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Genetics

Beschleunigten Strahlung Biodosimetry automatisiert durch dizentrische Chromosom Identifikation (ADCI) und Abschätzung der Dosis

doi: 10.3791/56245 Published: September 4, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Die zytogenetische dizentrische Chromosom (DC)-Assay quantifiziert Exposition gegenüber ionisierender Strahlung. Die automatisierte dizentrische Chromosom Bezeichner und Dosis Estimator Software schätzt genau und schnell biologische Dosis von DCs in Metaphase Zellen. Es unterscheidet monozentrischen Chromosomen und andere Objekte von DCs, und schätzt biologische Strahlungsdosis von der Frequenz des DCs.

Abstract

Biologische Strahlendosis kann aus dizentrische Chromosom Frequenzen in Metaphase Zellen abgeschätzt werden. Diese zytogenetische dizentrische Chromosom-Assays ist traditionell ein manueller, arbeitsintensiver Prozess nicht gut geeignet, um das Volumen der Proben zu behandeln, die Prüfung im Zuge einer mass Casualty Veranstaltung benötigen. Automatisierter dizentrische Chromosom Bezeichner und Dosis Schätzer (ADCI) Software automatisiert diesen Prozess, indem Sie Sätze von Metaphase Bilder mit Machine Learning-basierte Bildverarbeitungstechniken untersuchen. Die Software wählt geeignete Bilder zur Analyse durch ungeeignete Bilder entfernen stuft jedes Objekt als ein Zentromer-haltigen Chromosom oder nicht-Chromosom, weiter zeichnet Chromosomen als monozentrische Chromosomen (MCs) oder dizentrische Chromosomen (DCs), DC Frequenz innerhalb einer Probe bestimmt, und schätzt biologische Strahlendosis Probenfrequenz DC mit Kalibrierkurven berechnet mit Kalibrierung Proben verglichen. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung des ADCI Software. In der Regel sind Kalibrierung (bekannte Dosis) und Prüfgeräte (unbekannte Dosis) der Metaphase Bilder importiert, um die genaue Dosierung Schätzung durchführen. Optimale Bilder für die Analyse automatisch mit voreingestellten Bildfilter gefunden werden können oder auch durch manuelle Inspektion gefiltert werden können. Die Software verarbeitet Bilder innerhalb jeder Probe und DC Frequenzen werden auf verschiedenen Ebenen der Stringenz für den Aufruf von DCs, mit einem Machine learning-Ansatz berechnet. Linear-quadratische Kalibrierkurven werden generiert basierend auf DC-Frequenzen in Kalibrierung Proben bekannten physikalischen Dosen ausgesetzt. Dosen von Prüfmustern unsicher Strahlenbelastung ausgesetzt sind von ihrer DC-Frequenzen verwenden diese Kalibrierkurven geschätzt. Berichte können auf Anfrage erstellt werden und Zusammenfassung der Ergebnisse von einem oder mehreren Proben, von einem oder mehreren Kalibrierkurven oder der Dosis Schätzung liefern.

Introduction

Strahlung Biodosimetry nutzt biologische Marker, meist Chromosomenaberrationen wie dizentrische Chromosomen (DCs) und Chromosom Translokation Strahlendosen zu messen, denen Individuen ausgesetzt sind. Eine biologisch Energiedosis kann aus der physischen Dosis gemessen an Instrumenten aufgrund der Variabilität zwischen den Individuen unterscheiden. In ähnlicher Weise produzieren Strahlung einer bestimmten körperlichen Dosis unterschiedlicher biologische Belichtung durch physiologische oder ökologischen Rahmenbedingungen. Kenntnis der biologischen Dosis ist von besonderer Bedeutung für die Diagnose und Behandlung.

Die DC-Assay ist der Goldstandard der World Health Organisation (WHO) und der International Atomic Energy Agency (IAEA) für die Beurteilung der biologischen Strahlenbelastung bei Menschen. Es war der erste Test von der IAEO und die Strahlung Dosis Bewertung empfohlen. DC Frequenz ist für ca. 4 Wochen nach Strahlung Belichtung1 relativ stabil und deren quantitative Korrelation mit emittierte Strahlungsdosis ist genau, was DCs die ideale Biomarker. Die Beziehung zwischen Strahlendosis (verwiesen in Gray [Gy] Einheiten) und DC Frequenz (als Anzahl der DCs pro Zelle referenziert) kann als linear-quadratische Funktion ausgedrückt werden.

Die zytogenetische DC-Assay ist der Industriestandard für ca. 55 Jahren2gewesen. Es ist manuell, 1-2 Tagen Mikroskop Datenanalyse aus einer einzigen Blutprobe durchgeführt worden. Mehrere hundert bis mehrere tausend Bilder sind erforderlich, um die Strahlenbelastung abhängig von der Dosis3genau zu schätzen. Bei Dosen von mehr als 1 Gy empfiehlt IAEO ein Minimum von 100 DCs erkannt werden. Prüfung von 250-500 Metaphase Bildern ist gängige Praxis in Biodosimetry zytogenetischen Labors. Für Proben mit Belichtungszeiten < 1 Gy, 3.000-5.000 Bilder sind durch die geringeren Wahrscheinlichkeiten der DC Bildung vorgeschlagen. In jedem Fall ist es eine Arbeits-intensive Aufgabe.

Zytogenetische Biodosimetry Labors erstellen ihre eigenen in-vitro- Strahlung Biodosimetry Kalibrierkurven vor Bewertung biologische Dosen in Proben. Blutproben von normalen, Kontrolle Individuen sind Strahlung ausgesetzt und Lymphozyten sind dann kultiviert und Chromosomenanalyse Metaphase vorbereitet. Diese Stichproben werden biologische Dosen erhalten auf die bekannten physikalischen Dosen von einer standard Strahlungsquelle ausgesandte kalibriert. Nachdem Metaphase Zelle Bilder aufgezeichnet werden, Experten untersuchen Bilder, zählen DCs und DC Frequenzen für jede Probe zu berechnen. Eine Eichkurve wird durch den Einbau einer linear-quadratische Kurve auf der DC-Frequenzen bei allen Dosen gebaut. Dann können Belichtungen in Probe von Einzelpersonen durch den Abgleich der DC-Frequenzen auf die kalibrierten Dosen auf der Kurve oder indem man sie in den entsprechenden linearen quadratische Formel ableiten.

Wir haben sowohl die Erkennung der DCs automatisiert und Dosis Entschlossenheit, dieses Verfahren mit Software zu beschleunigen. Automatisierte dizentrische Chromosom Bezeichner und Dosis Schätzer (ADCI) Machine Learning-basierte Bildverarbeitung Techniken zu erkennen und zu unterscheiden dizentrische Chromosomen (DCs) von monozentrischen Chromosomen (MCs) und andere Objekte verwendet und automatisiert die Strahlung Abschätzung der Dosis. Die Software soll deutlich verringern oder beseitigen die Notwendigkeit für die manuelle Überprüfung der DC zählt und Abschätzung der Dosis durch Automatisierung zu beschleunigen. Es wurde unter Einbeziehung der Biodosimetry Referenzlaboratorien zur Gesundheit Kanada (HC) und kanadische Nuclear Laboratories (CNL) entwickelt. Ihr Feedback wird sichergestellt, dass die Leistung weiterhin IAEO Kriterien für diesen Test.

Die Software führt die folgenden Funktionen: (1) Filter DCs Auswahl optimaler Metaphase Zelle Bilder zur Analyse, Chromosom 2) Anerkennung, Erkennung von DC und DC Frequenz Entschlossenheit und (3) Abschätzung der Strahlendosis von Dosis-kalibriert, zytogenetische Strahlungsdaten. Diese Software verarbeitet Gruppen von Metaphase-Bilder aus der gleichen einzelnen (bezeichnet eine Probe), zählt die Anzahl der DCs in jedes Bild, Verarbeitungstechniken und kehrt die geschätzte Strahlendosis von jeder Probe in Einheiten von grau (Gy) empfangen.

Die Software wurde entwickelt, um eine Reihe von Chromosom Strukturen, Grafen und dichten zu behandeln. Allerdings führt der Algorithmus optimal in Metaphase-Bilder, die in der Nähe von vollständige Ergänzung gut getrennt, linearen Chromosomen4enthalten. Bilder mit stark überlappende Sätze von Chromosomen, mehrere Zellen, unvollständige Metaphase Zellen, Schwester Chromatids Trennung, Kerne, nicht-chromosomalen Objekte und andere Defekte können die Genauigkeit des Algorithmus zu reduzieren. Bild-Auswahl-Modelle und andere Objekt-Segmentierung, die die Mehrheit der suboptimalen Bildern und falsche positive DCs Schwellenwerte ausfiltern können gewidmet.

Dizentrische Chromosom-Erkennung wird durchgeführt, wenn ein Bild verarbeitet wird. Der Algorithmus versucht zu ermitteln, welche Objekte in einem Bild Chromosomen sind und dann die beiden Regionen am ehesten Zentromere auf jedem Chromosom lokalisiert. Dann eine Reihe von verschiedenen Support Vector Machine (SVM) Lernmodelle Chromosomen als DCs oder Normal, monozentrische Chromosomen unterscheiden. Die SVM-Modelle unterscheiden sich in der Sensitivität und Spezifität der DC-Erkennung (siehe Schritt 3.1.4 unten), die kann die DC-Frequenzen beeinflussen, die in einer Probe bestimmt werden.

