Summary
Methylene 청색 염료 주입 신장 골반으로 마우스 배아 요로 개발 하는 동안 요로 분기점 방해 결함의 평가 촉진 한다. 여기, 신장 골반에 methylene 청색 염료 주입에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
요로 분기점 방해 결함은 선천적인 변형을 유도 hydronephrosis 및 hydroureter. Murine 요로 분기점 방해 결함 비뇨 기 시스템 내에서 메 틸 렌 블루 염색 흐름을 추적 하 여 평가 될 수 있다. Methylene 청색 염료 perinatal 배아 신장의 신장 골반에 주입 하 고 염료 흐름은 액체 정역학 압력을 적용 한 후 신장 ureter 통해 및 방광 루멘에의 신장 골반에서 모니터링 합니다. 염료 축적 정상적인 perinatal 요로, 방광 루멘에 분명 있을 것입니다 하지만 요로 문제 발생 하는 경우 신장 골반 사이 비정상적인 ureter의 강요 될 것 이다. 이 방법은 요로 분기점 장애물 확인 및 hydronephrosis 및 hydroureter의 시각화를 촉진 한다. 이 원고는 요로 분기점 장애물을 확인 하 신 골반에 methylene 청색 염료 주입에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.
Introduction
비뇨 기 시스템은 신장, ureters 및 일반적인 방광과 요도의 한 쌍의 구성 됩니다. 비뇨 기 시스템의 주요 기능은 혈액의 물과 전해질 균형을 관리 하 여 신체의 항상성 유지 하는 것입니다. 신장 혈액 제어 전해질 농도 산 성-기본 균형을 필터링 하 고 초과 물과 용액 및 대사 산물 등 폐기물을 배설 하는 소변 생산. 소변은 신장 신장 골반에서 ureter 그것 저장 되 고 궁극적으로 요도1통해 제거 단방향 방식으로 bladderin 통해 다음 수송 된다.
ureters는 직선 튜브 nephric 덕트에서 발생. 마우스에서 배아 일 10.5 (E10.5)에서 nephric 덕트에서 신진, 후 ureter 스토킹 elongates 및 E12.5 및 E16.5 라는 마우스 사이 침투성은 urothelium 다층 구조로 차별화. Ureter 줄기 주변 중간 엽 세포 또한 내부 stromal 세포, 중간 두께 평활 근 세포, 그리고 외부 adventitial 섬유 아 세포로 구성 된 3 개의 층으로 구분 됩니다. 신장 골반에서 시작 ureteral 연동 파도 ureter 소변2,3, E16.5 마우스1부터 생산 되는 수송 방광 벽의 평활 근 층을 통해 전파 됩니다.
신장 및 요로 (CAKUT)의 선천적인 이상이 가장 빈번한 유전 질병, 인간 태아1,4의 약 1%에 중 고 고기 hydronephrosis 및 hydroureter 등의 다양 한 구성. 고 신장 ureter 소변의 비정상적인 축적 hydronephrotic 신장 및 hydroureter 형성에 결과. Hydronephrosis 또는 hydroureter 형성의 한 원인은 요로 방해 이다. Ureteropelvic 접속점 방해 (UPJO) 인접 ureter hydronephrosis 및 인접 hydroureter angulation 또는 영구 접는5, 축소의 결과로 신장 골반 사이 방해 때문에 탈 선 소변 흐름에 의해 발생 6. 또한, 방광 벽 또는 생식 관의 원심 ureter 소성 삽입 ureterovesical 접속점 방해 (UVJO) 이라고 합니다. UVJO 또한 hydronephrosis와 hydromegaureter 형성7,8을 유도할 수 있다. 추가 ureterovesical 접합 (UVJ) 결함은 vesicoureteric 환류 (VUR). VUR는 UVJ에서 신장으로 방광에서 역행 소변 흐름에 의해 특징입니다. UVJO에 비해 perinatal 배아 VUR로 표시 되지 않습니다 분명히 팽창된 hydronephrotic 신장 이나 심한 hydroureter 표현 형9.
