Summary
Метиленовый синий краситель инъекции в почечной лоханки облегчает оценку дефекты обструкции мочевыводящих путей соединения во время мыши эмбриональные мочевыводящих путей развития. Здесь описывается протокол для инъекций красителя метиленового синего в почечной лоханки.
Abstract
Дефекты обструкции мочевыводящих путей соединения являются врожденные аномалии, вызывая гидронефроз и hydroureter. Дефекты обструкции мышиных мочевыводящих путей перехода можно оценить по отслеживание потока красителя метиленового синего в мочевыделительной системы. Метиленового синего красителя инъецируется в почечной лоханки перинатальной эмбриональных почек и краска поток контролируется от почечной лоханки почки через Мочеточник и в просвете мочевого пузыря после применения гидростатического давления. Накопление краски будет видно в просвете мочевого пузыря нормальное перинатальной мочевыводящих путей, но будет ограничен между почечной лоханки и конечной точкой аномальные мочеточника, если встречаются препятствия мочевыводящих путей. Этот метод способствует подтверждение мочевыводящих путей перехода препятствий и визуализация гидронефроз и hydroureter. Эта рукопись описывает протокол для инъекций красителя метиленового синего в почечной лоханки для подтверждения мочевыводящих путей перехода препятствий.
Introduction
Мочевая система состоит из пары почек и мочеточников и общей мочевого пузыря и мочеиспускательного канала. Основная функция мочевой системы является поддержание гомеостаза организма путем управления водно-электролитного баланса крови. Почки фильтрации крови для контроля концентрации электролитного и кислотно щелочной баланс и производят моча выводят лишнюю воду и отходы, включая растворенных веществ и метаболитов. Затем моча транспортируется через Мочеточник от почечной лоханки почки к bladderin однонаправленный манере, где она хранится и в конечном счете ликвидирована через мочеиспускательный канал1.
Прямые трубы, происходящих из нефрической протока мочеточников. После бутонизации из нефрической протока на эмбриональных день 10.5 (E10.5) в мышь, стебель мочеточника удлиняется и отличает в многослойной структуре, называемой Уротелий, который является непроницаемой между мыши, E12.5 и E16.5. Мезенхимальные клетки, окружающие стебель мочеточника также дифференцированы на три слоя, состоящий из внутреннего стромальных клеток, промежуточные толстые гладких мышечных клеток и наружной adventitial фибробластов. Уретеральные перистальтические волны в почечной лоханки, распространяются через слой гладких мышц стенки мочеточника в мочевой пузырь для транспортировки мочи2,3, которая производится начиная E16.5 в мышь1.
Врожденные аномалии почек и мочевыводящих путей (CAKUT) относятся к числу наиболее частых генетических заболеваний, в около 1% человеческого плода1,4и состоит из целого ряда фенотипов, включая гидронефроз и hydroureter. Ненормальное накопление мочи в результатах почки и мочеточника в формирование почек и hydroureter hydronephrotic. Одной из причин формирования гидронефроз или hydroureter является обструкции мочевыводящих путей. Ureteropelvic перекрестка обструкции (UPJO) вызвано аномальным мочи потока из-за закупорки между проксимального отдела мочеточника и почечной лоханки, что привело к гидронефроз и проксимальный hydroureter сужение с углы или стойких складной5, 6. Кроме того внематочная вставки дистальной части мочеточника в стенке мочевого пузыря или репродуктивного тракта называется ureterovesical перекрестка обструкции (UVJO). UVJO можно также вызвать гидронефроз и hydromegaureter формирования7,,8. Дефект Джанкшен (UVJ) дополнительные ureterovesical-vesicoureteric рефлюкс (VUR). VUR характеризуется поток Ретроградная мочи из мочевого пузыря к почек на UVJ. По сравнению с UVJO, перинатальной эмбрионов с VUR не показывают отчетливо растянутый hydronephrotic почек или тяжелой hydroureter фенотип9.
Лабораторные мыши струя мочи может быть проверен инъекции красителя, например, метиленовый синий, в почечной лоханки9. Injectedmethylene синий решение будет проследить траекторию мочи от почечной лоханки через Мочеточник и в мочевой пузырь. Гидронефроз могут быть признаны расширение красителя в почках. UPJO могут быть обнаружены как блокирование потока красителя на проксимальной мочеточник с растянутый почечной лоханки5. Любое дилатация мочеточника, обозначается расширены диаметр демонстрирует пример hydroureter. Наконец накопление краски на стенку мочевого пузыря или на сайте репродуктивного тракта указывает UVJO с растянутый hydronephrotic почек и расширены hydromegaureter7,10. Чтобы обнаружить VUR, раствор красителя инъецируется в мочевого пузыря и последующих Ретроградная поток контролируется в почках9.
Здесь представлен протокол для инъекций красителя метиленового синего в почечной лоханки перинатальной эмбриона. Этот протокол позволяет трассировки потока мочи от почечной лоханки через Мочеточник и в мочевом пузыре и проверяет потенциальные мочевыводящих путей перехода препятствий, таких как UPJO или UVJO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
мышей (Wnt5a flox / flox мышей (Wnt5a tm1.1Tpy) и Dll1Cre линии, UVJO модель мыши) 7 осуществлялось согласно NIH руководящие принципы для ухода и использования лабораторных животных и учился под протоколом, утвержденным NCI-Фредерик животное уход и использование Комитетом.
1. Подготовка раствор метиленового синего красителя
- измерения 0,1 г, метиленовый синий порошок.
- Растворения метиленового синего в 10 мл физиологическим или 1 x-фосфатный буфер (PBS), vortexing.
- Фильтр 10 мг/мл раствора метиленового синего с шприц фильтр (Размер поры мембраны 0.45µm), чтобы устранить засорение во время инъекции.
- Сборка стерильные головы вены набор (27GX3/4 ″) с одноразовой шприц 3 мл и заполните шприц 3 мл фильтруют раствора метиленового синего.
Примечание: Чтобы предотвратить гидростатического давления и потока последующего окрашивания, поместите кончик иглы выше шприц, заполненные раствором метиленового синего.
2. Рассечение дородовой эмбрионов
- чистый рассекает ножницы и щипцы с 70% этанол.
- Для сбора перинатальной эмбрионов в E18.5 или E19.5, усыпить беременных мышей использованием CO 2 ингаляции сначала и затем выполнить шейки матки дислокации согласно рекомендациям NIH.
Примечание: Беременных женщин мыши обычно рожает начиная с E18.5, однако, больше почек, легче манипулировать. Таким образом почками в E19.5 ближе к рождению проще выполнять этот анализ. Однако щенков с двусторонними мочевыводящих путей препятствия умирают после рождения. В зависимости от характеристики экспериментальной мышей, соответствующую коллекцию день/время должна определяться эпирически. - Спрей 70% этанол на вентральной поверхности живота, а затем открыть брюшной полости вентрально использованием рассечения ножницы и щипцами.
- Поднять всю матку и отделить его от тела путем резки с рассечения ножницы на кончики рогов матки.
- Смыть всю матку с ПБС в чашке Петри.
- Матки сегментарно с рассечения ножницами вырезать и удалить плацентарной decidua с рассечения щипцы подвергать эмбрионов в желтке sacs.
- Сначала удалить желточного мешка и затем удалите амниотической мембраны с рассечения щипцы освободить перинатальной эмбрионов.
- Обезглавить эмбриона с рассечения ножницы. Вытрите избыток крови с стерильные марлевые подушечки. Придавить эмбриона с его вентральной поверхности вверх на рассечения микроскоп оснащен цифровой камерой для воображения. Собирать его хвост для генотипирования, в случае необходимости.
Примечание: Выполнение инъекции одного эмбриона в то время,. - Тщательно открыть брюшной полости эмбриона с щипцами, разрывая на кожу. Затем, тщательно удалить избыток органов и тканей, таких как печень, желудок и кишечник с щипцами, вырезая их или потянув их подвергать почек, мочеточников и мочевого пузыря, которые расположены дорзально ( рис. 1A). Поглощают избыток крови из расчлененных эмбриона с стерильные марлевые подушечки, в случае необходимости.
Примечание: Избыток крови мешает идентификации почечной лоханки для инъекций краситель.
3. Инъекции красителя метиленового синего в почечной лоханки и мониторинг потока краска
- удалить пузыри на иглы и трубки, изгоняя раствор метиленового синего из кончик иглы на гидростатическое давление. Поднимите шприц, содержащие раствор красителя над уровнем кончик иглы для начала потока, а затем опустите шприца, чтобы остановить поток.
- Вставить иглу в почечной лоханки вблизи проксимального отдела мочеточника, стараясь не нарушить его однажды помещены. Выполнять инъекции красителя в почку для определения ее непроходимость мочевыводящих путей.
