Summary
Methyleenblauw kleurstof injectie in het bekken renal vergemakkelijkt de beoordeling van de urinewegen junction obstructie gebreken tijdens de ontwikkeling van muis embryonale urinewegen. Hier, wordt een protocol voor methyleenblauw kleurstof injectie in het bekken renal beschreven.
Abstract
Urinewegen junction obstructie gebreken zijn aangeboren anomalieën inducerende hydronephrosis en hydroureter. Lymfkliertest urinewegen junction obstructie gebreken kunnen worden beoordeeld door het bijhouden van methyleenblauw kleurstof stroom binnen het urine-systeem. Kleurstof methyleenblauw wordt geïnjecteerd in het bekken van de renal van perinatale embryonale nieren en kleurstof stroom wordt gecontroleerd van de renal bekken van de nieren via de urineleider en in het lumen van de blaas na het toepassen van hydrostatische druk. Kleurstof accumulatie zal blijken in de blaas lumen van de normale perinatale urinewegen, maar tussen de renal bekken en het eindpunt van een abnormale urineleider, zal worden beperkt als urinewegen obstakels optreden. Deze methode bevordert de bevestiging van de urinewegen junction obstakels en visualisatie van hydronephrosis en hydroureter. Dit manuscript wordt een protocol voor methyleenblauw kleurstof injectie in het bekken van de renal te bevestigen urinewegen junction obstakels beschreven.
Introduction
Het urine-systeem bestaat uit een paar van de nieren en de urineleiders en een gemeenschappelijk blaas en urinebuis. De belangrijkste functie van het urine-systeem is het handhaven van de homeostase van het lichaam door het beheer van het water en elektroliet evenwicht van het bloed. De nieren filteren het bloed controle elektrolyt concentraties en zuur-base evenwicht, en produceren van urine om overtollig water en afvalstoffen, met inbegrip van opgeloste stoffen en metabolieten uitscheiden. Urine wordt vervolgens vervoerd via de urineleider uit de renal bekken van de nier naar de bladderin een unidirectionele wijze waar ze worden opgeslagen en uiteindelijk uitgeschakeld via de urinebuis1.
De urineleiders zijn rechte buizen die afkomstig zijn uit de nephric buis. Na de ontluikende uit de nephric buis ten embryonale dage 10.5 (E10.5) in de muis, de urineleider Steel kieuwopeningenvorm en onderscheidt in een meerdere lagen structuur urothelium die ondoordringbare tussen muis genaamd E12.5 en E16.5. De Mesenchyme cellen rondom de urineleider stengel zijn ook onderscheid gemaakt tussen drie lagen bestaande uit innerlijke stromale cellen, tussenliggende dikke zachte spiercellen en buitenste adventitial fibroblasten. Ureterale peristaltische golven initiëren in het bekken renal worden verspreid via de laag van de gladde spieren van de muur van de urineleider naar de blaas voor het vervoer van urine2,3, dat wordt geproduceerd bij het basisgewicht van E16.5 in de muis1.
Aangeboren afwijkingen van de nieren en urinewegen (CAKUT) behoren tot de meest voorkomende genetische ziekten, aanwezig in ongeveer 1% van menselijke foetussen1,4, en bestaat uit een scala aan fenotypen met inbegrip van hydronephrosis en hydroureter. De abnormale ophoping van urine in de nier en urineleider resulteert in de vorming van hydronephrotic-nier- en hydroureter. Een oorzaak van de vorming van hydronephrosis en/of hydroureter is een verstopping van de urinewegen. Ureteropelvic junction obstructie (UPJO) wordt veroorzaakt door afwijkende urine stroom als gevolg van een blokkade tussen de proximale urineleider en de renal bekken, resulterend in hydronephrosis en het verkleinen van de proximale hydroureter met gehoekt of hardnekkige vouwen5, 6. Daarnaast heet het ectopische inbrengen van de distale urineleider in de blaas muur of het voortplantingskanaal ureterovesical junction obstructie (UVJO). UVJO kan ook leiden tot hydronephrosis en hydromegaureter vorming7,8. Een extra ureterovesical junction (UVJ) defect is vesicoureteric reflux (VUR). VUR wordt gekenmerkt door de stroom van de retrograde urine uit de blaas naar de nieren op UVJ. In vergelijking met UVJO, zijn perinatale embryo's met VUR niet duidelijk zichtbaar een opgezwollen hydronephrotic nier- of ernstige hydroureter fenotype9.
In het laboratorium muis, kan stroom van urine worden onderzocht door de injectie van een kleurstof, zoals methyleenblauw, in de renal bekken9. De injectedmethylene blauwe oplossing zal het traceren van het traject van de urine van de renal bekken via de urineleider en in de blaas. Hydronephrosis kan worden herkend door een uitbreiding van de kleurstof in de nier. UPJO kunnen worden gedetecteerd als een stagnatie van kleurstof stroom op de proximale urineleider met opgezwollen renal bekken5. Een verwijding van de urineleider aangegeven door een uitlopende diameter toont een voorbeeld van hydroureter. Ten slotte, kleurstof accumulatie op de muur van de blaas of op de site van het voortplantingskanaal geeft UVJO met opgezwollen hydronephrotic nier en hydromegaureter7,10uitgezet. U wilt opsporen VUR, de oplossing kleurstof wordt geïnjecteerd in de blaas en latere retrograde stroom wordt gecontroleerd in de nier9.