실험실 마우스에서 소변 신장 골반9에 메 틸 렌 블루 등 염료의 주입에 의해 시험 될 수 있다. Injectedmethylene 블루 솔루션 통해 ureter, 방광으로 신장 골반에서 소변 궤적을 추적 한다. Hydronephrosis 염료는 신장에서의 확장에 의해 인식 될 수 있다. UPJO 발포 신장 골반5근 위 ureter에서 염료 흐름의 막힘으로 감지할 수 있습니다. 어떤 팽창 확대 직경으로 표시 ureter의 hydroureter의 예를 보여 줍니다. 마지막으로, 염료 축적 방광 벽에 또는 생식 관의 사이트에서 UVJO 발포 hydronephrotic 신장으로 나타내고 크기 hydromegaureter7,10. VUR를 검출 하기 위하여 염료 솔루션은 방광에 주입 하 고 후속 역행 흐름 신장9에서 모니터링 됩니다.
여기, 주 태아의 신장 골반에 methylene 청색 염료 주입에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 이 프로토콜 통해 ureter, 방광으로 신장 골반에서 소변 흐름의 추적을 허용 하 고 UPJO 또는 UVJO와 같은 잠재적인 요로 분기점 장애물을 확인 합니다.
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Protocol
쥐 (Wnt5a flox / flox 마우스 (Wnt5a tm1.1Tpy) 및 Dll1Cre 선, UVJO 마우스 모델) 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 NIH 지침에 따라 관리 7 NCI 프레드릭 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 프로토콜 아래에서 공부 하는 고.
1. 메 틸 렌 블루 염색 솔루션의 준비
- 측정 0.1 g 메 틸 렌 블루 가루.
- 10 mL 정상적인 염 분 또는 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1에서 메 틸 렌 블루를 vortexing에 의해 완전히 분해.
- 주입 동안 막힘 제거 주사기 필터 (막 기 공 크기 0.45µm) 10 mg/mL 메 틸 렌 블루 솔루션 필터.
- 어셈블 메 마른 두 피 정 맥 세트 (27GX3/4 ″) 3 mL 일회용 주사기와 채우기 3 mL을 주사기 메 틸 렌 블루 솔루션 필터링.
참고: 수압 및 후속 염료 흐름을 방지 하려면 배치 메 틸 렌 블루 솔루션으로 채워진 주사기 위에 바늘 팁.
2. 출생 전 태아의 해 부
- 깨끗 한가 위와 집게를 70% 에탄올과 해 부. E18.5 또는 E19.5, perinatal 배아를 수집
- 임신 마우스를 안락사 먼저 CO 2 흡입을 사용 하 고 다음 수행 NIH 지침에 따라 자 궁 경부 전위.
그러나 참고: 임신 여성 마우스 일반적으로 출산 E18.5에서 시작,, 더 큰 신장은 조작 하기 쉽습니다. 따라서, 신장 E19.5 가까이에 출생에는에이 분석을 수행 하기 쉽습니다. 그러나, 양측 요로 방해 된 출산 후 새끼. 실험 쥐의 특성에 따라 적절 한 컬렉션 요일/시간 수 경험적으로 결정 합니다. - 복 부 복 부 표면에 70% 에탄올을 스프레이 하 고 해가 위와 집게를 사용 하 여 ventrally 복 부 구멍.
- 전체 자 궁 고 해 부가 위 자 궁 뿔의 끝을 절단 하 여 몸에서 분리.
- 1 x PBS 가진 전체 자 궁 페 트리 접시에 린스.
- Segmentally가 위 해 부와 자 궁을 잘라내어 집게 노른자위 낭에서 태아를 폭로 해 부와 placental decidua 제거.
- 노른자위 sac를 먼저 제거 하 고 해방 perinatal 배아를 집게 해 부와 양수 막 제거.
- 배아가 위 해 부와 목을 벨. 멸 균 거 즈 패드와 함께 과잉 혈액을 닦아. 태아 그것의 복 부 표면 위로 핀 해 현미경 이미징에 대 한 디지털 카메라를 갖춘. 필요한 경우 유전형 꼬리를 수집.
참고: 한 번에 주사 한 배아를 수행. - 신중 하 게 피부를 찢 어 여 집게로 태아의 복 부 구멍을 엽니다. 다음, 조심 스럽게 제거 초과 장기와 조직 간, 위, 소장 등 집게와 그들을 절단 또는 신장, ureters, 방광 dorsally는 노출에 그들을 밖으로 당기 ( 그림 1A). 필요한 경우 멸 균 거 즈 패드와 함께 해 부 배아에서 과잉 혈액을 흡수.
참고: 초과 혈액 신장 골반 염료 주입에 대 한 식별과 방해.
3. 신장 골반 및 염료 흐름 모니터링 Methylene 청색 염료의 주입
- 바늘에 액체 정역학 압력에 의해 바늘 팁에서 메 틸 렌 블루 솔루션을 추방 하 여 튜브 제거 거품. 시작 흐름, 바늘 팁의 수준 이상의 염료 솔루션이 포함 된 주사기를 들어올린 다음 낮은 흐름을 막으려고 주사기.
- 신장 골반 근 ureter, 한 번 배치 그것을 방해 하지 않도록 주의 복용 근처에 바늘을 삽입 합니다. 수행의 요로 방해를 결정 하기 위해 신장에 염료 주입.
참고: 수행의 요로 장애를 결정 하는 같은 방법에 따라 어떤 비정상적인 신장 7에 주입을 첫 번째 염색. - 15 µ L-60 µ L 염료 솔루션 흐름의 액체 정역학 압력을 제공 하는 약 20 cm를 주사기를 들어올립니다. 유량 주사기 태아 위에이 높이 발생 약 3 µ L/s 됩니다.
- 모니터링 신장 골반에서 다음 ureter의 길이에 처음 시작 하는 염료의 파란색 그리고 마지막으로 방광 루멘에서.
참고: 그것은 걸립니다 약 5 s ureter을 방광에 올바르게 삽입 하는 경우 방광 루멘 내에서 등장 하는 약한 염료 색깔을 보고. 차단 된 사이트에 대해 15에서 축적 하는 염료를 허용 염료 색깔 방광 루멘에 표시 하는 경우 s. - 중지 염료 흐름으로 주사기를 놓고 바늘을 제거 하는 신장에서.
- 신장, ureter, 방광 염료 솔루션 추적의 걸릴 이미지는 stereomicroscope에 연결 하는 카메라를 사용 하 여 및 프로그램 이미징.
- 실험실 노트북에는 신장, hydroureter, 및 염료 솔루션의 최종 위치 hydronephrosis의 기록을 만들기.
- 수행 주입 contralateral 신장에 설명 된 대로 섹션 3.1) 3.5) 염료 흐름 약 20 수 총에서 s.
참고: 방광 루멘 ureter을 방광 루멘에 올바르게 삽입 하는 경우 강한 파란 색깔에 의해 표시 된 염료 해결책으로 가득 합니다. 요로 분기점 방해의 평가, 후에 ureters, 방광 고쳐질 수 있다 단면에 대 한.
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Representative Results
신장과 더 낮은 오 줌 시스템 등 간, 대 장 등 대부분의 다른 내부 장기에 있습니다. 제거한 후에 이러한 다른 내부 장기, 신장, ureters과 단일 방광의 쌍 표시 (그림 1A)는. 성공 해 부에 신장 골반에 주입 하는 염료 ureter 통해 방광으로 신장에서 흐름 것입니다. 신장 골반 ureter는 신장에서의 깔때기 모양의 동 공이 확장 되어 근 위 부분 이다. 따라서, 염료 주입 포인트 검은 화살표 (그림 1B-1 C) 표시는 신장과 연결 표시 인접 ureter 근처입니다. 후 한 신장에 메 틸 렌 블루 염색 솔루션 주입, 염료 ureter 통해 및 방광 요로 장애물이 존재 하지 않는 경우 ureter, 방광 루멘에서 보이는 블루 색상의 결과로 (그림 1B에 신장 골반에서 흐르는 ). 염료 해결책 보통 정상적인 ureter에 빨리 사라진다 이미징, 전에 그리고 ureter에서 염료 색깔은 정상적인 ureter 얇은 튜브 때문에 약한. 그러나, 염료 흐름 ureter 해 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 약 20의 긴 흐름의 결과로 나타납니다 방광 루멘에 강한 파란 색깔 염료 솔루션 (그림 1C) 두 신장의 주입 후 총에서 s. Contralateral 주입 후 방광에 염료 축적 두 번째 비뇨 기 시스템 어떤 요로 분기점 방해 하지 않습니다 나타냅니다.
먼저 요로 분기점 이물질을 확인 하는 분명히 비정상적인 신장 주사 적당 하다. 비정상적인 hydronephrotic 신장은 그들의 더 큰 크기 또는 확대 신장 골반으로 얇은 투명 한 표면에 의해 인식할 수 있습니다. 예제 팽창된 hydronephrotic 신장과 비정상적으로 확대 hydroureter 그림 2A에서 묘사 된다. 동 공이 확장 되어 hydroureter 일반적으로 확장 된 볼륨 유지 일반, 얇은 ureter 보다 훨씬 더 많은 염료 솔루션 때문에 훨씬 강력한 시각화에서 결과. 신장 및는 ureters는 절 개 하는 동안 손상 된 경우 요로 분기점 장애물의 시험 불가능 때문에 염색은 손상 된 사이트에 aberrantly 밖으로 누출 됩니다. 예를 들어 그림 2A 에서 비정상적인 hydroureter의 중간에 손상 되었습니다, 따라서, 염료 솔루션의 최종 입장은 분명 하다 고 방광 루멘 (그림 2A)에 염료의 부재에도 불구 하 고 UVJO를 확인할 수 없습니다. 그러나, 동 공이 확장 되어 hydroureter와 팽창된 hydronephrotic 신장이 perinatal 비뇨 기 시스템 ureter 길이 따라 확대와 신장 분명히 불어 UVJO를 할 수 있습니다. Contralateral 비뇨 기 시스템은 정상적으로 얇은 ureter 및 염료 이후에 (그림 2B) 방광 루멘을 입력 나타납니다.
그림 1입니다. Methylene 청색 염료 주입 정상적인 비뇨 기 시스템의 예. (A) 초과 조직을 제거 후 주 배아 (E19.5)에서 비뇨 기 시스템의 전형적인 이미지. 2 신장, 두 ureters, 방광 생식 기관, 여기 testes (B) 정상적인 신장에 염료 주입의 예 를 볼 수 있습니다. 신장 (검은색 화살표)의 신장 골반에 주입 포인트를 볼 수 있습니다. 약한 염료 색깔 염료 축적을 위한 5 미 (C) 염료 방광 루멘에서 두 정상 신장의 주입 후 흐름 수 있도록 후 ureter, 방광 루멘에 표시 됩니다. 색은 염료 20 흐름 수 있도록 후 방광 루멘에서 염료 솔루션의 축적에서 강한 s. 신장 골반도 신장에서 약한 염료 색상으로 표시 됩니다. B: 방광, k: 신장, t: 고환, 된 ureter. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 예 메 틸 렌 블루 염색 일방적인 hydroureter와 비뇨 기 시스템에 주입. (A)는 hydroureter와 15의 염료 흐름 신생아 여성 강아지의 hydronephrotic 신장 비뇨 기 시스템으로 염료 주입의 예 s. Hydronephrotic 신장 contralateral 신장 보다 명확 하 게 큽니다. 해당 ureter 열려진 염료 색상은 강력 하지만 바디 구멍에 염료 해결책 유출에 의해 관찰로 hydroureter 명확 하 게 손상 된. (B) 정상적인 신장으로 20 s. Injected 염료 솔루션의 염료 흐름 일방적인 hydroureter와 비뇨 기 시스템의 contralateral 신장에 염료 주입은 비정상은 일방적인 확인 방광 루멘에 축적. B: 방광, 홍콩: hydronephrotic 신장, HU: hydroureter k: 신장 된 ureter, Ut: 자 궁 경적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
마우스 신장 E16.5 기능 시작 되며 염료 주입 테스트가 시간 포인트에서 이론적으로 가능 하다. 그러나, 신장이 너무 작아 염료 솔루션 주입 및 이후이 고기 때문에 비정상적인 소변 전송 쌓아 소변의 보조 효과 hydronephrosis 및 hydroureter 같은 고기 명확 하 게 관찰 하지는. UPJO 또는 UVJO, 같은 장애물에서이 고기 발포 신장, ureters, E18.5에서 분명 하다. E19.5 또는 신생아 강아지에 태아의 큰 신장은 E18.5에서 배아의 보다 조작 하기가 또는 더 젊은. 그러나, 양측 요로 방해 된 출산 후 새끼. 따라서, CAKUT 고기 perinatal 배아 또는 새끼 실험 마우스 특성에 따라 적절 하 게 선택 하 여 유효성을 검사 하는 실험을 수행 합니다.
염료 주입을 잠재적인 결함을 검사를 수행 하기 전에 그대로 비뇨 기 시스템을 유지 하기 위해 신중 하 게 해 부. 이것은 본질적으로 비정상적인 hydronephrotic 신장, ureters, 신장과 요도 책자 노출 여분의 조직 제거 하는 동안 매우 팽창 되며 쉽게 손상에 대 한 중요. 이러한 장기 해 부 동안에 손상 실제 결함의 전체 결정이 되지 것입니다. 예를 들어 그림 2 는 ureter, 독특한 팽창 하지만 염료 누설 원심 hydroureter의 터미널 지점 표시 하려면 실패 합니다.
