on DAPI Stained Metaphase Chromosome Images. 2010 Canadian Conference on Computer and Robot Vision. 223-230 (2010).
  7. Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Rogan, P. K., Knoll, J. H. M. Intensity integrated Laplacian algorithm for human metaphase chromosome centromere detection. 2012 25th IEEE Canadian Conference on Electrical and Computer Engineering (CCECE). 1-4 (2012).
  8. Li, Y., et al. Towards large scale automated interpretation of cytogenetic biodosimetry data. 2012 IEEE 6th International Conference on Information and Automation for Sustainability. 30-35 (2012).
  9. Ranjan, R., Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Automatic Detection of Pale Path and Overlaps in Chromosome Images using Adaptive Search Technique and Re-thresholding. International Conference on Computer Vision Theory and Applications. 462-466 (2017).
  10. Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Intensity Integrated Laplacian-Based Thickness Measurement for Detecting Human Metaphase Chromosome Centromere Location. IEEE Trans Biomed Eng. 60, (7), 2005-2013 (2013).
  11. Rogan, P. K., et al. Automating dicentric chromosome detection from cytogenetic biodosimetry data. Radiat Prot Dosimetry. 159, (1-4), 95-104 (2014).
  12. Li, Y., Knoll, J. H., Wilkins, R. C., Flegal, F. N., Rogan, P. K. Automated discrimination of dicentric and monocentric chromosomes by machine learning-based image processing. Microsc Res Tech. 79, (5), 393-402 (2016).
  13. Subasinghe, A., et al. Centromere detection of human metaphase chromosome images using a candidate based method. F1000Res. 5, 1565 (2016).
  14. Shirley, B. C., Li, Y., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Online manual for the Automated Dicentric Chromosome Identifier and Dose Estimator, Version 1.2. Available from: http://adciwiki.cytognomix.com (2017).
  15. Wilkins, R. C., et al. Evaluation of the annual Canadian biodosimetry network intercomparisons. Int J Radiat Biol. 91, (5), 443-451 (2015).
  16. Liu, J., Li, Y., Wilkins, R., Flegal, F., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Accurate Cytogenetic Biodosimetry Through Automation Of Dicentric Chromosome Curation And Metaphase Cell Selection. F1000Research. 6, 1396 (2017).
  17. Schunck, C., Johannes, T., Varga, D., Lörch, T., Plesch, A. New developments in automated cytogenetic imaging: unattended scoring of dicentric chromosomes, micronuclei, single cell gel electrophoresis, and fluorescence signals. Cytogenet Genome Res. 104, (1-4), 383-389 (2004).
  18. Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. S. High-throughput sample processing and sample management; the functional evolution of classical cytogenetic assay towards automation. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2015, 132-141 (2015).
  19. Deperas, J., et al. CABAS: a freely available PC program for fitting calibration curves in chromosome aberration dosimetry. Radiat Prot Dosimetry. 124, (2), 115-123 (2007).
  20. Ainsbury, E. A., Lloyd, D. C. Dose estimation software for radiation biodosimetry. Health Phys. 98, (2), 290-295 (2010).
Fremskyndet stråling Biodosimetry automatiseret ved Dicentric kromosom identifikation (ADCI) og dosis estimering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shirley, B., Li, Y., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation. J. Vis. Exp. (127), e56245, doi:10.3791/56245 (2017).More

Shirley, B., Li, Y., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation. J. Vis. Exp. (127), e56245, doi:10.3791/56245 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter