Summary
Methylenblåt farvning af injektion i nyrebækkenet letter vurdering af urinvejene junction obstruktion defekter under musen embryonale urinveje udvikling. Her, er en protokol for methylenblåt farvning af injektion i nyrebækkenet beskrevet.
Abstract
Urinveje junction obstruktion defekter er medfødte misdannelser inducerende hydronefrose og hydroureter. Murine urinveje junction obstruktion defekter kan vurderes ved at spore methylenblåt farvning af flow i urinvejene. Methylenblåt farvestof indsprøjtes i nyrebækkenet af perinatal embryonale nyrer og farvestof flow overvåges fra nyrebækken af nyren gennem ureter og blære lumen efter anvende hydrostatiske pres. Dye ophobning vil fremgå i blæren lumen af normale perinatal urinvejene, men vil blive begrænset mellem nyrebækkenet og slutpunktet for en unormal ureter, hvis urinveje hindringer opstår. Denne metode fremmer bekræftelse af urinvejene junction forhindringer og visualisering af hydronefrose og hydroureter. Dette manuskript beskriver en protokol for methylenblåt farvning injektion i nyrebækken at bekræfte urinveje junction forhindringer.
Introduction
Urinvejene består af et par af nyrerne og urinlederne og en fælles blæren og urinrøret. Den vigtigste funktion af urinvejene er at opretholde kroppens homeostase ved at styre vand og elektrolyt balancen i blodet. Nyrerne filtrerer blodet til kontrol elektrolytten koncentrationer og syre-base balance og producere urin for at udskille overskydende vand og affald herunder opløste stoffer og metabolitter. Urin er derefter transporteres gennem ureter fra nyrebækken i nyrerne til at bladderin en ensrettet måde, hvor det er gemt og i sidste ende fjernes via urinrøret1.
Urinlederne er lige rør med oprindelse fra den nephric duct. Efter spirende fra nephric kanalen på embryonale dag 10.5 (E10.5) i musen, ureter stilk elongates og adskiller i et flerlaget struktur kaldet urothelium, som er uigennemtrængeligt mellem mus, E12.5 og E16.5. Mesenchymale celler omkring ureter stilk er også opdeles i tre lag bestående af indre stromale celler, mellemliggende tyk glatte muskelceller og ydre adventitial fibroblaster. Ureter peristaltiske bølger indlede i nyrebækkenet er opformeret gennem glat muskel lag af ureter væggen til blæren til at transportere urin2,3, som er produceret, startende fra E16.5 i musen1.
Medfødte misdannelser af nyre og urinveje (CAKUT) er blandt de hyppigste genetiske sygdomme, til stede i omkring 1% af menneskelige fostre1,4, og består af en række forskellige fænotyper herunder hydronefrose og hydroureter. Unormal ophobning af urin i nyre og ureter resulterer i hydronephrotic nyre og hydroureter dannelse. En årsag til hydronefrose og/eller hydroureter dannelse er en obstruktion af urinvejene. Ureteropelvic junction obstruktion (UPJO) er forårsaget af afvigende urin flow på grund af en blokering mellem de proksimale urinleder og nyrebækken, hvilket resulterer i hydronefrose og proksimale hydroureter indsnævring med vinkling eller vedvarende folde5, 6. Derudover kaldes det ektopiske indsættelse af den distale ureter i enten blærevæggen eller forplantningsorganerne ureterovesical junction obstruktion (UVJO). UVJO kan også medføre hydronefrose og hydromegaureter dannelse7,8. En yderligere ureterovesical krydset (UVJ) defekt er vesicoureteric refluks (VUR). VUR er karakteriseret ved retrograde urin flow fra blæren mod nyre på UVJ. I forhold til UVJO, viser perinatal embryoner med VUR tydeligt ikke en udspilet hydronephrotic nyre eller svær hydroureter fænotype9.
I laboratoriet mus, kan urin flow undersøges ved injektion af et farvestof, såsom methylene blå, i nyrebækkenet9. Injectedmethylene blå løsning vil spore urin bane fra nyrebækken gennem ureter og ind i blæren. Hydronefrose kan genkendes af en udvidelse af farvestof i nyrerne. UPJO kan blive opdaget som en blokering af farvestof flow på den proksimale ureter med udspilede nyrebækken5. Enhver dilatation af ureter angivet med en udvidet diameter viser et eksempel på hydroureter. Endelig, farvestof ophobning på blærevæggen eller på stedet af forplantningsorganerne angiver UVJO med udspilede hydronephrotic nyre og forstørrede hydromegaureter7,10. For at påvise VUR, farvestof løsning er sprøjtet ind i blæren og efterfølgende retrograd flow overvåges i nyre9.
