Summary
Inyección de colorante azul de metileno en la pelvis renal facilita la evaluación de los defectos de obstrucción urinaria cruce durante el desarrollo embrionario las vías urinarias del ratón. Aquí, se describe un protocolo para la inyección de colorante azul de metileno en la pelvis renal.
Abstract
Defectos de la obstrucción urinaria cruce son anomalías congénitas inducción de hidronefrosis e Hidrouréter. Defectos de obstrucción urinaria murino cruce pueden evaluarse mediante el seguimiento flujo de tinte de azul de metileno dentro del sistema urinario. Se inyecta azul de metileno en la pelvis renal de riñones embrionarios perinatales y flujo del tinte es monitoreado desde la pelvis renal del riñón por el uréter y en el lumen de la vejiga después de aplicar presión hidrostática. Acumulación de tinte será evidente en el lumen de la vejiga del tracto urinario perinatal normal, pero será limitada entre la pelvis renal y el punto final de un uréter anormal, si se producen obstrucciones del tracto urinario. Este método facilita la confirmación de obstrucción de vías urinarias cruce y visualización del hydronephrosis y del hydroureter. Este manuscrito describe un protocolo para la inyección de tinte de azul de metileno en la pelvis renal para confirmar obstrucciones de cruce de las vías urinarias.
Introduction
El sistema urinario consiste en un par de riñones y uréteres comunes vejiga y uretra. La función principal del sistema urinario es mantener la homeostasis del cuerpo al administrar el equilibrio de agua y electrolitos de la sangre. Los riñones filtran la sangre para control las concentraciones de electrolitos y equilibrio acido-base y producen orina para excretar el exceso de agua y residuos incluidos los solutos y metabolitos. Orina es transportada a través del uréter de la pelvis renal del riñón a la bladderin una manera unidireccional donde se almacenan y finalmente eliminado a través de la uretra1.
Los uréteres son tubos rectos que se origina en el conducto nephric. Después de la brotación del conducto nephric en el día embrionario 10.5 (E10.5) en el ratón, el tallo del uréter se alarga y distingue a una estructura de varias capas llamada urotelio que es impermeable entre ratón E12.5 y E16.5. Las células mesenquimales que rodea el tallo del uréter también se diferencian en tres capas que consiste de internas células del estroma, células de grosor intermedio del músculo liso y fibroblastos adventitial externos. Se propagan las ondas peristálticas ureterales iniciando en la pelvis renal a través de la capa de músculo liso de la pared del uréter a la vejiga para el transporte de orina2,3, que se produce a partir de E16.5 en el ratón1.
Anomalías congénitas del riñón y vías urinarias (CAKUT) se encuentran entre las enfermedades genéticas más frecuentes, presentes en aproximadamente el 1% de fetos humanos1,4y compuesto de una variedad de fenotipos como hidronefrosis e Hidrouréter. La acumulación anormal de orina en el riñón y del uréter produce hydronephrotic del riñón e Hidrouréter formación. Una causa de hidronefrosis o Hidrouréter formación es una obstrucción de las vías urinarias. Obstrucción de la UUP (UPJO) es causada por el flujo de orina aberrantes debido a una obstrucción entre el uréter proximal y la pelvis renal, dando por resultado hydronephrosis y estrechamiento proximal Hidrouréter con forma angular o persistente plegable5, 6. Además, la inserción ectópica del uréter distal en la pared de la vejiga o el tracto reproductivo se denomina obstrucción ureterovesical (UVJO). UVJO también puede inducir la hidronefrosis y hydromegaureter de7,de formación8. Un defecto de unión (UVJ) ureterovesical adicional es el reflujo vesicoureteral (RVU). VUR se caracteriza por flujo retrógrado de orina desde la vejiga hacia el riñón en UVJ. En comparación con UVJO, perinatales embriones con RVU no claramente muestran un riñón hydronephrotic dilatado o Hidrouréter severa fenotipo9.
En el ratón de laboratorio, flujo de orina puede ser examinado por la inyección de un colorante, como azul de metileno, en la pelvis renal9. La solución de azul de injectedmethylene traza la trayectoria de la orina desde la pelvis renal a través del uréter y la vejiga. La hidronefrosis puede ser reconocida por una expansión del tinte en el riñón. UPJO puede ser detectado como una obstrucción del flujo del tinte en el uréter proximal con pelvis renal dilatada5. Cualquier dilatación del uréter indicada un diámetro ensanchado muestra un ejemplo de Hidrouréter. Finalmente, acumulación de tinte en la pared de la vejiga o en el sitio del tracto reproductivo indica UVJO con riñón hydronephrotic distendido y dilatado hydromegaureter7,10. Para detectar el RVU, la solución de tinte se inyecta en la vejiga y el posterior flujo retrógrado es monitoreado en el riñón9.
Aquí, se presenta un protocolo para la inyección de tinte de azul de metileno en la pelvis renal de un embrión perinatal. Este protocolo permite el rastreo de flujo de la orina desde la pelvis renal a través del uréter y la vejiga y verifica posibles obstrucciones de cruce vías urinarias tales como UPJO o UVJO.
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Protocol
ratones (Wnt5a flox / flox ratones (Wnt5a tm1.1Tpy) y la línea Dll1Cre, modelo UVJO) 7 fueron manejados según pautas de NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio y estudió con un protocolo aprobado por el NCI Frederick Animal cuidado y uso.
1. preparación de la solución de colorante azul de metileno
- medir 0,1 g de azul de metileno en polvo.
- Disolver el azul de metileno en solución salina normal 10 mL o 1 x de tampón fosfato salino (PBS) completamente por Vortex.
- Filtro con un filtro de jeringa (tamaño del poro de la membrana 0.45µm) para eliminar la obstrucción durante la inyección de la solución de azul de metileno 10 mg/mL.
- Montar un estéril cuero cabelludo vena set (27GX3/4 ″) con una jeringa desechable de 3 mL y llene la jeringa con 3 mL filtrada azul de metileno solución.
Nota: Para evitar la presión hidrostática y el tinte posterior flujo, coloque la punta de la aguja sobre la jeringa llenada de solución de azul de metileno.
2. Disección de embriones prenatales
- limpio de disección, tijeras y pinzas con etanol al 70%.
- Para recolectar embriones perinatales en E18.5 o E19.5, eutanasia ratones embarazadas primero mediante inhalación de CO 2 y llevar a cabo la dislocación cervical según las pautas de NIH.
Nota: El ratón hembra embarazado generalmente da nacimiento partida en E18.5, sin embargo, los riñones más grandes son más fáciles de manipular. Por lo tanto, son más fáciles de realizar este análisis en riñones en E19.5 más cercano al nacimiento. Sin embargo, cachorros con troquel de obstrucciones urinarias bilateral después del nacimiento. Dependiendo de las características de los ratones experimentales, un día/hora de recogida apropiado debe determinarse empíricamente. - Rociar etanol al 70% en la superficie ventral abdominal y luego abrir la cavidad abdominal ventral mediante disección tijeras y fórceps.
- Levantar el útero entero y separado del cuerpo cortando con tijeras en las puntas de los cuernos uterinos de disección.
- Lavar el útero entero con PBS 1 x en una placa Petri.
- Cortar el útero segmentally con tijeras de disección y retirar decidua placentaria con disección pinzas para exponer los embriones en sacos vitelinos.
- Primero retire el saco vitelino y después retire la membrana amniótica con fórceps para liberar los embriones perinatales de disección.
- Decapitar a un embrión con tijeras de disección. Limpie el exceso de sangre con gasas estériles. Precisar el embrión con su superficie ventral hacia arriba en un microscopio de disección equipado con una cámara digital para la proyección de imagen. Recoger la cola para genotipificación si es necesario.
Nota: Realizar un embrión las inyecciones a la vez. - Abra cuidadosamente la cavidad abdominal del embrión con pinzas por el desgarramiento de la piel. Entonces, Remueva cuidadosamente el exceso órganos y tejidos como el hígado, el estómago y el intestino con fórceps por cortarlos o tirando de los mismos para exponer los riñones, los uréteres y la vejiga que se encuentran dorsalmente ( figura 1A). Absorber el exceso de sangre de embrión disecado con gasas estériles si fuera necesario.
Nota: Sangre exceso interfiere con la identificación de la pelvis renal para la inyección del tinte.
3. Inyección de colorante azul de metileno en la Pelvis Renal y el control de flujo de tinte
- quitar burbujas en la aguja y el tubo por expulsión de solución de azul de metileno de la punta de la aguja de presión hidrostática. Levantar la jeringa que contiene la solución de colorante por encima del nivel de la punta de la aguja para iniciar el flujo y luego baje la jeringa para detener flujo.
- Insertar la aguja en la pelvis renal cerca de uréter proximal, procurando no para lo una vez colocado molestar a. Realizar la inyección de colorante en un riñón para determinar la obstrucción del tracto urinario.
Nota: Ejecutar el tinte inyección en cualquier renal anormal 7 primera siguiendo la misma forma para determinar la obstrucción del tracto urinario. - Levante la jeringa hasta unos 20 cm para proporcionar presión hidrostática y dejar 15 μl - 60 μL del flujo de la solución colorante. La tasa de flujo será aproximadamente 3 μl/s si la jeringa se eleva a esta altura el embrión.
- Monitorear el color azul del colorante a partir de primero en la pelvis renal, entonces en la longitud del uréter y finalmente en el lumen de la vejiga.
Nota: Tarda cerca de 5 s para ver un color de tinte débiles emergen dentro del lumen de la vejiga si el uréter se inserta correctamente en la vejiga. Permitir que el tinte que se acumulan en el sitio bloqueado cerca de 15 s si no hay color de tinte en el lumen de la vejiga aparece. - Coloque la jeringa hasta la parada de tinte flujo y retire la aguja del riñón.
- Tomar imágenes de los riñones, el uréter y la vejiga trazado con solución colorante usando la cámara y programa la proyección de imagen conectan a un estereomicroscopio.
- Hacer un registro de hidronefrosis del riñón, hydroureter y la posición final de la solución de colorante en un cuaderno de laboratorio.
- Realizar la inyección del riñón contralateral como se describe en las secciones 3.1) a 3.5) y permitir el flujo del tinte cerca de 20 s en total.
Nota: La luz de la vejiga se llenará con solución colorante, indicado por un color azul fuerte, si el uréter se inserta adecuadamente en el lumen de la vejiga. Después de la evaluación de obstrucción de la Unión de las vías urinarias, los uréteres y la vejiga pueden ser fijados para seccionamiento.
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Representative Results
Los riñones y sistema urinario inferior se encuentran dorsal a la mayoría de los otros órganos internos como el hígado y el intestino. Después de quitar estos otros órganos internos, un par de riñones y los uréteres y la vejiga de una sola son visibles (figura 1A). Sobre disección exitosa, fluirá el colorante inyectado en la pelvis renal del riñón en la vejiga vía el uréter. La pelvis renal es la forma de embudo parte proximal dilatada del uréter en el riñón. Por lo tanto, el punto de inyección de tinte está cerca del uréter proximal visible conectado con el riñón como se indica con flechas negras (figura 1B-1C). Después de la inyección con solución colorante de azul de metileno en un riñón, el tinte fluye desde la pelvis renal a través del uréter y la vejiga dando por resultado un color azul visible en el lumen del uréter y la vejiga, si no existen obstrucciones del tracto urinario (figura 1B ). La solución de tinte generalmente desaparece en un uréter normal rápidamente incluso antes de la proyección de imagen, y el color del tinte en el uréter es débil porque el uréter normal es un tubo delgado. Sin embargo, el flujo del tinte en el uréter puede observarse con un microscopio de disección. Un color azul fuerte en el lumen de la vejiga aparece como el resultado de un flujo más largo de alrededor de 20 s en total después de la inyección de ambos riñones con la solución de colorante (figura 1). Acumulación de tinte en la vejiga después de la inyección contralateral indica que el segundo sistema urinario no tiene cualquier obstrucción de la Unión de las vías urinarias.