: Примечание краска инъекции в любой ненормальной почек 7 первый, следуя так же определить его обструкции мочевыводящих путей. - Поднимите шприц до около 20 см для обеспечения гидростатического давления и пусть 15 мкл - 60 мкл потока раствора красителя. Скорость потока будет около 3 мкл/s если шприц возникает на этой высоте над эмбриона.
- Мониторинг синий цвет красителя, начиная в почечной лоханки, затем в длину мочеточника и наконец в просвет пузыря.
Примечание: Занимает около 5 s чтобы увидеть слабая краска цвета появляются в просвет пузыря, если мочеточника в мочевой пузырь правильно вставлен. Разрешить краситель накопить на заблокированный сайт около 15 s если не краска цвет появляется в просвет пузыря. - Место шприца до остановки потока краски и удалите иглу из почки.
- Принимать изображения и почек, мочеточника, мочевого пузыря с раствор красителя с помощью камеры и изображений программы подключены к стереомикроскопом.
- Сделать запись гидронефроз почки, hydroureter и окончательной позиции раствор красителя в лаборатории ноутбука.
- Выполнения инъекций контралатеральной почки как описано в разделах 3.1) до 3.5) и позволяют краска поток около 20 s в целом.
Примечание: В просвет пузыря будет наполнен раствор красителя, обозначается сильным синим цветом, если мочеточника правильно вставлена в просвет пузыря. После оценки Джанкшен обструкции мочевыводящих путей, мочевого пузыря и мочеточников может устанавливаться для разрезания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Почек и нижних мочевых расположены спинной большинства других внутренних органов, как печень и кишечника. После удаления этих других внутренних органов, пару почек и мочеточников и один мочевого пузыря являются видимыми (рис. 1A). После успешного рассечение краситель вводят в почечной лоханки будет вытекать из почек в мочевой пузырь через Мочеточник. Почечной лоханки это воронка как расширенные проксимального отдела мочеточника в почках. Таким образом краска инъекции суть вблизи видны проксимального отдела мочеточника, связанных с почками как указано с черными стрелками (рис. 1B-1 C). После инъекции с раствор метиленового синего красителя в одну почку краситель вытекает из почечной лоханки Мочеточник и в результате отображается синим цветом в просвете мочевого пузыря и мочеточника, если не существует преград мочевыводящих путей мочевого пузыря (Рисунок 1B ). Раствор красителя обычно исчезает в нормальной мочеточника быстро даже до изображений, и краска цвета в Мочеточник является слабым, потому что нормальный мочеточника является тонкая трубка. Однако краситель потока в Мочеточник может наблюдаться с микроскопом рассечения. Сильный синий цвет в просвет пузыря появляется в результате длительного течения около 20 s в общей сложности после инъекции обеих почек с раствор красителя (рис. 1 c). Краситель накопление в мочевом пузыре после контралатеральной инъекции указывает, что второй мочевыделительной системы не имеют каких-либо Джанкшен обструкции мочевыводящих путей.
Это разумно придать явно ненормальной почек сначала для подтверждения любых препятствий Джанкшен мочевыводящих путей. Аномальные hydronephrotic почки могут быть признаны их размер больше или тонкой прозрачной поверхности с расширенной почечной лоханки. Пример растянутый hydronephrotic почек и аномально расширенных hydroureter изображены на рисунке 2A. Расширенные hydroureter обычно приводит к гораздо сильнее визуализации потому что его расширенный объем сохраняет намного больше раствор красителя, чем нормальный, тонкий мочеточника. Если почки и мочеточники повреждены во время вскрытия, изучение мочевыводящих путей перехода препятствий невозможно потому, что краска будет просачиваться необычно на поврежденный участок. Например ненормальных hydroureter на рисунке 2A был поврежден в его середине и, таким образом, последняя позиция раствор красителя неясным и UVJO не могут быть проверены, несмотря на отсутствие красителя в просвете мочевого пузыря (рисунок 2A). Однако эта перинатальной мочевыделительной системы с расширенными hydroureter и растянутый hydronephrotic почек могут иметь UVJO как мочеточника расширяется по своей длине и почек значительно раздуты. Контралатеральной мочевыделительной системы появляется нормальное, как он имеет тонкий мочеточника и красителя впоследствии вступает в просвет пузыря (Рисунок 2Б).