ADCI verarbeitet Sätze von Giemsa - (oder DAPI-) gebeizt Metaphase Digitalbilder (im TIFF- oder JPG-Format) für eine oder mehrere Proben. Die Software analysiert DCs Kalibrierung Proben und Proben. Die physische Dosen (Gy) Kalibrierung Proben sind bekannt und werden bei der Erzeugung von einer Kalibrationskurve verwendet. Die physikalischen und biologischen Dosen von Individuen mit unbekannten Aufnahmen werden von der Software aus der maschinengenerierte Eichkurve abgeleitet. Obwohl Labors vergleichbare Techniken verwenden, variieren die Kalibrierkurven aus verschiedenen Labors häufig3. Für genaue Dosierung Schätzung in Proben sollten beide Kalibrierung Kurve und Test-Proben aus dem gleichen Labor verarbeitet werden.

Diese Software bietet Geschwindigkeit, Genauigkeit und Skalierbarkeit welche Adressen die Produktivität erforderlich, um ein Ereignis zu behandeln, in denen viele Menschen gleichzeitig getestet werden müssen. Es wurde entwickelt von 2008-20174,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Aktuelle Computer-Hardware, diesem Desktop-VerwendungPC-Software verarbeiten kann und Schätzung Strahlendosis in einer Patientenprobe 500 Metaphase Genom äquivalenten 10-20 min 4. Der Code basiert auf einer Reihe von proprietären Bild Segmentierung und Machine learning-Algorithmen zur Chromosomenanalyse. Expertenanalyse jedes Chromosoms 3 Gy Strahlung ausgesetzt hat vergleichbare Genauigkeiten ADCI. In einem Satz von 6 Proben von unbekannten Aufnahmen (früher in eine internationale Kompetenz-Übung) schätzt die Software Dosen innerhalb 0,5 Gy der Werte durch die manuelle Überprüfung der gleichen Daten von HC und CNL, Erfüllung der IAEO Anforderungen für triage Biodosimetry. Darüber hinaus schätzt laborübergreifenden Standardisierung und Reproduzierbarkeit der Dosis profitieren von einer einen gemeinsamen, automatisierten DC scoring-Algorithmus. Dennoch erlaubt die Software Anpassung des Bildes filtern und Auswahlkriterien, damit Unterschiede im Chromosom Zubereitungsmethoden und Strahlungsquellen Kalibrierung berücksichtigt werden.

Diese Software ist eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) - basiertes System die Sätze von Chromosom Bilder mit Giemsa (oder DAPI) analysiert - gebeizt Metaphase Zellen für Anomalien, die durch Belastung durch ionisierende Strahlung entstehen. Die Bildersets sind digital fotografiert, mit einem Licht (oder Epifluorescent) Mikroskop-System und jeder Satz entspricht ein anderes Sample. Die Software nutzt Bildverarbeitungs-Techniken zur Erkennung und DCs von MCs und anderen Objekten zu unterscheiden. Empirisch abgeleitete Segmentierung Filter beseitigen dann automatisch falsche positive DCs ohne wahre DCs. Schließlich filtert die Software automatisch unerwünschte Bilder basierend auf verschiedenen Bildeigenschaften schlechter Qualität Metaphase Bilder mit vorausberechnete (oder benutzerdefinierte) Bild Auswahl Modelle gefunden. Diese Bilder sind diejenigen, die übermäßige oder unzureichende Zahl von "laut" Objekten, mehrere überlappende Chromosomen, Bilder fehlen Metaphase Chromosomen, übermäßige Anzahl von Schwester Chromatiden4. Die automatisch kuratierte Bilddaten werden verwendet, um die Dosis Kalibrierkurve aus Proben von bekannten Strahlendosis zu generieren und werden verwendet, um Aufnahmen der Proben unbekannter Dosen ausgesetzt zu schätzen.

Ausgabe der Software angezeigt und gespeichert werden kann: (1) Text-basierte Ausgabe in der Konsole angezeigt (2) Grundstücke, die als Bilder und Berichte (3) im HTML-Format gespeichert werden können. Viele Aspekte der Software sind an die spezifischen Bedürfnisse der verschiedenen Labors angepasst. Einzelnen Labors bieten in der Regel, Kalibrierung und Prüfung Proben vorbereitet und sammelte beruht auf dem zytogenetische Protokoll, die in diesem Labor überprüft. Dadurch behält Gleichförmigkeit der Probenvorbereitung und Kalibrierungskurven generiert aus Kalibrierung Proben sinnvoll angewendet werden, um zu testen, Proben mit dem gleichen Protokoll abgeleitet. Kalibrierkurven können auch aus Kurve Koeffizienten oder DC-Frequenzen bei definierten Dosen erstellt werden. Die genaueste Dosierung Schätzungen ergeben sich durch das Herausfiltern von niedriger Qualitätsbilder und falsche positive DCs (FPs). Auswahl der optimalen Bild Teilmengen innerhalb jeder Probe erfolgt mit "Bild Auswahl Modelle", die unterdurchschnittlich Bilder zu beseitigen, die tendenziell FPs einzuführen. Eine Reihe von Pre-validierte Modelle sind im Lieferumfang der Software, aber zusätzliche Modelle mit angepassten Schwellenwerte und Filter können erstellt und gespeichert, durch den Benutzer.

Nachdem die Software erfolgreich geladen wurde, wird die zentrale grafische Benutzeroberfläche (GUI) dargestellt (siehe Abbildung 1). Von dieser Schnittstelle, Proben, jeweils bestehend aus einem Ordner der Metaphase-Zelle-Image-Dateien, kann ausgewählt und verarbeitet, um DCs zu identifizieren, Eichkurven erstellt und miteinander verglichen werden können und Exposition Strahlendosis von Proben ermittelt werden kann.

Figure 1
Abbildung 1: Der Hauptsektoren des grafischen User Interface enthalten: eine Liste von Proben (1), eine Liste der Kalibrierung Kurven (2), der Prozess in die Warteschlange (3), die den Status des DC-Erkennung in jedem Satz von Bildern von jeder Probe ein Grundstück überwacht zeigen Sie (4), die statistische oder anderen quantitativen Eigenschaften aus einer Reihe von Bildern in Proben oder Kalibrierkurven und eine Konsole (5) die beschreibenden Text als Ausgänge der einzelnen Arbeitsgänge durchgeführt durch das Programm enthält zusammenfasst an. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protocol

1. Import und Prozessproben

  1. Klicken ' Proben ' in der Menüleiste und wählen Sie ' neue Probe '. Navigieren Sie zu einem geeigneten Verzeichnis enthält eine Gruppe von Metaphase Bilder und klicken Sie auf ' wählen Sie Ordner '.
  2. Geben Sie eine eindeutige ID für die Probe innerhalb der ' geben Sie eine eindeutige ID für die neue Probe ' Text-Feld. Diese ID wird die Probe im Arbeitsbereich identifizieren. Beispiel-IDs muss alphanumerisch, ' _ ', oder '-' nur Zeichen. Einbeziehung der Quelle Labor und körperliche Dosis (für Kalibrierung Proben) in der Probe-ID bekannt.
  3. (Optional) bieten eine Beschreibung der Probe auf Wunsch innerhalb der ' Beschreibung des Beispiels (Optional) ' Textbereich.
  4. Klicken Sie ' OK ' den Arbeitsbereich der neuen Probe hinzu.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 1.1 bis 1.4 zusätzliche Proben hinzufügen. Erstellen Sie ein Minimum von 3 Kalibrierung Proben (sieben oder mehr sind 3 der unterschiedlichen Belichtungen empfohlen) und mindestens eine Probe zur Dosis Schätzung durchführen.
  6. Markieren Sie alle Proben erstellt in Schritte 1.1 bis 1.5 in den ' Proben ' Liste und klicken Sie auf ' hinzufügen Probe(n) Prozess Warteschlange ' (Graphic 5) Icon.
  7. Klicken Sie ' alle Proben in der Warteschlange zu verarbeiten ' (Graphic 6)-Symbol, um alle Proben nacheinander in die Queue - Verarbeitung ein ' ADCI Verarbeitung ' Dialogfeld angezeigt wird, enthält alle Proben in der Warteschlange zusammen mit einem Fortschritt bar.
  8. Abschluss aller Proben Verarbeitung, klicken Sie auf die Graphic 9. Proben jetzt speichern, oder klicken Sie auf ' verarbeiteten Probe in eine ADCI Beispieldatei speichern ' (Graphic 7) Symbol, um eine verarbeitete Probe später speichern.

