Summary
Metilen mavisi boya enjeksiyon renal pelvis içine idrar yolu junction obstrüksiyonu kusurları değerlendirme sırasında fare embriyonik üriner sistem geliştirme kolaylaştırır. Burada, renal pelvis içine Metilen mavisi boya enjeksiyon için bir protokol açıklanmıştır.
Abstract
İdrar yolu junction obstrüksiyonu kusurları Konjenital anomalileri hydronephrosis ve hydroureter inducing vardır. Fare idrar yolu junction obstrüksiyonu kusurları Üriner sistemin içinde Metilen mavisi Boya akışı izleme tarafından tespit edilebilir. Metilen mavisi boya perinatal embriyonik böbrek renal pelvis enjekte edilir ve boya akışı hidrostatik basınç uygulandıktan sonra Üreter ve mesane Lümen içine böbrek renal pelvis üzerinden izlenir. Boya birikimi normal perinatal idrar kesesi Lümen belirgin olacak ama idrar yolu engellerden oluşursa renal pelvis ve anormal bir üreter, bitiş noktası arasında kısıtlı olacak. Bu yöntem idrar yolu Kavşağı engelleri onayı ve görselleştirme hydronephrosis ve hydroureter kolaylaştırır. Bu el yazması için idrar yolu Kavşağı engelleri onaylamak için renal pelvis içine Metilen mavisi boya enjeksiyon protokolünü açıklar.
Introduction
Üriner sistemin bir böbrek ve Üreter ve ortak bir mesane ve üretra ile oluşur. Üriner sistemin ana kan su ve elektrolit dengesi yöneterek vücut homeostazı korumak için fonksiyonudur. Böbrekler denetim elektrolit konsantrasyonları ve asit-baz dengesi kan filtre ve aşırı su ve solutes ve metabolitleri dahil olmak üzere atık salgılamak idrar üretmek. İdrar sonra böbrek renal pelvis üzerinden üreter nerede depolandığı ve sonuçta ortadan üretra1yolu ile tek yönlü bir şekilde bladderin için aracılığıyla taşınır.
Üreter düz borular nephric kanalı kaynaklanan vardır. Sonra fare embriyonik günde 10.5 (E10.5), tomurcuklanma nephric kanalı üzerinden üreter SAP hisli ve çok katmanlı bir yapıda fare arasında geçirimsiz olan urothelium adı verilen E12.5 ve E16.5 ayırır. Üreter sapı çevreleyen Mezenkimal hücreler de iç stromal hücreler, orta kalın düz kas hücreleri ve dış adventitial fibroblastlar içeren üç katmanlara farklı. Renal pelvis başlatılıyor üreteral Peristaltik dalgalar E16.5 içinde fare1başlayarak üretilen idrar2,3, taşımak için mesane üreter duvara düz kas tabakası yoluyla yayılır.
Konjenital anomalileri, böbrek ve idrar yolu (CAKUT) en sık görülen genetik hastalıklar, insan fetusa1,4, yaklaşık % 1'mevcut arasındadır ve fenotipleri hydronephrosis ve hydroureter de dahil olmak üzere çeşitli oluşur. İdrar hydronephrotic böbrek ve hydroureter oluşumu böbrek ve üreter sonucu anormal birikimi. Bir hydronephrosis ve/veya hydroureter oluşumu idrar yollarının bir obstrüksiyon nedenidir. Ureteropelvic junction obstrüksiyonu (UPJO) anormal idrar akışı proksimal Üreter ve renal pelvis, hydronephrosis ve proksimal hydroureter bükülme veya kalıcı katlanır5daralma sonuçlanan arasında bir tıkanma nedeniyle neden olur, 6. Buna ek olarak, mesane duvar veya üreme sistemi içine distal üreter Ektopik ekleme ureterovesical junction obstrüksiyonu (UVJO) denir. UVJO hydronephrosis ve hydromegaureter oluşumu7,8de tetikleyebilir. Vesicoureteric reflü (VUR) bir ek ureterovesical Kavşağı (UVJ) kusurdur. VUR doğru UVJ, böbrek mesane retrograd idrar akışı ile karakterizedir. UVJO için karşılaştırıldığında, VUR ile perinatal embriyo belirgin şişmiş hydronephrotic böbrek veya şiddetli hydroureter fenotip9gösterme.