항상 반드시 튜브와 이전에 주입, 바늘에서 기포를 제거이 거품 적절 한 염료 흐름을 차단 합니다. 성공 해 부, 후 요로 방해를 검토 하는 중요 한 단계 신장 골반에 바늘 팁의 삽입 이다. 신장 근 위 ureter 근처의 위쪽 절반에는 바늘의 삽입 바늘 팁 신장 골반에 직접적인 도움이 됩니다. 바늘 팁 인접 ureter 방향으로 가리켜야 합니다. 때문에 신장 혈관 근 ureter 부근으로, 바늘 팁 인접 ureter 향해 포인트 하지 않으면 신장 혈관을 따라 염료 흐름 수 있습니다. 이 경우에, 바늘 팁 인접 ureter로 신장 골반에 조정 되어야 한다. 또한, 바늘 염료 신장 그리고 신체 구멍으로 누설을 일으키는 너무 깊이 삽입 하는 경우 신장 통과 수 있습니다. 신장 골반 및 모니터링 신장 골반 내 바늘 끝에 바늘 팁의 주의 깊은 삽입이이 실패를 방지할 수 있습니다. 때때로, 바늘 차단 것입니다 될 신장 조직에 의해 주입 시 신장 골반에 끼워져 있지 않으면. 이 경우에, 바늘에서 조직 제거, 액체 정역학 압력을 다시 시작 하 여 염료 흐름을 재설정을 신장 골반 쪽으로 바늘 팁. 또한, 일방 또는 양자 고기 CAKUT와 관련 된 수 있습니다. 따라서 주사 왼쪽과 오른쪽 비뇨 기 시스템에 대 한 별도로 수행 됩니다 확인 합니다. 최적으로, 먼저 UVJO 일방적인 인지 확인 하는 분명히 비정상적인 신장으로 주사를 수행 합니다.
이후 염료 통과 신장 골반에서 ureter 신속 하 게 주입 테스트 후 즉시 이미지. 비록 해 현미경 염료 흐름을 모니터링할 수 있습니다 정상적인 ureter 얇은 튜브 때문에 정상적인 ureter의 이미징 동안 색상을 볼 수 어렵다. 메 틸 렌 블루로 대체로 1 %1 x PBS에 빨리 녹색 또한 사용 될 수 있다 하 고 어두운 녹색 색상9표시 됩니다. 염료 주입, 신장, ureters H 다음의 조직학 단면도 뿐만 아니라 & 전자 얼룩 신장, ureters 내 결함을 확인 합니다. 또한, ureter 특정 기자와 섹션의 이미징 UVJO7을 확인 하는 추가 방법입니다. 그러나,이 단면도 그대로 고 틀린 확실성을 피하기 위해 해야 하는 직렬 단면. 비뇨 기 시스템의 전통적인 섹션 기반 분석에 비해,이 염료 주입 프로토콜은 신장 및 특허 ureter의 무결성을 관찰 하 고 UPJO 또는 UVJO와 같은 장애물을 시각화 하는 즉시 방법입니다.
이 프로토콜 제공 간단 하 고 늦은 단계 마우스 개발, 요로 개발의 분석을 수 있는 요로 구조를 시각화 하는 간단 방법 toquickly. 요로 성숙 또는 ureter 개발에서 변화를 식별 하는 수단으로 개발 요로 결함을 일으키는 원인이 되는 돌연변이 평가 하기 위해 여기에 설명 된 메서드를 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 상관이 있다.
Acknowledgments
나는이 원고를 제출 하 여 지원 박사 앨런 O. Perantoni (CDBL/NCI/NIH) 감사 합니다. 나 또한이 원고 편집에 대 한 박사 마이클 홀 (CDBL/NCI/NIH) 및 Nirmala Sharma (CDBL/NCI/NIH)을 감사 합니다. 감사 해요 라 Thang (SAIC)에 그의 뛰어난 마우스 축산에 대 한. 이 작품은 암 연구에 대 한 건강, 국립 암 연구소 및 센터의 국가 학회에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML | Fisherscientific | 50-983-204 | |
| 3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip | BD | 309657 | |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall corporation | 4614 | |
| Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12" | EXELINT | 26709 | |
| Delicate Operating Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6702 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5135 | |
| Dumont Tweezers; Pattern #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2" | BD | 305106 |
References
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