2. Anzeige und Auswahl der Bilder (Optional, empfohlen Schritt)

Hinweis: Diese Schritt beschreibt die Verwendung der Metaphase-Image-Viewer und Schaffung eines Bild-Auswahl-Modells. Einige validierten Bild Auswahl Modelle sind zusammen mit der Software die Kalibrierung Kurve und Dosis-Schätzung verwendet werden kann. So, dieser Schritt ist nicht erforderlich, aber es als ein Leitfaden beschreibt Schritte, die dazu erforderlichen falls gewünscht verwendet werden kann.

  1. Markieren Sie eine Probe innerhalb der ' Proben ' Liste, klicken Sie ' Proben ' im Menü, und wählen Sie ' Bildansicht ' öffnen die ' Metaphase Image Viewer ' .
  2. Navigation unter Bilder
    1. Wählen Sie ein Bild aus der Dropdown-Box um ein bestimmtes Bild anzuzeigen. Klicken Sie auf die linken und rechten Pfeil-Symbole, um durch Bilder blättern.
    2. Wählen Sie einen SVM Sigma Wert aus der Dropdown-Box DC Detektionsergebnisse mit diesem Sigma-Wert anzeigen. Wählen Sie " unbearbeitet " aus der Dropdown-Box um raw-Bilder ohne Chromosom Umrisse sehen.
    3. Überprüfen Sie die ' invertieren ' Kontrollkästchen, um Farbe und Helligkeit Werte für jedes Pixel im Bild invertieren.
  3. Prüfen Sie die ' Bild in Merkliste ' Kontrollkästchen, um das sichtbare Bild hinzufügen ein ' Merkliste '. Klicken Sie auf ' Save the Watch List in eine Textdatei ' (Graphic 3) Symbol, um die Namen aller Bilder in der Liste in eine Textdatei speichern.
  4. Bild Auswahl Modelle
    1. Klicken ' alle Images ' (die Standardauswahl), alle Bilder in der Bild Auswahl Dropdown-Box aufzunehmen. Beobachten Sie den Text neben ' Bilder, ', den Anteil der Bilder von der derzeit angewandten Bild-Auswahl-Modell ausgewählt zu entdecken.
    2. Klicken Sie ' Ansicht enthaltenen Bilder ' nur diese Bilder enthalten, die nicht durch die Bild-Auswahl-Modell in der Dropdown-Box ausgeschlossen worden sind.
    3. Klicken Sie ' Ansicht ausgeschlossen Bilder ', Bilder aufzunehmen, die durch die angewandte Bild-Auswahl-Modell in der Dropdown-Box ausgeschlossen worden sind.
    4. Prüfung der ' ausschließen ' Kontrollkästchen, um ein einzelnes Bild manuell ausschließen.
      Hinweis: Manuell ausgeschlossenen Bilder werden wiederhergestellt, um das ausgewählte Bild gesetzt, wenn eine Bild-Auswahl-Modell anschließend angewendet wird.
    5. Eine Auswahl von Bildern speichern, indem Sie auf die ' Auswahl speichern ' Taste. Geben Sie einen Dateinamen für die gespeicherte Auswahl, wenn Sie aufgefordert werden. Klicken Sie auf ' Auswahl laden ', eine zuvor gespeicherte Auswahl anzuwenden.
    6. Klicken Sie ' Bildfilter anwenden ' öffnen die ' Apply Filter-basierte Bild Auswahlmodell aktuelle Probe ' Dialog, der erstellt wird, speichert oder Kriterien für die Auswahl der Metaphase Bilder in einer Probe gilt.
    7. Wählen Sie ein Bild Auswahlmodell Wochentage aus. Klicken Sie auf ' OK ', das aktuelle Modell anzuwenden.
    8. Geben Sie eine Beschreibung für eine neue Wunschmodell, definieren ' Bild Ausschlussfilter ', definieren ' Image Ranking und Eingliederung ', und klicken Sie auf ' sparen Auswahlmodell ' ein Bild erstellen Auswahlmodell.
      Hinweis: Definitionen von ' Image Ranking und Integration ' Methoden und jeder ' Image-Ausschluss-Filter ' finden Sie im Software-Onlinedokumentation 14.

3. Generation-Kurve

  1. (Recommended optional step) Kurve Kalibrierungsassistent
    1. Vergewissern Sie sich mindestens drei Kalibrierung Proben sind in den Arbeitsbereich, bevor Sie fortfahren. Klicken Sie auf ' Zauberer ' in der Menüleiste und wählen Sie ' Kurve Kalibrierung ' um die Kurve-Kalibrierung-Assistenten zu öffnen.
      Hinweis: Obwohl nur drei Proben mathematisch erforderlich sind, um zu passen und eine Kalibrierungskurve zu berechnen, werden sieben oder mehr Proben umfassen eine Reihe von Aufnahmen zwischen 0 und 5 Gy empfohlen. Zusätzlichen Proben sind notwendig, um die Eichkurve zu einer linear-quadratische Dosis-Antwort passen jedoch die optimale Sigma-Werte niedriger sein können, um Kurven zu erhalten, die für niedrige Dosis Abschätzung verwendbar sind (< 1 Gy); die optimale Sigma-Werte für Dosen oberhalb dieser Schwelle sind unterschiedlich (siehe Schritt 3.1.4).
    2. Gehen Sie durch den einleitenden Assistenten Bildschirm und setzen Sie ein Häkchen neben jede gewünschte Kalibrierung Probe. Für jede Kalibrierung Probe auf diese Weise ausgewählt, geben Sie die physischen Dosis (in Gy) die Probe innerhalb seiner angrenzenden Textfeld ausgesetzt war. Auf der nächsten Seite des Assistenten fortzufahren.
    3. Wählen Sie eine Bild-Auswahl-Modell aus der Liste der Modelle auf Wunsch mit voreingestellten Bild-Auswahl-Modelle mit der Software zusätzlich zu einer manuell erstellten Modelle gebündelt. Auf der nächsten Seite des Assistenten fortzufahren.
    4. Wählen Sie einen SVM Sigma-Wert aus der Dropdown-Box. Weiter auf der nächsten Seite des Assistenten .
      Hinweis: Ein SVM Sigma-Wert von 1,4 oder 1,5 empfiehlt sich für Dosis schätzt > 1 Gy und ein Wert von 1,0 für Schätzungen unter 1 Gy ( Abbildung 2).
    5. Überprüfen Sie alle vorherigen Auswahl auf dem Bildschirm "Zusammenfassung" und klicken Sie auf ' Ende ' zum Abschließen des Assistenten, wodurch eine PrepopulatEd ' erstellen Sie einen Bogen ' Dialogfeld angezeigt werden.

Figure 2
Abbildung 2: Visualisierung der die Auswirkungen einer Änderung den SVM-Sigma-Wert der Positive prädiktive Calue (PPV) und True Positive Rate von der Algorithmus auf die wahren positiven (TP) und False Positive (FP) DC zählt (TPR). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Erstellen Sie ein Dialogfeld "Kurve".
    1. (Überspringen Sie diesen Schritt, wenn Assistenten verwendet wurde) Klicken Sie auf ' Kurven ' in der Menüleiste und wählen Sie ' neue Kurve '. Wählen Sie ' passende Kurve zu Dosis-Wirkungs-Daten ' aus der Dropdown-Box präsentiert im Dialogfeld und klicken Sie auf ' OK '.
    2. Geben Sie eine eindeutige Identität für die Kurve in der ' geben Sie eine eindeutige Identität für die neue Kurve ' Textfeld innerhalb der ' erstellen Sie einen Bogen ' Dialogfeld ".
    3. (Optional) geben Sie eine Beschreibung für die neue Kurve innerhalb der ' eine kurze Beschreibung für die Kurve zu erstellenden ' Textfeld.
    4. (Überspringen Sie die folgenden Schritte, wenn der Kurve-Assistent zum Erstellen einer Kalibrationskurve verwendet wurde) setzen Kurvenwerte.
      Hinweis: Die Kurve Kalibrierungsassistent in Schritt 3.1 beschriebenen prepopulates Felder in der ' erstellen Sie einen Bogen ' Dialogfeld. Unten wird beschrieben, wie Sie diese Felder manuell auffüllen. Wenn der Assistent verwendet wurde, können auf Wunsch hinzufügen oder Entfernen von Zusatzdaten noch einige Schritte weiter unten folgen.
      1. Wählen Sie einen SVM Sigma-Wert von Optionen in der ' SVM ' Dropdown-Box - es wird dringend empfohlen, dass der Sigma Wert gewählt, hier entsprechen den Sigma Wert gewählt, wenn Sie diese Kurve Dosis Schätzung durchführen.
      2. (Optional) geben Sie eine Bild-Auswahl-Modell durch Klicken auf die ' geben Sie Datei ' Schaltfläche ".
      3. Klicken Sie ' Input ', fügen Sie einen neuen leeren Eintrag zur Dosis-Wirkungs-Liste unter der Überschrift ' Eingabe Antwort-Dosis-Daten erstellen Sie einen Bogen '.
      4. Geben Sie die Dosis einer Kalibrierung Probe in Gy unter der Überschrift ' Dosis '.
      5. Enter ' Reaktion (DC/Zelle) ' Beispiel für die Ausgabe in der Konsole entnommen, wenn eine Probe markiert ist. Suchen Sie den entsprechenden DC/Zelle Wert für die zuvor gewählte SVM Sigma-Wert in der Konsole oder von den entsprechenden Beispielbericht (Schritt 5.1, falls vorhanden) und in dieses Feld eingeben.
      6. Wiederholen Sie die vorherigen drei Schritte, bis alle Kalibrierung Beispiele hinzugefügt wurden.
    5. Presse ' validieren Daten ' um den Inhalt der Antwort-Dosis zu gewährleisten ist die Liste korrekt formatiert – stellen Sie sicher, alle Felder in der Dosis-Antwort-Liste sind grün markiert, zeigt gültige Daten.
    6. Presse ' OK ', die Schaffung der Kurve abzuschließen. Speichern die neue Kurve in der ' Kurve speichern? ' Dialog erscheint beim Drücken ' OK '. Oder klicken Sie auf ' sparen Kurve zu einer ADCI Kurve Datei ' (Graphic 4) Symbol hervorgehoben innerhalb der ' Kurven ' Liste später.