Her, er en protokol for methylenblåt farvning af injektion i nyrebækkenet af en perinatal embryo præsenteret. Denne protokol giver mulighed for sporing af urin flow fra nyrebækken gennem ureter og ind i blæren og kontrollerer potentielle urinveje junction forhindringer som UPJO eller UVJO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
mus (Wnt5a flox / flox mus (Wnt5a tm1.1Tpy) og Dll1Cre linje, UVJO musen model) 7 blev forvaltet ifølge NIH retningslinjer for pleje og brugen af forsøgsdyr og studerede under en protokol, der er godkendt af NCI-Frederick Animal Care og brug udvalget.
1. forberedelse af farvestof methylenblåt
- måle 0,1 g methylenblåt pulver.
- Opløses methylenblåt i 10 mL normale saltvand eller 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) helt ved vortexing.
- Filter 10 mg/mL methylenblåt med en sprøjte filter (membran porestørrelse 0.45µm) at fjerne tilstopning under injektion.
- Samle en steril hovedbund vene sæt (27GX3/4 ″) med en 3 mL engangs sprøjte og fyld sprøjten med 3 mL filtreret methylenblåt.
Bemærk: For at forhindre hydrostatisk tryk og efterfølgende farvestof flow, placere nål aflæsse ovenfor sprøjte fyldt med methylenblåt.
2. Dissektion af prænatal embryoner
- rene dissekere saks og pincet med 70% ethanol.
- Til at indsamle perinatal embryoner på E18.5 eller E19.5, aflive gravide mus først ved hjælp af CO 2 indånding og derefter udføre cervikal dislokation ifølge NIH retningslinjer.
Bemærk: Den gravide kvinde mus føder normalt start på E18.5, men større nyrerne er lettere at manipulere. Nyrerne på E19.5 tættere til fødslen er derfor lettere at udføre denne analyse på. Imidlertid unger med bilaterale urinveje forhindringer dør efter fødslen. Afhængigt af egenskaber af eksperimenterende mus, en passende samling dag/tid bestemmes empirisk. - Spray 70% ethanol på den ventrale abdominal overflade og derefter åbne bughulen ventrally ved hjælp af dissekere saks og pincet.
- Løfte hele livmoderen og adskille det fra kroppen ved at skære med dissekere saks på spidsen af de uterine horn.
- Skylles hele livmoderen med 1 x PBS i en petriskål.
- Skæres i livmoderen segmentally med dissekere saks og fjerne placenta decidua med dissekere pincet til at udsætte embryoner i æggeblomme sække.
- Fjerne blommesækken først og derefter fjerne den fostervand membran med dissekere pincet til at befri de perinatale embryoner.
- Hug hovedet af et foster med dissekere saks. Aftørre overskydende blod med steril gaze puder. PIN embryonet ned med sin ventrale overflade op på et dissekere mikroskop udstyret med et digitalt kamera til billedbehandling. Indsamle halen for genotypebestemmelse eventuelt.
Bemærk: Udføre injektioner ét embryon på et tidspunkt. - Åbne omhyggeligt bughulen af et foster med pincet ved at rive huden. Derefter forsigtigt fjerne overskydende organer og væv såsom lever, maven og tarmen med pincet ved at skære dem eller trække dem for at udsætte nyrerne, urinlederne og blæren, der er placeret dorsalt ( figur 1A). Absorbere overskydende blod fra dissekeret embryonet med steril gaze puder evt.
Bemærk: Overskydende blod interfererer med identifikation af nyrebækken injektionsvæske farvestof.
3. Indsprøjtning af methylenblåt farvning i nyrebækkenet og overvågning farvestof Flow
- Fjern bobler i nål og slanger med en udvisning af methylenblåt fra nål-spids af hydrostatisk tryk. Lift sprøjte indeholdende farvestof løsning over niveauet af needle-tip at starte flow, og derefter sænke sprøjte til at stoppe strømmen.
- Sæt kanylen i nyrebækken nær den proksimale ureter, pas på ikke for at forstyrre det engang placeret. Udføre farvestof injektion i en nyre til at bestemme dens urinveje obstruktion.