Laboratuvar fare idrar akışı Metilen mavisi gibi bir boya enjeksiyon renal pelvis9içine tarafından incelenebilir. İnjectedmethylene mavi çözüm idrar yörünge renal pelvis Üreter ve mesanenin içine üzerinden iz olur. Hydronephrosis boya böbrek yönelik kabul edilebilir. UPJO Boya akışı şişmiş renal pelvis5ile proksimal üreter, tıkanması olarak tespit edilebilir. Genişletilmiş bir çapı belirtilen üreter herhangi bir genişleme hydroureter örneği gösterir. Son olarak, boya birikimi mesane duvar veya sitenin üreme sistemi ile şişmiş hydronephrotic böbrek UVJO gösterir ve hydromegaureter7,10santim açılmış. VUR algılamak için boya çözüm mesane enjekte edilir ve sonraki retrograd akışı böbrek9' izlenir.
Burada, perinatal embriyo içine renal pelvis Metilen mavisi boya enjeksiyon için bir protokol sunulmuştur. Bu iletişim kuralı renal pelvis Üreter ve mesanenin idrar akışı izleme sağlar ve UPJO veya UVJO gibi potansiyel idrar yolu Kavşağı engel olunur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
fareler (Wnt5a flox / flox fareler (Wnt5a tm1.1Tpy) ve Dll1Cre satır, UVJO fare modeli) 7 yönetilen bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı için NIH esaslarına göre ve ncı-Frederick hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış bir protokol altında okudu.
1. hazırlık Metilen mavisi boya çözüm
- ölçmek 0.1 gr Metilen mavisi pudra.
- 10 mL normal salin veya 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x Metilen mavisi vortexing tarafından tamamen erimesi.
- Enjeksiyon sırasında tıkanma ortadan kaldırmak için bir şırınga filtre (membran gözenek boyutu 0.45µm) ile 10 mg/mL Metilen mavisi çözüm filtre.
- Montajı steril bir kafa derisi damar seti (27GX3/4 ″) 3 mL tek kullanımlık şırınga ve dolgu 3 mL şırınga ile Metilen mavisi çözüm filtre.
Not: hidrostatik basınç ve sonraki Boya akışı önlemek için Metilen mavisi çözüm ile dolu şırınga yukarıda iğne ucu yerleştirin.
2. Doğum öncesi embriyo diseksiyon
- temiz makas ve Forseps ile % 70 etanol dissekan.
- E18.5 veya E19.5, Perinatal embriyo toplamak için ötenazi hamile fareler ilk CO 2 inhalasyon kullanarak ve servikal çıkığı NIH esaslarına göre gerçekleştirin.
Not: Hamile kadın fare genellikle E18.5, başlangıç doğurur, ancak, daha büyük böbrekler işlemek daha kolay. Bu nedenle, doğum E19.5 daha yakın, böbrekler üzerinde bu Çözümlemeyi gerçekleştirmek daha kolay olur. Ancak, ikili üriner sistem tıkanıklıkları die ile doğumdan sonra sersemler. Deneysel fare özellikleri bağlı olarak uygun toplama gün/saat ampirik olarak belirlenen. - % 70 etanol karın ventral yüzeyde sprey ve karın boşluğu ventrally diseksiyon makası ve forseps kullanarak açın.
- Tüm rahim Asansör ve vücuttan makas rahim boynuzları ucunda diseksiyon ile keserek ayırın.
- 1 x PBS ile tüm rahim bir kabında durulayın.
- Segmentally makas diseksiyon ile rahim kesme ve forseps sarısı sacs embriyoların ortaya çıkarmak için anatomi ile plasental decidua kaldırmak.
- Sarısı sac ilk perinatal embriyo kurtarmak için forseps diseksiyon ile amniyotik membran sökün ve.
- Makas diseksiyon ile bir embriyo başını kesmek. Steril gazlı bez yastıkları ile aşırı kan yok etmek. Embriyo ventral yüzeyi ile yukarı üzerinde görüntüleme için bir dijital fotoğraf makinesi ile donatılmış diseksiyon mikroskop pin. Kuyruğunu Genotipleme için toplamak.
Not: bir kerede enjeksiyonları bir embriyo gerçekleştirmek. - Dikkatli bir embriyo karın boşluğuna Forseps ile cilt yırtılma tarafından açın. O zaman, dikkatli bir şekilde fazla organ ve dokulara karaciğer, mide ve bağırsak gibi Forseps ile onları kesme veya böbrekler, Üreter ve dorsally yer alan mesane ortaya çıkarmak için dışarı çekerek çıkarın ( şekil 1A). Steril gazlı bez yastıkları ile disseke embriyo aşırı kan absorbe.
Not: Aşırı kan boya enjeksiyon renal pelvis tanımlaması etkilemektedir.
3. Metilen mavisi boya enjeksiyon Renal Pelvis ve izleme Boya akışı içine
- iğne ve iğne ucu çözümden Metilen mavisi tarafından hidrostatik basınç kovma tarafından tüp Kaldır kabarcıkları. Akışını başlatmak için iğne ucu seviyesinin üzerinde boya solüsyon içeren şırınga kaldırın ve sonra akışını durdurmak için şırınga düşürebilir.
- Bu kez yerleştirilen bozmamaya dikkat çekici proksimal üreter yakınındaki renal pelvis iğne takın. Böbrek, idrar yolları tıkanıklığı belirlemek için içine boya enjeksiyon gerçekleştirmek.
Not: Gerçekleştirmek boya herhangi bir anormal böbrek 7 içine enjeksiyon ilk onun idrar yolları tıkanıklığı belirlemek için aynı yolu izleyerek. - Şırınga hidrostatik basınç sağlamak ve 15 µL - 60 µL boya çözüm akış izin yaklaşık 20 cm yukarı kaldır. Şırınga embriyo üzerindeki bu yükseklik için harekete geçirilen akış hızı yaklaşık 3 µL/s olacak.
- Renal pelvis sonra üreter uzunluğu ilk başlangıç boya mavi rengini izlemek ve son olarak mesane Lümen içinde.
Not: Bu yaklaşık 5 alır s üreter mesane düzgün eklenirse mesane Lümen içinde ortaya bir zayıf boya renk görmek için. Boya bloke sitesinde yaklaşık 15 birikmesine izin yok boya renk mesane Lümen görüntülenirse s. - Dur Boya akışı aşağı şırınga yerleştirin ve böbrek iğne kaldırma.
- Böbrek, Üreter ve boya çözüm ile takip mesane almak görüntüleri kamera kullanarak ve program görüntüleme bağlı bir stereomicroscope.
- Hydronephrosis böbrek, hydroureter ve boya çözüm son konumunu kaydını yapmak bir laboratuvar defter.
- Gerçekleştir enjeksiyon kontralateral böbrek açıklandığı gibi bölümleri 3.1) 3.5) ve boya akışı yaklaşık 20 izin s toplam.
Not: Mesane Lümen üreter düzgün mesane Lümen eklediyseniz güçlü bir mavi renk tarafından belirtilen boya Çözümle değiştirebilirsiniz. Sonra değerlendirme idrar yolu Kavşağı tıkanıklığının, Üreter ve mesanenin kesit için sabit olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Böbrekler ve alt üriner sistem sırt en diğer iç organlara karaciğer ve bağırsak gibi yer alır. Bu diğer iç organlara kaldırdıktan sonra bir çift böbrek ve Üreter ve tek bir mesane görülebilir (şekil 1A) vardır. Başarılı diseksiyon renal pelvis enjekte boya böbrek mesane yoluyla üreter içine akar. Renal pelvis huni benzeri dilate proksimal üreter böbrek parçasıdır. Bu nedenle, boya enjeksiyon noktası görünür proksimal üreter siyah oklarla (şekil 1B-1 C) belirtildiği gibi böbrek ile bağlı yakındır. Sonra bir böbrek içine enjeksiyonu ile Metilen mavisi boya çözüm, renal pelvis Üreter ve Üreter ve mesane Lümen görünür bir mavi renkteki idrar yolu engel yoksa sonuçlanan mesane (şekil 1B içine gelen boya akar ). Boya çözüm içinde normal bir üreter genellikle hızlı bir şekilde bile görüntüleme önce kaybolur ve normal üreter ince bir tüp olduğundan üreter boya renk zayıftır. Ancak, Üreter akışında boya diseksiyon mikroskopla görülebilir. Yaklaşık 20 daha uzun bir akış sonucu olarak mesane Lümen güçlü bir mavi renkte görünür s toplam boya solüsyonu (şekil 1 c) her iki böbrek enjeksiyon sonra. Mesane boya birikimi kontralateral enjeksiyon sonra ikinci Üriner sistemde herhangi bir idrar yolu Kavşağı tıkanıklık yok gösterir.
Öncelikle herhangi bir idrar yolu Kavşağı engelleri onaylamak için belli ki anormal bir böbrek enjekte etmek uygun olur. Anormal hydronephrotic böbrekler daha büyük boyut veya ince şeffaf yüzeyi ile genişletilerek renal pelvis tarafından kabul edilebilir. Bir örnek şişmiş hydronephrotic böbrek ve bir anormal derecede dilate hydroureter şekil 2Atasvir edilir. Genişletilmiş hacmi normal, ince üreter daha çok daha fazla boya çözüm koruyacağından dilate hydroureter çok daha güçlü görsel öğeyi içinde genellikle sonuç. Böbrekler ve/veya üreter diseksiyon sırasında zarar görmüşse boya aberrantly hasarlı sitesinde sızıntı olacaktır çünkü idrar yolu Kavşağı engelleri incelenmesi mümkün değildir. Örneğin, şekil 2A anormal hydroureter onun orta hasar gördü ve, bu nedenle, boya çözüm son konumunu belirsizdir ve UVJO mesane Lümen (şekil 2A) boya yokluğu rağmen doğrulanamıyor. Ancak, bu perinatal üriner sistem ile dilate hydroureter ve şişmiş hydronephrotic böbrek UVJO üreter uzunluğu genişledi ve böbrek belirgin şişmiş olabilir. Kontralateral Üriner Sistem gibi bu ince Üreter ve boya daha sonra mesane Lümen (2B rakam) girer normal görünüyor.
Şekil 1. Metilen mavisi örnekleri normal üriner sistem içine enjeksiyon boya. (A) Üriner sistemin aşırı doku çıkarıldıktan sonra perinatal bir embriyo (E19.5) tipik bir görüntü. İki böbrek, iki Üreter ve bir mesane ile üreme organları, burada testisler (B) normal böbrek içine boya enjeksiyon örneği görülmektedir. Renal pelvis bir enjeksiyon noktasına böbrek (siyah ok) görülebilir. Zayıf boya renk Üreter ve mesane Lümen 5 s. (C) boya biriktirme mesane Lümen içinde normal her iki böbrek enjeksiyon sonra akmaya boya izin sonra görülür. Rengi boya 20 için akış izin sonra mesane Lümen boya çözümde birikimi üzerinden güçlü olur s. Renal pelvis da böbrek zayıf boya renk ile görünür. B: mesane, K: böbrek, T: testis, U: üreter. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Metilen mavisi örnekleri boya ile tek taraflı hydroureter üriner sistem içine enjeksiyon. (A) bir hydroureter ve yenidoğan bir dişi yavru bir hydronephrotic böbreği 15 Boya akışı ile üriner sistem içine boya enjeksiyon örneği s. Hydronephrotic böbrek açıkça kontralateral böbrek büyüktür. Karşılık gelen üreter büyümüş ve boya renk şiddetle tanınabilir ama hydroureter açıkça boya çözüm vücut boşluğunda sızdırarak gözlemlediği gibi zarar görmüş. (B) üriner sistem 20 s. Injected boya çözüm boya akışına normal böbrek ile tek taraflı hydroureter ile kontralateral böbrek içine boya enjeksiyon mesane Lümen anormallik tek taraflı olduğunu teyit içinde birikir. B: mesane, HK: hydronephrotic böbrek, HU: hydroureter K: böbrek, U: üreter, Ut: rahim boynuz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fare böbreklerde fonksiyonel E16.5 başında ve bir boya enjeksiyon testi bu zaman noktasından teorik olarak mümkün. Ancak, böbrek boya çözüm ile enjekte edilir çok küçük ve bu fenotipleri anormal idrar taşıma nedeniyle inşa idrar ikincil bir etkisi olduğundan fenotipleri hydronephrosis ve hydroureter gibi açıkça gözlenir değil. UPJO veya UVJO, gibi engellerin üzerinden bu fenotipleri şişmiş böbrek ve üreter tarafından E18.5 açık durumdadır. E19.5 veya neonatal pups embriyolar daha büyük böbrekler bu embriyolar E18.5, daha işlemek daha kolay veya daha genç. Ancak, ikili üriner sistem tıkanıklıkları die ile doğumdan sonra sersemler. Bu nedenle, uygun şekilde perinatal embriyo veya pups bağlı olarak deneysel fare özellikleri seçerek CAKUT fenotipleri doğrulamak için deneyler yapmak.
Olası hataları incelemek için boya enjeksiyon gerçekleştirmeden önce sağlam bir üriner sistem korumak için dikkatle incelemek. Bu, aslında anormal hydronephrotic böbrek ve üreter, böbrekler ve idrar yolları ortaya çıkarmak için ilave doku kaldırma sırasında çok şişmiş ve kolayca zarar için önemlidir. Bu organların diseksiyon sırasında zarar tam belirlenmesi gerçek kusurları engeller. Örneğin, Şekil 2 bir üreter ayrı dilatasyon gösterir, ancak boya sızıntı distal hydroureter terminal noktası göstermek başarısız olur.
Bu baloncuklar uygun boya akışını engeller gibi her zaman tüp ve iğneyi enjeksiyon önce hava kabarcıkları kaldırdığınızdan emin olun. Başarılı diseksiyon sonra idrar yolları tıkanıklığı incelemek için kritik renal pelvis içine iğne ucu ekleme adımdır. Proksimal üreter yakınındaki böbrek üst yarısı içine iğne ekleme iğne ucu renal pelvis yönlendirmek yararlıdır. İğne ucu proksimal üreter doğru işaret etmelidir. Beri böbrek kan damarları proksimal üreter bulunan, iğne ucu proksimal üreter doğru işaret sürece boya böbrek kan damarları akışı olabilir. Bu durumda, iğne ucu renal pelvis proksimal üreter doğru olarak ayarlanmalıdır. Ayrıca, iğne böbrek böbrek ve vücut boşluğu içine sızmaya boya neden çok derine eklediyseniz geçişi. Renal pelvis ve renal pelvis içinde iğne ucu izleme içine iğne ucunun dikkatli ekleme bu hata önlemenize yardımcı olur. Renal pelvis takılı değil bazen, iğne böbrek doku tarafından enjeksiyon sırasında olmak-ecek kütük parçası. Bu durumda, iğneden dokuyu, hidrostatik basınç yeniden başlatarak Boya akışı sıfırlamak ve iğne ucu renal pelvis doğru yönlendirmek. Buna ek olarak, CAKUT ile ilişkili fenotipleri tek taraflı veya iki taraflı olabilir. Bu nedenle, enjeksiyon sol ve sağ Üriner sistemleri için ayrı ayrı gerçekleştirilir emin olun. En iyi şekilde, enjeksiyon ilk UVJO tek taraflı olup olmadığını doğrulamak için belli ki anormal bir böbrekle gerçekleştirin.