4. Dosis Schätzung

  1. (Recommended optional step) Dosis Schätzung Assistenten
    1. Klicken ' Zauberer ' in der Menüleiste und wählen Sie ' Dosis Schätzung '.
    2. Gehen Sie durch die einleitenden Seite des Assistenten und wählen Sie eine zuvor erstellte Kalibrationskurve aus der Dropdown-Box - werden unter dessen Eigenschaften angezeigt. Auf der nächsten Seite des Assistenten fortzufahren.
    3. Setzen Sie ein Häkchen neben Proben von unbekannten Exposition zum einschließen in Dosis Schätzung. Auf der nächsten Seite des Assistenten fortzufahren.
    4. Beachten Sie die Beschreibung und die Eigenschaften des Modells Bild Auswahl während der Kalibrierung Kurve Generation angewendet. Beachten Sie, dass das gleiche Bild-Auswahl-Modell auf den ausgewählten Proben angewendet wird. Auf der nächsten Seite des Assistenten fortzufahren.
      Hinweis: Unterhalb der Beschreibung des Bild-Auswahl-Modell, das gleiche Modell ist aufgefüllt und auf die Auswahl Proben angewendet werden. Gelten Sie die gleichen Bild-Auswahl-Modell für Kalibrierung und testen Sie Proben. Es ist, zwar möglich, anderes Bild Auswahl Modelle anwenden, indem Sie ein anderes Modell aus der Dropdown-Liste auswählen wird dies nicht empfohlen.
    5. Einen SVM Sigma Wert aus der Dropdown-Liste auswählen. Auf der nächsten Seite des Assistenten fortzufahren.
      Hinweis: Der SVM Sigma-Wert während der Kalibrierung Kurve Generierung verwendet wird aufgefüllt. Es wird empfohlen, dass dieser Wert unverändert.
    6. Überprüfen die vorherige Auswahl auf der Übersichtsseite und klicken Sie auf ' Ende ' zum Abschließen des Assistenten - einen vorausgefüllten ' Dosis Rechner ' Dialogfeld wird angezeigt.
  2. Dosis Rechner
    1. (überspringen Sie diesen Schritt, wenn Assistenten verwendet wurde) markieren Sie eine Eichkurve aus der Liste der Kurven unter der Überschrift ' Kurven ', klicken ' Kurven ' im Menü, und wählen Sie ' Dosis berechnen ' öffnen die ' Dosis Rechner ' Dialogfeld ".
    2. (Überspringen Sie diese Schritte, wenn Assistenten verwendet wurde) legen Sie Werte für die Abschätzung der Dosis.
      Hinweis: In Schritt 4.1 beschriebenen Dosis Schätzung-Assistenten prepopulates Felder in der ' Dosis Rechner ' Dialogfeld. Unten wird beschrieben, wie Sie diese Felder manuell auffüllen. Wenn der Assistent verwendet wurde, können auf Wunsch hinzufügen oder Entfernen von Zusatzdaten noch einige Schritte weiter unten folgen.
      1. Klicken ' Verwendung Probe(n) im Arbeitsbereich, DC Frequenzen zu füllen ' (Graphic 8) Symbol und Highlight Proben innerhalb der ' verarbeitet Proben in ADCI Arbeitsbereich ' Liste hinzufügen zu ausgewählten Proben der ' DC-Frequenzen für die Abschätzung der Dosis ' Liste.
      2. Wählen Sie eine SVM Sigma Wert und das Image Auswahlmodell für diese Beispiele aus der Auswahlboxen.
        Hinweis: Ein SVM Sigma Wert der Sigma Wert bei Kalibrierung Kurve Erzeugung verwendet ist erforderlich für die genaue Dosierung-Schätzung. Der Sigma Wert zugeordnet die Eichkurve notiert am unteren Rand der ' Dosis Rechner ' Dialog.
      3. (optional) hinzufügen zusätzliche Proben durch die beiden vorherigen Schritte wiederholen. Alternativ fügen Sie mehrere Proben gleichzeitig durch Markieren mehrerer Proben in die ' verarbeitet Proben im Arbeitsbereich ' Liste.
      4. (optional) Klicken Sie auf die ' DC-Frequenz Eingabewert ' (Graphic 1) Symbol D manuell eingebenC-Frequenz, die nicht im Zusammenhang mit einer Probe falls gewünscht - die neue DC Frequenz hinzugerechnet werden die ' DC Aberrationen zur Abschätzung der Dosis ' Liste.
      5. (optional) Doppelklicken Sie auf die ' Name ' Feld einer manuell eingegebenen DC Frequenz, seinen Namen zu ändern.
      6. (optional) Highlight geeigneter Proben und klicken Sie auf ' entfernen DC Frequenz ' (Graphic 2)-Symbol, um Proben zu entfernen, die hinzugefügt wurden die ' DC Aberrationen zur Abschätzung der Dosis ' Liste fehlerhaft.
    3. Klicken ' OK ' schließen die ' Dosis Rechner ' und Abschätzung der Dosis führen - Ergebnisse werden in der Konsole ausgegeben.
    4. Zu beobachten, wie Dosis Schätzergebnisse in der Konsole in tabellarischer Form für jede Probe angezeigt werden ' DC Frequenz ', ' SVM ', ' geschätzte Dosis ' (enthält die geschätzte biologische Dosis des Prüflings in Gy), und ' angewendet Bildmodell Auswahl ' Felder.

5. Berichterstattung

Hinweis: die Methode verwendet, um einen Bericht zu nennen, und wählen ein Verzeichnis, in dem es gespeichert ist, ist üblich, alle Berichtstypen. A ' Berichtnamen ' zur Verfügung gestellt werden müssen. Wenn ein Bericht erstellt wird, wird ein Verzeichnis mit Dateien mit diesem Namen automatisch erstellt werden. Dieses Verzeichnis platziert werden innerhalb der ' Berichtordner '. Standardmäßig die ' Berichtsordner ' ist ein Verzeichnis mit dem Namen ' Berichte ' in das Datenverzeichnis während der Installation angegeben gefunden.

  1. Beispielbericht
    1. Klicken ' Bericht ' in der Menüleiste und wählen Sie ' Beispielbericht ' öffnen die ' generieren Beispielbericht ' Dialog.
    2. Geben Sie einen Namen für den Bericht in der ' Name des Berichts ' Text-Feld. Klicken Sie auf ' durchsuchen ' ändern die ' Berichtsordner ' Wunsch.
    3. Wählen Sie mindestens eine verarbeitete Probe in den Bericht aufzunehmen, indem man ein Häkchen neben geeigneter Proben in die ' wählen Sie Proben ' Liste.
    4. Geben Sie eine Palette von SVM Sigma-Werte für die DC Verteilung Grundstücke generiert durch Auswählen von Werten in ' Min ' und ' Max ' Drop-Down-Boxen innerhalb der ' Verteilung von DCs in Probe ' Bereich. DC Verteilung Grundstücke aus dem Bericht ausschließen, indem Sie deaktivieren auf Wunsch die ' gehören ' Kontrollkästchen in der ' Verteilung von DCs in Probe ' Bereich.
    5. Angeben, welche Grundstücke mit Filterung Statistiken in den Bericht aufnehmen indem man Häkchen neben geeignete Grundstücke in der ' wählen Sie Grundstücke ' Bereich. Klicken Sie auf ' OK ' für die Berichterstellung.
  2. Kurve Bericht
    1. Klicken ' Bericht ' in der Menüleiste und wählen Sie ' Kurve Bericht ' öffnen die ' Kurve Bericht generieren ' Dialogfeld ".
    2. Geben Sie einen Namen für den Bericht in der ' Name des Berichts ' Text-Feld. Klicken Sie ' suchen ' ändern die ' Berichtsordner ' Wunsch.
    3. Wählen Sie mindestens eine Kurve, die in den Bericht aufzunehmen, indem man ein Häkchen neben entsprechenden Kurven in der ' wählen Sie Kurven in den Bericht aufgenommen werden ' Liste. Klicken Sie auf ' OK ' für die Berichterstellung.
  3. Dosis Schätzung Bericht
    1. Perform Schätzung Dosisschritten beschrieben in Abschnitt 4.
      Hinweis: Dosis Schätzung Berichte entstehen aus den Ergebnissen in den Bereichen Grundstück und Konsole angezeigt. So eine Dosis Schätzung Handlung vorliegen muss in die Zeichnungsfläche zum Zeitpunkt wird ein Bericht generiert.
    2. Klicken Sie ' Bericht ' in der Menüleiste und wählen Sie ' Dosis Schätzung Bericht ' öffnen die ' generieren Dosis Schätzung Bericht ' Dialogfeld ".
    3. Geben Sie einen Namen für den Bericht in der ' Name des Berichts ' Text-Feld. Klicken Sie ' suchen ' ändern die ' Berichtsordner ' Wunsch.
    4. Klicken Sie ' OK ' für die Berichterstellung.