Bemærk: Udføre farvning injektion i nogen unormal nyre 7 første ved at følge den samme måde at afgøre sine urinveje obstruktion. - Lift sprøjte op omkring 20 cm giver hydrostatisk tryk og lade 15 µL - 60 µL af farvestof løsning flow. Strømningshastigheden vil være omkring 3 µL/s hvis sprøjten er rejst til denne højde over embryoet.
- Overvåge den blå farve af farvestoffet starter først i nyrebækkenet, derefter i længden af ureter, og endelig i blæren lumen.
Bemærk: Det tager ca 5 s se en svag farvestof farve dukke op i blæren lumen, hvis ureter er korrekt indsat i blæren. Tillad farvestof til at akkumulere på den blokerede websted omkring 15 s hvis ingen farvestof farve vises i blæren lumen. - Placer sprøjte ned til stop farvestof flow og fjerne nålen fra nyren.
- Tage billeder af nyre, ureter og blære spores med farvestof løsning ved hjælp af kameraet og tænkelig plan der er tilsluttet et stereomikroskop.
- Laver et referat af hydronefrose af nyrerne, hydroureter, og den endelige holdning af farvestof løsning i et lab notesbog.
- Udføre injektion af de kontralaterale nyre som beskrevet i sektion 3.1) til 3,5) og tillade farvestof flow omkring 20 s i alt.
Bemærk: Blære lumen vil blive fyldt med farvestof løsning, angivet ved en stærk blå farve, hvis ureter er korrekt indsat i blæren lumen. Efter vurdering af urinvejene junction obstruktion, urinlederne og blæren kan fastsættes for skæring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nyrer og lavere urinvejene er placeret dorsal til de fleste andre indre organer såsom lever og tarm. Efter fjerner disse andre indre organer, et par af nyrerne og urinlederne og en enkelt blære er synlige (figur 1A). Efter vellykket dissektion vil farvestoffet injiceres i nyrebækkenet flyde fra nyren ind i blæren via ureter. Nyrebækkenet er tragt-lignende forstørrede proksimale del af ureter i nyrerne. Dye injektion punkt er derfor nær synlige proksimale ureter forbundet med nyren som angivet med sorte pile (figur 1B-1 C). Efter indsprøjtning med farvestof methylenblåt i en nyre, farvestoffet løber fra nyrebækken gennem ureter og ind i blæren, hvilket resulterer i en synlig blå farve i ureter og blære lumen, hvis urinveje forhindringer ikke eksisterer (figur 1B ). Dye løsning forsvinder normalt i en normal ureter hurtigt selv før billedbehandling, og farvestof farve i ureter er svag, fordi den normale ureter er en tynd slange. Dye flow i ureter kan dog iagttages med et dissekere mikroskop. En stærk blå farve i blæren lumen vises som et resultat af et længere forløb omkring 20 s i alt efter injektion af begge nyrer med farvestof løsning (figur 1 c). Dye ophobning i blæren efter de kontralaterale injektion angiver den anden urinvejene ikke har nogen urinveje junction obstruktion.
Det er rimeligt at injicere en klart unormal nyre først for at bekræfte eventuelle urinveje junction blokeringer. Unormal hydronephrotic nyrerne kan genkendes på deres større størrelse eller tynde transparente overflade med en udvidet nyrebækken. Et eksempel udspilede hydronephrotic nyre og en unormalt udvidede hydroureter er afbildet i figur 2A. En forstørrede hydroureter resulterer normalt i en meget stærkere visualisering, fordi dens udvidede volumen bevarer meget mere farvestof løsning end en normal, tynde ureter. Hvis nyrerne og/eller urinlederne er beskadiget under dissektion, er undersøgelse af urinvejene junction forhindringer umuligt, fordi farvestoffet vil sive ud anderledes på den skadede lokalitet. For eksempel, den unormale hydroureter i figur 2A blev beskadiget i sin midten og, derfor, farvestof løsning endelige holdning er uklar og UVJO kan ikke verificeres trods fraværet af farvestof i blæren lumen (figur 2A). Men denne perinatal urinvejene med forstørrede hydroureter og udspilede hydronephrotic nyre kan have UVJO som ureter er udvidet langs dens længde og nyrerne er udpræget udspilet. De kontralaterale urinvejene vises normalt, da det har en tynd ureter og farvestoffet efterfølgende træder blære lumen (figur 2B).