Görüntü sonra hemen enjeksiyon testi beri boya renal pelvis üreter çabuk geçiyor. Çünkü normal üreter ince bir tüp Boya akışı diseksiyon mikroskop altında takip edilebilir olsa da normal bir üreter görüntüleme sırasında renk görmek zordur. Alternatif için Metilen mavisi olarak % 1 1 x PBS hızlı yeşil de kullanılabilir ve koyu yeşil renk9olarak görünür. Boya enjeksiyonu, böbrek ve üreter H takip histolojik bölümlerine ek olarak & E boyama böbrek ve üreter içinde kusurları onaylamak. Ayrıca, Üreter belirli muhabir ile bölümlerin görüntülemede UVJO7onaylamak için bir başka yoludur. Ancak, bu bölümler sağlam olmalı ve seri kesit yanlış pozitif önlemek gereklidir. Geleneksel bölüm tabanlı analizler Üriner sistemleri ile karşılaştırıldığında, bu boya enjeksiyon böbrek ve patent üreter bütünlüğünü gözlemlemek ve engelleri UPJO veya UVJO gibi görselleştirmek için anlık bir şekilde iletişim kuralıdır.
Bu iletişim kuralı basit bir sağlar ve basit yöntem toquickly idrar yolu yapısı üriner sistem geliştirme analiz sağlar geç sahne fare geliştirme görselleştirin. Burada açıklanan yöntemi değişiklikleri olgunlaşma veya üreter, idrar yolu gelişiminde tanıtan bir aracı olarak gelişimsel idrar yolu kusurları, neden mutasyonlar değerlendirmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.
Acknowledgments
Dr. Alan O. Perantoni (CDBL/ncı/NIH) bu el yazması sunulması destek için teşekkür ederiz. Ben de Dr Michael Hall (CDBL/ncı/NIH) ve Nirmala Sharma (CDBL/ncı/NIH) bu el yazması düzenleme için teşekkür ederim. Ben onun mükemmel fare yetiştiriciliği için Lai Thang (SAIC) için minnettarım. Bu eser kanser araştırmaları için Ulusal Kanser Enstitüsü sağlık ve Merkezi Ulusal Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML | Fisherscientific | 50-983-204 | |
| 3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip | BD | 309657 | |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall corporation | 4614 | |
| Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12" | EXELINT | 26709 | |
| Delicate Operating Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6702 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5135 | |
| Dumont Tweezers; Pattern #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2" | BD | 305106 |
References
- Rasouly, H. M., Lu, W. Lower urinary tract development and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 307-342 (2013).
- Kispert, A. T-Box Genes in the Kidney and Urinary Tract. Curr Top Dev Biol. 122, 245-278 (2017).
- Bohnenpoll, T., Kispert, A. Ureter growth and differentiation. Semin Cell Dev Biol. 36, 21-30 (2014).
- Nicolaou, N., Renkema, K. Y., Bongers, E. M., Giles, R. H., Knoers, N. V. Genetic, environmental, and epigenetic factors involved in CAKUT. Nat Rev Nephrol. 11, 720-731 (2015).
- Tripathi, P., Wang, Y., Casey, A. M., Chen, F. Absence of canonical Smad signaling in ureteral and bladder mesenchyme causes ureteropelvic junction obstruction. J Am Soc Nephrol. 23, 618-628 (2012).
- Aoki, Y., et al. Id2 haploinsufficiency in mice leads to congenital hydronephrosis resembling that in humans. Genes Cells. 9, 1287-1296 (2004).
- Yun, K., Perantoni, A. O. Hydronephrosis in the Wnt5a-ablated kidney is caused by an abnormal ureter-bladder connection. Differentiation. 94, 1-7 (2017).
- Uetani, N., Bouchard, M. Plumbing in the embryo: developmental defects of the urinary tracts. Clin Genet. 75, 307-317 (2009).
- Murawski, I. J., Watt, C. L., Gupta, I. R. Assessing urinary tract defects in mice: methods to detect the presence of vesicoureteric reflux and urinary tract obstruction. Methods Mol Biol. 886, 351-362 (2012).
- Weiss, A. C., et al. Nephric duct insertion requires EphA4/EphA7 signaling from the pericloacal mesenchyme. Development. 141, 3420-3430 (2014).