6. Audit-Funktionen

Hinweis: die Software zeichnet alle Vorgänge in einer Log-Datei während einer Sitzung durchgeführt. Das Programm bietet eine Zubehör Software-Anwendung, mit der die Log-Dateien angezeigt werden, gesucht, verwendet, um die Integrität einer Analyse und in einigen Fällen zu bewerten kann, Wiederherstellen von Beispieldaten aus unvollständigen oder vorzeitig beendet Sitzungen.

  1. Klicken ' helfen ' in der Menüleiste und wählen Sie ' Protokolle anzeigen ' Log-Datei-Viewer zusätzliche Software öffnen.
  2. -Sicher-Log-Dateien finden Sie in der Seitenleiste auf der linken Seite des Fensters. Wenn keine Dateien angezeigt werden, klicken Sie ' Datei ', wählen ' Select Protokolldateiverzeichnis ', und navigieren Sie zu einem Verzeichnis Log-Dateien.
  3. Doppelklicken Sie auf den Namen der Protokolldatei in der Seitenleiste anzuzeigenden Inhalt der Log-Datei in den ' Betrachter ' tab.
  4. Wählen Sie die ' Suche ' Registerkarte "und Eingabe Suchbegriffe ein oder mehrere Log-Dateien zu suchen.
    1. Eingabe Suchparameter auf Wunsch in der ' von ', ', ', ' Benutzer ', ' Lizenz ', ' Operation ', und ' Parameter ' Felder.
    2. Wählen mithilfe des Schiebereglers die ' Max Suchergebnisse für jede Datei '.
      Hinweis: Einige Such-Parameter, wie z. B. Benutzername, kehren viele Ergebnisse in jeder entsprechenden Log-Datei. Dieser Parameter begrenzt die Anzahl der Suchergebnisse in jede Protokolldatei angezeigt.
    3. Setzen Sie ein Häkchen in die ' Suche markiert nur Dateien ' Checkbox (alle Log-Dateien sind standardmäßig durchsucht) und Höhepunkt log-Dateien in der Seitenleiste, nur eine Teilmenge der Log-Dateien zu suchen.
    4. Überprüfen die '-Integritätsprüfung durchführen ' Checkbox (standardmäßig aktiviert) zu prüfen, jede Protokolldatei berechtigt, Fehler im Zusammenhang mit einer unerwarteten Software Beendigung gesucht werden.
    5. Klicken Sie ' Suche ' Log-Dateien zu suchen und beobachten Suche ergibt sich auf der rechten Seite des Fensters.
    6. Klicken Sie auf die ' View Log-Datei ' Button neben zu einem Suchergebnis zu markieren und anzeigen die angegebene Zeile in der ' Betrachter ' tab.
  5. Log Datei Integritätsprobleme
    1. Klicken Sie auf die ' Integrität ' Registerkarte Anzeigen von Fehlern während der Integritätsprüfung (wenn die Prüfung beantragt wurde).
      Hinweis: Eine Suche muss durchgeführt werden, um die Log-Dateien für Fragen der Integrität zu prüfen. Eine Integritätsprüfung durchführen, ohne Log-Dateien für die Suche einy Suchbegriffe, lassen Sie alle Suchfelder Parameter in Schwarz die ' Suche ' tab, stellen Sie sicher die '-Integritätsprüfung durchführen ' wird überprüft, und klicken Sie auf ' Suche '. Wenn Integritätsprobleme gefunden werden, die ' Integrität ' Registerkarte "Hintergrundfarbe werden rot
    2. Entschlossenheit Integrität Probleme (Ausgang ist gruppiert nach Log-Datei) wo möglich.
      Hinweis: Weitere Informationen über Schritte zur Behebung von Problemen mit der Datenintegrität, finden Sie in der Onlinedokumentation 14.

7. Kurve und Dosis Schätzung Statistikoptionen

  1. Klicken ' Einstellungen ' in der Menüleiste und wählen Sie ' Statistikoptionen ' öffnen die ' Statistikoptionen ' Dialogfeld ".
  2. Wählen Sie eine Kalibrierung Kurvenanpassung Methode (kleinste Quadrate oder Maximum-Likelihood) aus der Dropdown-Box.
  3. Setzen Sie ein Häkchen neben ' Kalibrierung Kurve 95 % CI, anzeigen, ggf. ' 95 %-Konfidenzintervall anzeigen beim Plotten einer Kalibrationskurve.
  4. Setzen Sie ein Häkchen neben ' Dosis Schätzung berechnet 95 % CI aufgrund Poisson ' 95 % Vertrauensbereich Dosis Schätzungen anhand der Poisson-Natur der DC Ertrag berechnen.
  5. Setzen Sie ein Häkchen neben ' Dosis Schätzung berechnet 95 % CI durch die Kurve, ggf. ' 95 % Vertrauensbereich Dosis Schätzungen anhand der Unsicherheit im Zusammenhang mit der Kalibrierkurve berechnen.

Representative Results

Testen der Software erfolgte mit Metaphase-Chromosom Bilddaten aus HC und CNL gewonnen. Blutproben wurden durch ein XRAD-320-Gerät bestrahlt (250 kV Röntgenstrahlung, 12,5 mA, 2mm Al Filtration, Dosisleistung: 0.92 oder 1,7 Gy/min) mit einer Ionisationskammer bei HC kalibriert und bei beiden Laboratorien verarbeitet. Periphere Lymphozyten Blutproben wurden kultiviert, fixiert und gefärbt in jeder Anlage nach etablierte Protokolle3,15. Metaphase Bilder von Giemsa gefärbten Folien wurden unabhängig von jeder Übungseinheit mit einem automatisierten Mikroskopie-System aufgenommen. Experten in jedem Labor erzielte DCs in mehreren dieser Proben manuell, konstruiert ihre eigene Eichkurven und Dosen von Proben von unbekannten Aufnahmen geschätzt. Eine detaillierte Beschreibung dieser Datensätze ist in Tabelle 1.

Physische Dosis Zweck HC-Vorbereitung CNL-Vorbereitung
Genannten Namen # Bilder Genannten Namen # Bilder
0 Gy Kalibrierung HC0Gy 731 CNL0Gy 798
0,1 Gy Kalibrierung HC01Gy 2162 NA NA
0,25 Gy Kalibrierung HC025Gy 1826 NA NA
0,5 Gy Kalibrierung HC05Gy 1054 CNL05Gy 1532
0,75 Gy Kalibrierung HC075Gy 1233 NA NA
1 Gy Kalibrierung HC1Gy 1566 CNL1Gy 841
2 Gy Kalibrierung HC2Gy 1147 CNL2Gy 996
3 Gy Kalibrierung HC3Gy 1212 CNL3Gy 1188
4 Gy Kalibrierung HC4Gy 909 CNL4Gy 1635
5 Gy Kalibrierung HC5Gy 1019 NA NA
3.1 Gy Test HCS01 540 CNLS01 500
2.3 Gy Test HCS08 637 CNLS08 500
1.4 Gy Test HCS10 708 NA NA
1,8 Gy Test HCS04 600 CNLS04 957
2.8 Gy Test HCS05 1136 CNLS05 1527
3.4 Gy Test HCS07 477 CNLS07 735

Tabelle 1: Quellen von Bilddaten vorgesehenen Evaluierung der Software von HC und CNL.
Fußnote: Von Tabelle 1 in Rogan Et Al., 20164geändert. Nur manuell vorgewählten Bilder wurden uns von CNL zuvor zur Verfügung. Ungefilterte Bilder sind verfügbar geworden und Bild zählt werden entsprechend aktualisiert. Zusätzlich, neu erworbene HC Proben (0.25Gy, 0.75Gy und 5Gy) werden hier vorgestellt.