Figur 1. Eksempler på methylenblåt farvning injektion i en normal urinvejene. (A) en typisk billede af urinvejene fra en perinatal Foster (E19.5) efter at fjerne overskydende væv. To urinledere og to nyrer og en blære er set med reproduktive organer, her testiklerne (B) et eksempel af indsprøjtning af farvestof i en normal nyre. En injektion punkt i nyrebækkenet i nyrerne (sort pil) kan ses. En svag farvestof farve er synlig i ureter og blære lumen efter at lade farvestof til at flyde til 5 s. (C) farvestof ophobning i blæren lumen efter injektion af både normale nyrer. Farven bliver stærk ophobning af farvestof løsning i blæren lumen efter at lade farvestof til at flyde til 20 s. Nyrebækkenet er også synligt med svag farvestof farve i nyrerne. B: blære, K: nyre, T: testis, U: ureter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Eksempler på methylenblåt farvning injektion i en urinvejene med ensidige hydroureter. (A) et eksempel af indsprøjtning af farvestof i en urinvejene med en hydroureter og en hydronephrotic nyre af en neonatal kvindelige hvalp med farvestof flow af 15 s. Hydronephrotic nyre er klart større end de kontralaterale nyre. Tilsvarende ureter er dilaterede og farvestof farve er stærkt genkendelige men hydroureter er tydeligvis beskadiget som observeret af utætte farvestof løsning i kroppen hulrum. (B) indsprøjtning af farvestof i de kontralaterale nyre af en urinvejene med ensidige hydroureter med farvestof flow af 20 s. indsprøjtet farvestof løsning i den normale nyre ophobes i blæren lumen hvilket bekræfter at abnormitet er ensidige. B: blære, HK: hydronephrotic nyre, HU: hydroureter K: nyre, U: ureter, Ut: uterin horn. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Musen nyrer er funktionelle begyndelsen på E16.5 og en farve injektion test er teoretisk muligt fra dette tidspunkt. Men nyren er for små til at blive injiceret med farvestof løsning og fænotyper som hydronefrose og hydroureter overholdes ikke klart da disse fænotyper er en sekundær effekt af urin bygget på grund af unormale urin transport. Disse fænotyper, fra forhindringer som UPJO eller UVJO, er indlysende på E18.5 af udspilet nyrerne og urinlederne. Større nyrerne af embryoner på E19.5 eller neonatal unger er lettere at manipulere end dem af embryoner på E18.5 eller yngre. Imidlertid unger med bilaterale urinveje forhindringer dør efter fødslen. Derfor, udføre eksperimenter for at validere CAKUT fænotyper ved passende valg af perinatal fostre eller unger afhængigt af eksperimentelle mus egenskaber.
Dissekere omhyggeligt for at opretholde en intakt urinvejene inden du udfører farvestof injektion for at undersøge potentielle defekter. Dette er især vigtigt for unormal hydronephrotic nyrerne og urinlederne, som er meget udspilet og let beskadiget under fjernelse af ekstra væv til at afsløre nyrer og urin skrifter. Beskadige disse organer under dissektion vil forhindre en fuld bestemmelse af reelle fejl. F.eks. figur 2 viser forskellige dilatation af en ureter, men farvestof lækage undlader at vise den terminal punkt af den distale hydroureter.
Altid være sikker på at fjerne luftbobler fra slangen og nål før injektionen, som disse bobler vil blokere ordentlig farvestof flow. Efter vellykket dissektion er det afgørende skridt til at behandle urinveje obstruktion indsættelse af needle-tip i nyrebækkenet. Indsættelse af nålen i den øverste halvdel af nyre, nær den proksimale ureter, er nyttige til direkte needle-tip i nyrebækkenet. Nål-spids skal pege mod den proksimale ureter. Da de renale blodkar er placeret i nærheden af den proksimale ureter, kan farvestoffet flyde langs de renale blodkar medmindre nål-spids peger mod den proksimale ureter. I dette tilfælde bør nål tip justeres i nyrebækkenet mod den proksimale ureter. Yderligere, nålen kan passere gennem nyrerne hvis indsat for dybt, forårsager farvestof til at sive ud af nyrerne og i kroppen hulrum. Omhyggelig indsættelse af needle-tip i nyrebækkenet og overvågning nål tip i nyrebækkenet kan bidrage til at undgå denne fiasko. Nogle gange, vil nålen blive blokeret af nyrevæv under injektion, hvis det ikke er sat i nyrebækkenet. I dette tilfælde fjerner væv fra nålen, nulstille farvestof flow ved at genstarte hydrostatisk tryk og omdirigere nål spidsen mod nyrebækkenet. Derudover kan fænotyper forbundet med CAKUT være ensidige eller bilaterale. Derfor, sørge for, at injektionen udføres separat til venstre og højre urin-systemer. Optimalt, udføre injektionen først med en klart unormal nyre til at kontrollere, om UVJO er ensidige.