Рисунок 1. Примеры метиленового синего красителя инъекции в нормальной мочевыделительной системы. (A) типичный образ мочевыделительной системы от перинатальной эмбриона (E19.5) после удаления избыточной ткани. С репродуктивных органов, здесь яичек (B) пример краситель инъекции в нормальной почке видны два почек, двух мочеточников и мочевого пузыря. Можно увидеть точки инъекции в почечной лоханки почки (черная стрелка). Слабая Краска цвет виден в просвете мочевого пузыря и мочеточника после позволяя красителя потока для 5 s. (C) краситель накопления в просвете мочевого пузыря после инъекции как нормальной функции почек. Цвет становится сильным от накопления раствор красителя в просвете мочевого пузыря после позволяя краситель поступать для 20 s. Почечной лоханки также видна с слабая краска цвета в почках. B: мочевого пузыря, почек K:, T: яички, U: мочеточника. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Примеры метиленового синего красителя инъекции в мочевыделительной системы с односторонним hydroureter. (A) пример краситель инъекции в мочевыделительной системы с hydroureter и hydronephrotic почки новорожденных женского щенка с расходом краски 15 s. Hydronephrotic почек ясно большле чем контралатеральной почки. Расширены соответствующие мочеточника и краска цвета сильно узнаваем, но hydroureter явно повреждена, как отметил утечка раствор красителя в полости тела. (B) краситель инъекции в контралатеральной почки мочевой системы с односторонним hydroureter с краска поток 20 s. раствор красителя Injected в нормальной функции почек накапливается в мочевого пузыря люмен, подтверждающее, что аномалия является односторонним. B: мочевого пузыря, HK: hydronephrotic почек, Ху: hydroureter K: почек, мочеточника U:, Ut: рога матки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мыши почки начинают в E16.5 функциональных и тестирования внедрения краситель теоретически возможно с этого момента времени. Однако почки слишком малы, чтобы быть вводили раствор красителя и фенотипы гидронефроз и hydroureter не наблюдаются четко поскольку эти фенотипы вторичный эффект мочи, построен из-за ненормального мочи. Эти фенотипы, от препятствий, таких как UPJO или UVJO, очевидны в E18.5 растянутый почек и мочеточников. Большие почки эмбрионов в E19.5 или новорожденных щенков, легче манипулировать, чем те из эмбрионов в E18.5 или моложе. Однако щенков с двусторонними мочевыводящих путей препятствия умирают после рождения. Таким образом выполните эксперименты для проверки CAKUT фенотипов, надлежащим образом выбирая перинатальной эмбрионов или детенышей в зависимости от характеристики экспериментально мыши.
Вскрыть тщательно сохранить нетронутыми мочевыделительной системы перед выполнением инъекций краситель для изучения потенциальных дефектов. Это существенно важно для ненормальных hydronephrotic почек и мочеточников, которые являются очень растянут и легко повреждены во время удаления дополнительных ткани, чтобы разоблачить почек и мочевыводящих путей. Повреждение этих органов во время вскрытия позволит предотвратить полное определение реальных дефектов. Например Рисунок 2 показывает собственный дилатация мочеточника, но красителя утечки не удается показать точки терминала дистального hydroureter.
Всегда не забудьте удалить пузырьки воздуха из шланга и иглы до инъекции, как эти пузыри будет блокировать поток надлежащего красителя. После успешного рассечение важным шагом для изучения обструкции мочевыводящих путей является включение кончик иглы в почечной лоханки. Вставки иглы в верхней половине почки, вблизи проксимального отдела мочеточника, полезно направить кончик иглы в почечной лоханки. Кончик иглы следует указать к проксимального отдела мочеточника. Поскольку почечных кровеносных сосудов расположены вблизи проксимального отдела мочеточника, краситель может поток вдоль почечных кровеносных сосудов, если кончик иглы указывала проксимального отдела мочеточника. В этом случае кончик иглы должны быть скорректированы в почечной лоханки сторону проксимального отдела мочеточника. Кроме того игла может пройти через почки, если вставлен слишком глубоко, вызывая красителя утечки из почек и в полость тела. Тщательное введение кончик иглы в почечной лоханки и мониторинг кончик иглы в почечной лоханки может помочь избежать этой ошибки. Иногда игла будет стать заблокирован почечной ткани во время инъекции если не вставлен в почечной лоханки. В этом случае удаление ткани от иглы, сброс краситель потока, перезапустив гидростатического давления и перенаправить кончик иглы к почечной лоханки. Кроме того фенотипы, связанные с CAKUT может быть односторонним или двусторонним. Поэтому убедитесь, что инъекции проводится отдельно для левой и правой мочевыделительной систем. Оптимально сначала выполните инъекции с явно ненормальной почек для проверки, является ли односторонний UVJO.