Automatische Bildauswahl in Proben

Die Bildqualität ist entscheidend für die richtige DC-Erkennung in DC-Analyse. Bildauswahl durch zytogenetische Spezialisten erfolgt in der Regel manuell in konventionellen DC-Analyse. ADCI verwendet quantitative Bild Kriterien automatisch Bilder vor DC Frequenz Berechnung16auswählen. Benutzer können entweder Filter Bilder basierend auf bestimmten Chromosom Morphologien und/oder Art Zellen nach relativen Anteile der Längen von Objekten nach bekannten Längen der zytogenetischen definierte Gruppen von Chromosomen in einen normalen menschlichen Karyotyp (bezeichnet die Gruppe-bin Distance-Methode). Die morphologische Filter verwenden, Scale-Invariant Schwellenwerte um Zelle Bilder mit unvollständigen Chromosom-Sets oder mit mehreren Metaphasen mit prometaphase Chromosomen, mit prominenten Schwester abzulehnen Chromatids Dissoziation, mit stark verbogen und verdreht Chromosomen, mit Objekten mit weichen Konturen, die charakteristisch für intakte Kerne, und diejenigen, in denen weniger Objekte als Chromosomen anerkannt sind. Abbildung 3 (a) und (b) zeigen Beispiele von ausgewählten Bildern, während Abbildung 3 (c) und (d) sind Beispiele für Bilder, die von der Software herausgefiltert werden. Diese Bilder stammen von Probe HCS05 (siehe Tabelle 1) und werden durch die vordefinierten Bild Auswahlmodell, das alle Bilder von Gruppe bin Abstand zählt, dann wählt die besten 250 Bilder ausgewählt. Chromosomen in Abbildung 3 (A), (b) sind gut getrennt und zufriedenstellende Morphologie aufweisen. Abbildung 3 (c) enthält eine übermäßige Anzahl überlappende Chromosom Cluster. Abbildung 3 (d) zeigt schwere Schwester Chromatids Trennung. Schwester-Chromatiden sind vollständig für mindestens 8 der Chromosomen getrennt und die Zentromer Verengungen sind eindeutig in den meisten anderen Chromosomen.


Figure 3
Abbildung 3: Beispiele für Metaphase Bilder im Beispiel HCS05 (Vergrößerung: 63 X), Unselected und Selected durch das Modell 'Gruppe Bin Distanz, Top 250 Bilder'. (A) und (B) sind ausgewählte Bilder. (C) und (D) sind Bilder, die durch das Modell beseitigt worden sind. (C) wurde ausgeschlossen, weil es zu viele überlappende Chromosomen enthielt und (D) übermäßige Anzahl von getrennten Schwester hatte Chromatiden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Die Auswirkungen der Anwendung dieser Bild-Auswahl-Modelle zeigt sich durch die Untersuchung der Vertrauensebene des DC-Erkennung in einer Probe. Vorkommen von DCs in einer Bevölkerung der Zellen aus einer bestrahlten Probe folgen eine Poisson-Verteilung. Der Chi-Quadrat-Güte-von-Fit-Test vergleicht die beobachteten DC-Häufigkeitsverteilung der erwarteten Passform, die Poisson-Verteilung. Modelle, dass richtig Filter Beispieldaten DC Frequenzen nicht wesentlich von den erwarteten Poisson zeigen abgeleitete Werte (in der Regel Signifikanzniveau > 0,01). Abbildung 4 zeigt DC vorkommen und die entsprechenden passt zu Poisson-Verteilungen für die HC4Gy Probe aller Bilder vs. nur Bilder von der "Gruppe bin Abstand, Top 250 Bilder" Modell ausgewählt. Abbildung 4 (b) zeigt eine bessere Passform, die Poisson-Verteilung. P-Wert (0,36) von den gefilterten Satz von Bildern übertrifft deutlich die ungefilterte DC-Verteilung in Abbildung 4 (a). Bei 5 % oder 1 % Bedeutung Ebenen das ungefilterte Beispiel in Abbildung 4 (a) ist weniger zuverlässig, da es niedrigerere Qualität DC Daten enthält, als die Nullhypothese einer Poisson-Verteilung der DCs wird abgelehnt.

Figure 4
Abbildung 4: Screenshots von verhältnismäßig DC Frequenzen passen zu Poisson Dstributions der Probe HC4Gy in der Software. (A) sind alle Bilder enthalten, (B) nur ausgewählten Modell (Gruppe bin Abstand, Top 250 Bilder) Bilder enthalten sind. Die Legende (rechts oben) zeigt die Statistik der Anpassung an die Poisson-Verteilung (Dispersion Index, Mu Test- und Lambda) und der Chi-Quadrat-Güte der Dichtsitzprüfung (p-Wert) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Dizentrische Chromosom (DC) Erkennung

Genaue Erkennung von DC ist die entscheidende Voraussetzung des ADCI. Richtig erkannt, dass DCs und diejenigen von der Software verpasst bzw. als wahren positiven (TPs) und false Negatives (FNs) definiert sind. Objekte, die nicht DCs, aber falsch erkannt als DCs, gekennzeichnet als Fehlalarme (FPs). FPs sind monozentrischen Chromosomen, Chromosom Fragmente, getrennte Schwester Chromatiden, überlappende Chromosom Cluster und nicht-chromosomalen Objekte. Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse der DC-Erkennung in zwei Metaphase Bilder. Objekte 1 und 3 sind TPs, Objekt 4 ein FP, bestehend aus zwei unterschiedliche monozentrischen Chromosomen entlang ihren kurzen Armen verbunden ist. In Abbildung 5 (a) Objekt 2 war ursprünglich ein FP, aber anschließend durch FP-Filter in der Software korrigiert. 5 und 6 Objekt in Abbildung 5 (b) sind wahrscheinlich Beispiele für FNs.

Figure 5
Abbildung 5: Screenshots zeigen Metaphase-Chromosom Klassifizierung von potenziellen DCs. (A) Ein Bild in Probe CNL1Gy (Vergrößerung: 63 X) zeigt 1 TP, Objekt "1"; und 1 korrigiert FP, Objekt "2". (B) ein Bild in Probe CNL4Gy (Vergrößerung: 63 X) zeigt 1 TP, Objekt "3"; 1 FP, Objekt "4"; und 2 mögliche FNs, Objekte "5" und "6". TPs, korrigierte FPs, normale monozentrischen und nicht klassifizierte Chromosomen werden jeweils mit rot, gelb, grün und blau Konturen umrissen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abschätzung der Dosis der Prüflinge

Das Endergebnis der ADCI Analysen sind, dass die Dosis von Proben aus Kalibrierkurven abgeleitet schätzt. Dosis-Schätzungen, die von der Software der Prüflinge in Tabelle 1 sind in den Tabellen 2 und 3angegeben. Zum Vergleich: die physische Strahlendosis abgegeben und die manuelle erzielten Dosen von Experten bei HC für Proben HCS01, HCS08 und HCS10 sind angegeben. Ebenso werden die physikalischen und erzielte Dosen von CNL Experten-Handbuch für CNLS04, CNLS05 und CNLS07 angezeigt.

Abbildung 6 zeigt Kalibrierkurven mit Strahlung Dosis Schätzungen für Health Canada Biodosimetry Laborproben HCS08, HCS10, HCS04, HCS05, HCS01 und HCS07. Die Kalibrierkurve wird anhand von Proben, HC0Gy, HC1Gy, HC2Gy, HC3Gy und HC4Gy erstellt. Die Bild-Auswahl-Modell mit 3 Z-Score-basierte Filter + "Gruppe bin Entfernung, Top 250 Bilder" gilt für alle Proben. Dosis Schätzungen zusammen mit zugehörigen statistischen Analysen sind in Tabelle 2dargestellt.

Figure 6
Abbildung 6: Screenshot der Dosis Schätzung der HC Prüfmuster. Schwarze Quadrate repräsentieren Kalibrierung Proben. Bilder im Test und Kalibrierung Proben werden durch das Modell (3 FP-Filter + Gruppe bin Entfernung, Top 250 Bilder) ausgewählt. Dicke gestrichelte Linien repräsentieren die Zuordnung von DCs/Metaphase durch die Eichkurve auf geschätzte Dosis. Dünne gepunktete Linien bezeichnen oberen und unteren 95 % Vertrauensbereich von DCs/Metaphase. Farbcodes der Prüfmuster: hellrot, HC-S01 (physische Dosis: 3.1Gy, HC abgeleitet Dosis: 3.4Gy, ADCI: 3Gy); dunkelgrün, HC S04 (physische Dosis: 1.8Gy, ADCI: 1.85Gy); leuchtend blau, HC S05 (physische Dosis: 2.8Gy, ADCI: 2.95Gy); dunkelblau, HC S07 (physische Dosis: 3.4Gy, ADCI: 2.35Gy); dunkelrot, HC S08 (physische Dosis: 2.3Gy, HC abgeleitet Dosis: 2.5Gy, ADCI: 2Gy); hellgrün, HC S10 (physische Dosis: 1.4Gy, HC abgeleitet Dosis: 1.4Gy, ADCI: 0.95Gy). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Proben Physische Dosis HC abgeleiteten Dosis ADCI geschätzte Dosis Geschätzte Dosis LCL Geschätzte Dosis UCL P-Wert *
HCS01 3.1 3.4 3 2.3 3.8 0.117
HCS08 2.3 2.5 2 1.4 2.7 0.815
HCS10 1.4 1.4 0.95 0,5 1,55 0.211
HCS04 1.8 NA 1,85 1.25 2,55 0.0293
HCS05 2.8 NA 2.95 2.25 3.75 0.00354
HCS07 3.4 NA 2.35 1.7 3.1 0,0002

Tabelle 2: Dosis Schätzergebnisse des HC Testproben.
Fußnote: Aus Tabelle 3 in Rogan Et Al., 20164geändert. ADCI Dosis Schätzungen bisher beruhten auf ungefilterte Bilder und Kurvenanpassung erfolgte mittels der Methode der kleinsten Quadrate. Hier die Eichkurve war fit mit der Maximum-Likelihood-Methode und eine Bild-Auswahl-Modell mit 3 FP-Filter + "Gruppe bin Entfernung, Top 250 Bilder" vor Abschätzung der Dosis angewendet wurde. Geschätzte Dosis UCLund LCL siehe Dosis Schätzung oberen und unteren 95 % Vertrauensbereich basierend auf die Poisson-Art der DC Ertrag. * Chi Quadrat Anpassungsgüte zur theoretischen Poisson-Verteilung; NA: Ergebnisse der manuell abgeleiteten Dosis wurden nicht angegeben.