Billedet umiddelbart efter injektion test da farvestoffet passerer fra nyrebækkenet gennem ureter hurtigt. Det er svært at se farven under imaging af en normal ureter fordi en normal ureter er en tynd slange, selvom farvestof flow kan overvåges under dissekere mikroskop. Som et alternativ til methylenblåt, 1% hurtigt grøn i 1 x PBS kan også bruges og vil fremstå som en mørk grøn farve9. Ud over dye injektion, histologiske sektioner af nyrerne og urinlederne efter H & E farvning vil bekræfte defekter i nyrerne og urinlederne. Billeddannelse af sektioner med en ureter særlige reporter er også en ekstra måde at bekræfte UVJO7. Men disse sektioner skal være intakt og seriel skæring er nødvendig for at undgå falske positiver. Sammenlignet med traditionelle sektion-baserede analyser af urin-systemer, er dette farvestof injektion protokol en øjeblikkelig måde til at observere nyre og patent urinleder integritet og at visualisere forhindringer som UPJO eller UVJO.
Denne protokol giver en enkel og ligetil metode toquickly visualisere urinvejene struktur i sent stadium mus udvikling, som giver mulighed for analyse af urinvejene udvikling. Metoden beskrevet her kan bruges til at vurdere mutationer, der forårsager udviklingsmæssige urinveje defekter, som et middel til at identificere ændringer i urinvejene modning eller ureter udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har intet at videregive.
Acknowledgments
Jeg takker Dr. Alan O. Perantoni (CDBL/NCI/NIH) til støtte for forelæggelsen af dette manuskript. Jeg takker også Dr. Michael Hall (CDBL/NCI/NIH) og Nirmala Sharma (CDBL/NCI/NIH) til at redigere dette håndskrift. Jeg er taknemmelig til Lai Thang (SAIC) for hans fremragende mus dyrehold. Dette arbejde blev støttet af de nationale kontorer i sundhed, National Cancer Institute og Center for kræftforskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML | Fisherscientific | 50-983-204 | |
| 3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip | BD | 309657 | |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall corporation | 4614 | |
| Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12" | EXELINT | 26709 | |
| Delicate Operating Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6702 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5135 | |
| Dumont Tweezers; Pattern #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2" | BD | 305106 |
References
- Rasouly, H. M., Lu, W. Lower urinary tract development and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 307-342 (2013).
- Kispert, A. T-Box Genes in the Kidney and Urinary Tract. Curr Top Dev Biol. 122, 245-278 (2017).
- Bohnenpoll, T., Kispert, A. Ureter growth and differentiation. Semin Cell Dev Biol. 36, 21-30 (2014).
- Nicolaou, N., Renkema, K. Y., Bongers, E. M., Giles, R. H., Knoers, N. V. Genetic, environmental, and epigenetic factors involved in CAKUT. Nat Rev Nephrol. 11, 720-731 (2015).
- Tripathi, P., Wang, Y., Casey, A. M., Chen, F. Absence of canonical Smad signaling in ureteral and bladder mesenchyme causes ureteropelvic junction obstruction. J Am Soc Nephrol. 23, 618-628 (2012).
- Aoki, Y., et al. Id2 haploinsufficiency in mice leads to congenital hydronephrosis resembling that in humans. Genes Cells. 9, 1287-1296 (2004).
- Yun, K., Perantoni, A. O. Hydronephrosis in the Wnt5a-ablated kidney is caused by an abnormal ureter-bladder connection. Differentiation. 94, 1-7 (2017).
- Uetani, N., Bouchard, M. Plumbing in the embryo: developmental defects of the urinary tracts. Clin Genet. 75, 307-317 (2009).
- Murawski, I. J., Watt, C. L., Gupta, I. R. Assessing urinary tract defects in mice: methods to detect the presence of vesicoureteric reflux and urinary tract obstruction. Methods Mol Biol. 886, 351-362 (2012).
- Weiss, A. C., et al. Nephric duct insertion requires EphA4/EphA7 signaling from the pericloacal mesenchyme. Development. 141, 3420-3430 (2014).