Es razonable inyectar un riñón obviamente anormal primero para confirmar obstrucciones de cruce de las vías urinarias. Los riñones hydronephrotic anormal pueden ser reconocidos por su tamaño más grande o delgada superficie transparente con una ampliado de la pelvis renal. Un riñón hydronephrotic dilatado de ejemplo y un Hidrouréter anormalmente dilatado son representados en la figura 2A. Un Hidrouréter dilatado generalmente resulta en una visualización mucho más fuerte porque su volumen expandido conserva mucho más solución de tinte de un uréter normal y delgada. Si se dañan los riñones o los uréteres durante la disección, el examen de las obstrucciones de las vías urinarias cruce es imposible porque el tinte se derramará aberrantemente en el sitio dañado. Por ejemplo, el hydroureter anormal en la figura 2A fue dañado en su medio y, por lo tanto, la posición final de la solución de tinte es claro y UVJO no puede ser verificado a pesar de la ausencia de colorante en el lumen de la vejiga (figura 2A). Sin embargo, este sistema urinario perinatal con Hidrouréter dilatado y distendido hydronephrotic del riñón puede tener UVJO como el uréter se ensancha a lo largo de su longitud y el riñón se dilata claramente. El sistema urinario contralateral aparece normal como tiene un uréter fino y colorante entra posteriormente en el lumen de la vejiga (figura 2B).
Figura 1. Ejemplos de la inyección de tinte de azul de metileno en un aparato urinario normal. (A) una imagen típica del sistema urinario de un embrión perinatal (E19.5) después de quitar el exceso de tejido. Dos riñones, dos uréteres y una vejiga se observan con los órganos reproductivos, los testículos aquí (B) un ejemplo de la inyección de colorante en un riñón normal. Se aprecia un punto de inyección en la pelvis renal del riñón (flecha negra). Un débil tinte color es visible en el uréter y el lumen de la vejiga después de permitir que el tinte del que durante 5 s. colorante (C) la acumulación en el lumen de la vejiga después de la inyección de ambos riñones normales. El color llega a ser fuerte en la acumulación de la solución del tinte en el lumen de la vejiga después de permitir que el tinte a 20 s. La pelvis renal también es visible con el color de tinte débil en el riñón. B: vejiga riñón K:, T: testículo, U: uréter. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Ejemplos de azul de metileno colorante inyección en un sistema urinario con Hidrouréter unilateral. (A) un ejemplo de la inyección de colorante en un urinario con un Hidrouréter y un riñón hydronephrotic de un cachorro hembra neonatal con flujo de tinte de 15 s. El riñón hydronephrotic es claramente más grande que el riñón contralateral. Se dilata el uréter correspondiente y el color del tinte es muy reconocible pero el hydroureter está claramente dañado según lo observado por fugas de la solución de tinte en la cavidad del cuerpo. (B) inyección de colorante en el riñón contralateral de un urinario con Hidrouréter unilateral con flujo del tinte de 20 s. solución de colorante inyectado en el riñón normal se acumula en el lumen de la vejiga confirmando que la anomalía es unilateral. B: vejiga, HK: riñón hydronephrotic, HU: Hidrouréter K: riñón, uréter U:, Ut: cuerno uterino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Riñones de ratón son funcionales a partir de las E16.5 y una prueba de inyección de tinte es teóricamente posible a partir de este momento. Sin embargo, el riñón es demasiado pequeño para ser inyectada con la solución de tinte y fenotipos como hidronefrosis Hidrouréter no se observan claramente puesto que estos fenotipos son un efecto secundario de orina acumulado debido al transporte anormal de la orina. Estos fenotipos, de los obstáculos como UPJO o UVJO, son evidentes en E18.5 por distensión de los riñones y los uréteres. Riñones más grandes de embriones E19.5 o cachorros neonatales son fáciles de manipular que los embriones en E18.5 o más joven. Sin embargo, cachorros con troquel de obstrucciones urinarias bilateral después del nacimiento. Por lo tanto, realizar experimentos para validar los fenotipos CAKUT eligiendo apropiadamente embriones perinatales o cachorros dependiendo de las características experimentales del ratón.
Disecar cuidadosamente para mantener un sistema urinario intacto antes de realizar la inyección de tinte para examinar posibles defectos. Esto es esencialmente importante para los anormales hydronephrotic riñones y uréteres, que son muy dilatada y fácilmente dañadas durante la extracción de tejido extra para exponer los riñones y vías urinarias. Dañar estos órganos durante la disección evitará una determinación completa de los defectos reales. Por ejemplo, la figura 2 muestra dilatación distinta de un uréter, pero la fuga de colorante es incapaz de mostrar el punto terminal del hydroureter distal.