Strahlendosis schätzt für Proben aus kanadischen Nuclear Laboratories CNLS04, CNLS05, CNLS07, CNLS01 und CNLS08 sind in Abbildung 7dargestellt. Die Kalibrierkurve wird anhand von Proben, CNL0Gy, CNL0.5Gy, CNL1Gy, CNL2Gy, CNL3Gy und CNL4Gy erstellt. Ein Bild-Auswahl-Modell, bestehend aus 6 FP-Filter auf alle Proben haben wir angewendet. Die Ergebnisse mit statistischen Analysen sind in Tabelle 3dargestellt.

Figure 7
Abbildung 7: Screenshot der Dosis Schätzung der CNL Prüfmuster. Schwarze Quadrate repräsentieren Kalibrierung Proben. Bilder im Test und Kalibrierung Proben sind mit 6 FP Filter ausgewählt. Dicke gestrichelte Linien repräsentieren die Zuordnung von DCs/Metaphase durch die Eichkurve auf geschätzte Dosis. Dünne gepunktete Linien bezeichnen oberen und unteren 95 % Vertrauensbereich von DCs/Metaphase. Farbcodes der Prüfmuster: hellrot, CNL S04 (physische Dosis: 1.8Gy, CNL abgeleitet Dosis: 1.7Gy, ADCI: 1.95Gy); dunkelrot, CNL S05 (physische Dosis: 2.8Gy, CNL abgeleitet Dosis: 2.7Gy, ADCI: 3.05Gy); hellgrün, CNL S07 (physische Dosis: 3.4Gy, CNL abgeleitet Dosis: 3.1Gy, ADCI: 3.4Gy); dunkelgrün, CNL S01 (physische Dosis: 3.1Gy, ADCI: 3.75Gy); blau, CNL S08 (physische Dosis: 2.3Gy, ADCI: 2.8Gy). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Proben Physische Dosis CNL abgeleiteten Dosis ADCI geschätzte Dosis Geschätzte Dosis LCL Geschätzte Dosis UCL P-Wert *
CNLS04 1.8 1.7 1.95 1.25 2.45 0.0545
CNLS05 2.8 2.7 3.05 2.75 3.35 0,325
CNLS07 3.4 3.1 3.4 3 3.75 0.473
CNLS01 3.1 NA 3.75 3.35 > 4 7.63E-11
CNLS08 2.3 NA 2.8 2.25 3.3 0.777

Tabelle 3: Dosis Schätzergebnisse des CNL Prüfmuster.
Fußnote: Von Tabelle 3, Rogan Et Al., 20164geändert. ADCI Dosis Schätzungen bereits berichtet beruhten auf ungefilterte (HC) oder manuell (CNL) Bilder ausgewählt und Kurvenanpassung erfolgte mittels der Methode der kleinsten Quadrate. Hier die Eichkurve war fit mit der Maximum-Likelihood-Methode und eine Bild-Auswahl-Modell mit 3 FP-Filter + "Gruppe bin Entfernung, Top 250 Bilder" vor Abschätzung der Dosis angewendet wurde. Geschätzte Dosis UCL und LCL, beziehen sich jeweils auf Dosis geschätzten oberen und unteren 95 % Vertrauensbereich basierend auf die Poisson-Art der DC Ertrag.
* Chi Quadrat Anpassungsgüte zur theoretischen Poisson-Verteilung; NA: Ergebnisse manuell abgeleiteten Dosis waren nicht verfügbar.

Abschätzung der Strahlendosis innerhalb des linearen Bereichs der Kalibrierkurve (< 1 Gy) kann mit der Software durchgeführt werden, jedoch ist eine Sigma-Wert von 1,0 wird empfohlen zur weiteren Verringerung der Häufigkeit falsch klassifizierten DCS (Abbildung 8).


Figure 8
Abbildung 8: Screenshots von zwei Kalibrierkurven von HC Kalibrierung Proben bei verschiedenen Sigma Werten abgeleitet. (A) HC Kalibrierung Proben: 0Gy, 2Gy, 3Gy, 4Gy, und 5Gy bei Sigma = 1,5. (B) HC Kalibrierung Proben: 0Gy, 0.25Gy, 0.5Gy, 0.75Gy, 1Gy, 2Gy, 3Gy, 4Gy, und 5Gy mit Hilfe von SVM Sigma = 1,0. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diese Analysen deuten darauf hin, dass es kleine, aber akzeptable Unterschiede zwischen physikalischen und biologisch abgeleiteten Dosis von Experten und von der Software interpretiert. Der Unterschied zwischen entweder manuell oder Software Schätzung von der physischen Dosis bezeichnet man als "Fehler". Der Fehler in den abgeleiteten Dosen von Proben manuell von HC und CNL erzielte ist ≤0.3 Gy. Automatisierte Verarbeitung von der Software ist weniger genau als Experten, aber in der Regel innerhalb der IAEO angegeben Triage Grenzen von ± 0,5 Gy3. Für den Großteil der Prüflinge in den Tabellen 2 und 3erzeugt die Software korrekte Ergebnisse innerhalb dieser Schwelle. Allerdings zeigen HCS07 und CNLS01 eine schlechte Güte der Anpassung an die Poisson-Verteilung, was darauf hindeutet, dass potenzielle Probleme in Bild und DC Qualität in diesen Proben, die nicht, durch Anwendung des Bildes und FP Auswahl Modelle behoben wurden gab. Der p-Wert-Signifikanzschwelle scheint übermäßig strenge bei HCS05, wo die Software genau die richtige Dosis bestimmt.

Discussion

Möglichkeiten und Grenzen der software

Das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen stellt das typische schrittweise Verfahren in ADCI zum Importieren und verarbeiten zytogenetische Metaphase Bilder erzeugen Strahlung Kalibrierkurven und biologische Dosis bei Einzelpersonen oder Proben ausgesetzt zu unbekannten schätzen Strahlung. Es ist jedoch nicht notwendig, diese Anweisungen nacheinander durchzuführen. Zum Beispiel viele Proben von unbekannten Dosis verarbeitet werden können und mit der gleichen vorausberechnete Eichkurve analysiert. Außerdem, sobald die Bearbeitung abgeschlossen ist, können die Bildauswahl und DC Filterung Modelle vom Benutzer iteriert. Anwendung eine entsprechende Bildmodell Auswahl hängt von den Eigenschaften und Qualität der Metaphase Bilddaten, die wiederum beruht sowohl auf dem Laborprotokoll verwendet, um Zellen zu bereiten und die strenge Kriterien verwendet, um Zellen mit wählen automatisiert Metaphase-Capture-Systeme. Chromosom Morphologien werden unterscheiden zwischen Biodosimetry und zytogenetischen Labors, und somit sollte die Bild-Auswahl-Modelle durch den Benutzer zu bestimmen, ob die vordefinierten Bild-Auswahl-Modelle mit der Software gelieferten angemessen werden ausgewertet werden genaue Dosierung Schätzungen zu produzieren, oder ob Custom mit Benutzer-definierten Modelle Schwellenwerte geschaffen werden müssen. Basierend auf unserer Erfahrung, wird die Wirksamkeit der Bild-Auswahl-Modelle durch die Quelle und die Qualität der Zelle Bilder beeinflusst. Benutzer können ihre eigenen Bild-Auswahlkriterien mit unterschiedlichen Kombinationen von Filtern zur Beseitigung falsch positive DCs und Bild Auswahl Modelle und die entsprechenden Grenzwerte zum Auswählen der gewünschten Bilder entwerfen. Gibt Flexibilität bei Eingabe von Kalibrierkurven und Dosis Schätzung Koeffizienten der linear-quadratische Kurve und DC Frequenzen geändert oder manuell eingegeben werden können.

Obwohl die Software vollständig automatisiert ist, können Bilder manuell überprüft und ausgewählt werden. Diese Funktion ist verfügbar oder individuell bearbeitete Bildern durch das Mikroskop Viewer-Funktion in der Haupt-GUI zu entfernen. Dennoch ist durch Automatisierung, die Software wesentlich effizienter im Vergleich mit dem Handbuch scoring der Metaphase Bilder und DCs zählen. Eine Stichprobe von 1000 Bildern kann in 20 (Tiff), 40 (Jpg) min auf einer multi-Core Performance Workstation verarbeitet werden. Diese Software wird besonders in zeitkritischen oder arbeitsintensiven Situationen, z. B. Ereignisse, in denen mehrere Personen in Berührung gekommen sind oder waren im Verdacht, die Strahlung ausgesetzt worden sind oder wo zeitkritische Diagnosen und Behandlung Entscheidungen sind entscheidend.