Изображения сразу после инъекции испытания, так как краска проходит от почечной лоханки Мочеточник быстро. Это трудно увидеть цвет во время визуализации из нормальной мочеточника потому что нормальные мочеточника является тонкая трубка, хотя краска поток может контролироваться под микроскопом рассечения. Как альтернативный Метиленовый синий 1% быстро зеленый в однократном ПБС также может использоваться и будет отображаться как темно-зеленого цвета9. Помимо окрашивания инъекции, Гистологические срезы почек и мочеточников, после H & E пятнать подтвердит дефекты внутри почек и мочеточников. Кроме того изображения секций с репортером конкретных мочеточника является дополнительный способ подтверждения UVJO7. Однако эти разделы должны быть неповрежденными и серийный секционирование необходимо, чтобы избежать ложных срабатываний. По сравнению с традиционными на основе раздела анализ мочевыделительной систем, этот протокол инъекции краска является мгновенный способ соблюдения целостности почки и мочеточника патентных и визуализировать препятствий, таких как UPJO или UVJO.
Этот протокол обеспечивает простой и toquickly простой метод визуализации структуры мочевыводящих путей в конце стадии развития мыши, которая позволяет анализ развития мочевых путей. Метод, описанный здесь может использоваться для оценки мутации, которые вызывают дефекты развития мочевых путей, как средства выявления изменений в развитии мочевых путей созревания или мочеточника.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор не имеет ничего, чтобы раскрыть.
Acknowledgments
Я благодарю д-р Алан O. Perantoni (CDBL/NCI/низ) для поддержки представления этой рукописи. Я также благодарю д-р Майкл Холл (CDBL/NCI/низ) и Nirmala Шарма (CDBL/NCI/низ) для редактирования этой рукописи. Я благодарен к Лай Тханг (SAIC) за его отличную мыши животноводства. Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения, Национальный институт рака и центр для исследований рака.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML | Fisherscientific | 50-983-204 | |
| 3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip | BD | 309657 | |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall corporation | 4614 | |
| Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12" | EXELINT | 26709 | |
| Delicate Operating Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6702 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5135 | |
| Dumont Tweezers; Pattern #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2" | BD | 305106 |
References
- Rasouly, H. M., Lu, W. Lower urinary tract development and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 307-342 (2013).
- Kispert, A. T-Box Genes in the Kidney and Urinary Tract. Curr Top Dev Biol. 122, 245-278 (2017).
- Bohnenpoll, T., Kispert, A. Ureter growth and differentiation. Semin Cell Dev Biol. 36, 21-30 (2014).
- Nicolaou, N., Renkema, K. Y., Bongers, E. M., Giles, R. H., Knoers, N. V. Genetic, environmental, and epigenetic factors involved in CAKUT. Nat Rev Nephrol. 11, 720-731 (2015).
- Tripathi, P., Wang, Y., Casey, A. M., Chen, F. Absence of canonical Smad signaling in ureteral and bladder mesenchyme causes ureteropelvic junction obstruction. J Am Soc Nephrol. 23, 618-628 (2012).
- Aoki, Y., et al. Id2 haploinsufficiency in mice leads to congenital hydronephrosis resembling that in humans. Genes Cells. 9, 1287-1296 (2004).
- Yun, K., Perantoni, A. O. Hydronephrosis in the Wnt5a-ablated kidney is caused by an abnormal ureter-bladder connection. Differentiation. 94, 1-7 (2017).
- Uetani, N., Bouchard, M. Plumbing in the embryo: developmental defects of the urinary tracts. Clin Genet. 75, 307-317 (2009).
- Murawski, I. J., Watt, C. L., Gupta, I. R. Assessing urinary tract defects in mice: methods to detect the presence of vesicoureteric reflux and urinary tract obstruction. Methods Mol Biol. 886, 351-362 (2012).
- Weiss, A. C., et al. Nephric duct insertion requires EphA4/EphA7 signaling from the pericloacal mesenchyme. Development. 141, 3420-3430 (2014).