Siempre asegúrese de eliminar burbujas de aire de la tubería y la aguja antes de la inyección, como estas burbujas de bloquear el flujo del tinte adecuado. Después de la disección exitosa, el paso crítico para examinar la obstrucción del tracto urinario es la inserción de la punta de la aguja en la pelvis renal. La inserción de la aguja en la mitad superior del riñón, cerca del uréter proximal, es útil para dirigir la punta de la aguja en la pelvis renal. Punta de la aguja debe apuntar hacia el uréter proximal. Puesto que los vasos sanguíneos renales están situados cerca del uréter proximal, el tinte puede fluir a lo largo de los vasos renales a menos que la punta de la aguja apunta hacia el uréter proximal. En este caso, debe ajustarse la punta de la aguja en la pelvis renal hacia el uréter proximal. Además, la aguja puede pasar a través del riñón si inserta demasiado profundamente, haciendo que el tinte se escape fuera del riñón y en la cavidad del cuerpo. Cuidadosa inserción de la punta de la aguja en la pelvis renal y el control de la punta de la aguja dentro de la pelvis renal puede ayudar a evitar este fracaso. A veces, la aguja va estar bloqueada por tejido renal durante la inyección si no se inserta en la pelvis renal. En este caso, quite el tejido de la aguja, restablecer flujo de tinte por reiniciar la presión hidrostática y redirigir la punta de la aguja hacia la pelvis renal. Además, los fenotipos asociados a CAKUT pueden ser unilateral o bilateral. Por lo tanto, asegúrese de que la inyección se realiza por separado para los sistemas de izquierda y derecha urinarios. Óptimo, realizar la inyección primero con un riñón obviamente anormal para verificar si el UVJO es unilateral.
Imagen inmediatamente después de la prueba de inyección ya que el tinte pasa desde la pelvis renal uréter rápidamente. Es difícil ver el color durante la proyección de imagen de un uréter normal porque un uréter normal es un tubo delgado, aunque el flujo de tinte puede controlarse con el microscopio de disección. Como alternativa al azul de metileno, verde rápido en PBS 1 x 1% también se puede utilizar y aparecerá como un color verde oscuro9. Además de la inyección de tinte, cortes histológicos de los riñones y los uréteres después de H & E tinción confirma los defectos dentro de los riñones y los uréteres. También, la proyección de imagen de secciones con un reportero específico del uréter es una forma adicional para confirmar UVJO7. Sin embargo, estas secciones deben estar intactas y seccionamiento serial es necesario para evitar falsos positivos. Comparado con el tradicionales análisis basados en la sección de los sistemas urinarios, este protocolo de inyección de tinte es una manera instantánea para observar la integridad del riñón y del uréter patentes y visualizar obstrucciones tales como UPJO o UVJO.
Este protocolo proporciona un simple y sencillo método toquickly visualizar el tracto urinario estructura en desarrollo etapa finales del ratón, que permite el análisis del desarrollo de las vías urinarias. El método aquí descrito puede utilizarse para evaluar las mutaciones que causan defectos de desarrollo de vías urinarias, como medio de identificación de cambios en el tracto urinario desarrollo maduración o del uréter.
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Disclosures
El autor no tiene nada que revelar.
Acknowledgments
Agradezco a Dr. Alan O. Perantoni (NIH/NCI/CDOBLE) para apoyar la presentación de este manuscrito. También agradezco el Dr. Michael Hall (NIH/NCI/CDOBLE) y Nirmala Sharma (NIH/NCI/CDOBLE) para la edición de este manuscrito. Agradezco a Lai Thang (SAIC) para su cría de ratón excelente. Este trabajo fue apoyado por los institutos nacionales de salud, Instituto Nacional del cáncer y centro de investigación del cáncer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML | Fisherscientific | 50-983-204 | |
| 3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip | BD | 309657 | |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall corporation | 4614 | |
| Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12" | EXELINT | 26709 | |
| Delicate Operating Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6702 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5135 | |
| Dumont Tweezers; Pattern #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2" | BD | 305106 |
References
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