Präzise und akkurate Hochdurchsatz-Erkennung von DCs sowie Abschätzung der Dosis sind für unbeaufsichtigte Strahlung Beurteilung erforderlich. Andere Alternativen zur Software erfüllen diese Voraussetzungen nicht. Eine Benutzer-gestützte, Image-basierte zytogenetische Analyse (DCScore, Metasystems17) System erfordert manuelle Prüfung der Kandidaten DCs, aufgrund eines hohen Fehlers Rate auf unkorrigierte Überschneidungen zwischen Chromosomen, und das System nicht ermittelt Strahlendosis. DCScore wäre nicht so effektiv wie ADCI in einer Strahlung-Veranstaltung mit einer großen Zahl von potenziell exponierten Personen. Große Blende Mikroskopsystemen sammeln Bilder von mehreren Metaphase Zellen18, jedoch sie nicht auswerten. "CABAS"19 und20 -Software "Dosis schätzen" Generiere Kalibrierung Kurven und Schätzung Dosis, aber nicht DCs der Gäste. Andere Biodosimetry-Assays, die nicht auf DC-Analyse gehören H2AX Fluoreszenz, Fluoreszenz in Situ Hybridisierung mit DNA-Sonden, gezielt auf bestimmte Chromosomen, Genexpression, Micronucleus-Assay und Urin und Atemwege Biomarker. Diese Methoden sind weniger spezifisch und sensitiv für ionisierende Strahlung, mehr kostspielig, in einigen Fällen sein können, sind mehr Zeit in Anspruch und haben in der Regel nicht über mehrere Referenzlaboratorien standardisiert worden. Die meisten dieser Techniken erkennen keine stabile Strahlung Antworten, sodass sie für die langfristige Bewertung verwendet werden können (> 7 Tage nach Exposition) der Strahlendosis. Im Gegensatz dazu, dies kann Einzelpersonen bis zu 90 Tage nach Exposition ausgewertet und kann Daten aus jeder Zytogenetik-Labor-Mikroskop imaging-System verarbeiten. Jedoch wird eine Probe gezogen > 4 Wochen nach Exposition, Empfindlichkeit wird durch den Zerfall von dizentrische Aberrationen1,2,3 reduziert und die Software derzeit nicht korrekt DC Frequenzen für Verzögerungen bei der Probenahme exponierten Personen.

Diese Software hat einige Einschränkungen. Vorhandene Bild Auswahl Modelle meist akzeptabel Metaphase Bilder auswählen, aber in einigen Fällen fehlschlagen zu unbefriedigenden Bilder zu beseitigen, die die Genauigkeit der Erkennung von DC reduzieren kann. Es ist immer noch eine offene Frage, wie ein zufriedenstellendes Bild-Auswahl-Modell entworfen, das alle ungeeigneten Metaphase Zellen eliminiert. Die Software liefert genaue Schätzungen für Proben höhere Strahlendosen ausgesetzt (≥ 2 Gy). Trotz erheblicher Fortschritte bei der Verringerung der Anzahl der falsch positiven DCs16sind diese Objekte nicht beseitigt worden. Niedrigere Qualität Metaphase Zellen auf niedrige Strahlendosis (vor allem < 1 Gy) sind anfälliger für falsch positive DC-Detektion. Niedrigdosierte Proben wurden deshalb nicht berücksichtigt, Erstellung der Eichkurve für die Abschätzung der Dosis von HC-Proben verwendet. Wenn eine Kurve mit niedrig dosiertem Proben gewünscht wird, ein niedriger Wert der SVM Sigma reduziert falsche positive zählt in niedriger Dosis Proben jedoch unter Umständen niedriger DC-Renditen in hoher Dosis Proben. Abbildung 8 vergleicht die HC-Kurve zur Abschätzung der Dosis (Sigma = 1,5) mit einer Kalibrationskurve fit mit zusätzlichen niedrigdosierte Proben bei niedrigeren SVM Sigma Wert (1.0). In Proben mit unzureichenden Anzahl von Metaphase Zellen und/oder schlechter Qualität Metaphase Bilder kann es nicht genau abzuschätzen biologischen Expositionen bei niedrigen Dosis, was zu Abweichungen vom physischen Dosis von mehr als 0,5 Gy möglich.

Die Software kann nicht genau Strahlungsarten beurteilen, ob ihre Dosis-Wirkungs-Kurven am besten eine lineare oder in der Nähe von linearen Modell passen. Bisher hat es nur mit X- und Gamma-Strahlen ausgesetzt, Proben getestet. Wenn eine andere Strahlungsquelle untersucht wird, müssen Benutzer sicherstellen, dass Kalibrierung und Prüfung Proben die gleiche Art von Strahlung ausgesetzt sind. Die Software nutzt die maximum-Likelihood oder kleinsten Quadrate passend um zu eine Dosis-Wirkungs-Kurve mit einem linear-quadratisch-Modell zu konstruieren. Derzeit gibt es keine Option, um eine streng lineare Kurvenanpassung, verhängen für hochenergetische Teilchen Aufnahmen geeignet, aber solche Funktionalität werden in der Zukunft.

Zukünftige Entwicklung

Unsere Bemühungen konzentrieren sich auf Verbesserung Bild Auswahl Modelle und genaue Dosierung Messung, insbesondere der Proben niedrige Strahlendosen ausgesetzt. Nachfolgende Software-Versionen bieten Standard-Fehler-Messungen auf Dosis Schätzungen und Konfidenzintervalle auf Kalibrierkurven. Darüber hinaus ist eine High-Performance-computing-Version der Software für den Supercomputer Blue Gene (BG/Q, IBM) in der Entwicklung für die zeitnahe Auswertung von Individuen in einem Masse Schaden/Unfall-Strahlung ausgesetzt. Einige Komponenten der Software wurden bereits getestet und auf dieser Plattform bereitgestelltLass = "Xref" > 11.

Disclosures

PKR und JHMK war CytoGnomix, die Kommerzialisierung ist ADCI und damit verbundenen Patente hält. YL und BCS sind Mitarbeiter von CytoGnomix. ADCI ist urheberrechtlich geschützt, und die Zentromer-Lokalisierung-Methode in ADCI ist patentiert (US Pat. Nr. 8.605.981; Deutschen Pat. (Nr. 112011103687).

Acknowledgments

Wir sind dankbar, Dr. Ruth Wilkins, Strahlenbiologie und Schutz-Teilung bei Health Canada und Farrah Flegal, Canadian Nuclear Laboratories und ihre Laborpersonal für den Zugriff auf Metaphase Bilddaten aus ihren zytogenetische Biodosimetry Laboratorien. Dieses Papier wurde unterstützt durch einen Vertrag aus Build in Canada Innovation Program CytoGnomix (Seriennr. EN579-172270/001/SC). Die erste Version von ADCI und Entwicklung von Algorithmen wurden von den westlichen Innovationsfonds unterstützt; die Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (NSERC Discovery Grant 371758-2009); US Public Health Service (DART-Dosis CMCR, 5U01AI091173-0); die kanadische Stiftung für Innovation; Kanada-Forschung-Stühlen und CytoGnomix Inc.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated Dicentric Chromosome Identifier and Dose Estimator (ADCI) CytoGnomix NA ADCI software is released in a binary installation package file for Microsoft Windows 7, 8, 8.1 and 10; 235 Mb of disk storage are required for a typical installation. The software has been tested with Intel or AMD x86-64 processors; at least 1 Gb RAM is recommended. Analyses have been benchmarked on a computer configured with an Intel I7 processor and 16 Gb RAM. Operation of ADCI requires an active license and a USB-based hardware dongle, which must remain plugged in while the software is executing. The dongle encodes the software expiry date. Each time the software is started, this date is read. The software will allow access to the program if the current date and time precedes the expiration time-date stamp. Extending an expired software license can be accomplished by obtaining a new dongle or by renewing the license with an updated key at startup.
Digital images of metaphase cell nuclei Examples: Metasystems, Leica Microsystems M-Search (Metasystems), Cytovision (Leica) software High resolution TIFF format; typically >250 digital images generated with a microscope imaging capture system (minimum 63X magnification objective, 10X magnification ocular).
MSI Leopard Pro (recommended, optional) Micro-Star International MSI GP62 6QF 480CA Leopard Pro Multi-core performance workstation.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Beschleunigten Strahlung Biodosimetry automatisiert durch dizentrische Chromosom Identifikation (ADCI) und Abschätzung der Dosis
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Shirley, B., Li, Y., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation. J. Vis. Exp. (127), e56245, doi:10.3791/56245 (2017).More

Shirley, B., Li, Y., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation. J. Vis. Exp. (127), e56245, doi:10.3791/56245 (2017).

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