Hier, wordt een protocol voor injectie van de kleurstof methyleenblauw in het bekken renal van een perinatale embryo gepresenteerd. Dit protocol staat het traceren van urine vloeien voort uit de renal bekken via de urineleider en in de blaas en wordt gecontroleerd of potentiële urinewegen junction obstakels zoals UPJO of UVJO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Muizen (Wnt5a flox / flox muizen (Wnt5a tm1.1Tpy) en Dll1Cre lijn, UVJO muismodel) 7 werden beheerd volgens de richtlijnen van NIH voor de verzorging en het gebruik van proefdieren was en studeerde onder een protocol dat door het NCI-Frederick Animal Care en gebruik Comité goedgekeurde.
1. bereiding van de kleurstof methyleenblauwoplossing
- meten van 0.1 g methyleenblauw poeder.
- Volledig los van de methyleenblauw in 10 mL normale zout of 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door vortexing.
- Filteren de methyleenblauwoplossing van 10 mg/mL met een spuit filter (membraan poriegrootte 0.45µm) te elimineren verstopping tijdens injectie.
- Assemble een steriele hoofdhuid ader set (27GX3/4 ″) met een disposable spuit 3 mL en vul de spuit met 3 mL gefilterd methyleenblauwoplossing.
Opmerking: Om te voorkomen hydrostatische druk en latere kleurstof stroom, plaats het uiteinde van de naald boven de spuit gevuld met methyleenblauwoplossing.
2. Dissectie van prenatale embryo's
- schone ontrafeling van schaar en pincet met 70% ethanol.
- Voor het verzamelen van perinatale embryo's op E18.5 of E19.5, euthanaseren zwangere muizen eerst met behulp van CO 2 inademing en voer cervicale dislocatie volgens de richtlijnen van de NIH.
Opmerking: De zwangere vrouwelijke muis meestal geeft geboorte starten op E18.5, grotere nieren zijn echter makkelijker te manipuleren. Daarom zijn de nieren bij E19.5 dichter tot geboorte eenvoudiger uit te voeren deze analyse op. Pups echter met bilaterale urinewegen obstakels sterven na de geboorte. Afhankelijk van de kenmerken van experimentele muizen, een geschikte dag/afhaaltijd empirisch moet worden bepaald. - 70% ethanol op het ventrale buik oppervlak spuiten en open vervolgens de buikholte ventrally met behulp van ontleden schaar en pincet.
- Lift de hele baarmoeder en scheiden van het lichaam door te snijden met het ontleden van schaar op de toppen van de baarmoeder horens.
- De hele baarmoeder met 1 x PBS spoel in een petrischaal.
- De baarmoeder segmentally met het ontleden van schaar te knippen en verwijderen van de placenta decidua met pincet om bloot van de embryo's in de dooier zakjes te ontleden.
- De dooierzak eerst verwijderen en verwijder het vruchtwater membraan met de ontrafeling van de verlostang om te bevrijden van de perinatale embryo.
- Decapitate een embryo met het ontleden van de schaar. Veeg overtollige bloed met steriel gaas kussentjes. PIN het embryo naar beneden met het ventrale oppervlak tot op een ontleden Microscoop uitgerust met een digitale camera voor imaging. Verzamelen van zijn staart voor genotypering zonodig.
Opmerking: Het uitvoeren van injecties één embryo tegelijk. - Open zorgvuldig de buikholte van een embryo met een tang door scheuren van de huid. Verwijder daarna voorzichtig overtollige organen en weefsels zoals lever, maag en darm met een tang door snijden ze of trekken ze uit bloot van de nieren, de urineleiders en de blaas die zich bevinden dorsally ( figuur 1A). Absorberen overtollige bloed uit de ontleed embryo met steriel gaas kussentjes zonodig.
Opmerking: Teveel bloed interfereert met de identificatie van het bekken van de renal voor de kleurstof injectie.
3. Injectie van kleurstof methyleenblauw in de Renal bekken en Monitoring kleurstof Flow
- verwijderen bubbels in de naald en de leidingen door uitzetting methyleenblauwoplossing vanaf de punt van de naald door de hydrostatische druk. Til de spuit met de kleurstof oplossing boven het niveau van de naald tip om te beginnen met stroom, en dan lager de spuit om te stoppen met stroom.
- Steek de naald in de renal bekken in de buurt van de proximale urineleider, verzorgen niet te verstoren het eenmaal geplaatst. Uitvoeren van kleurstof injectie in een nier om te bepalen van de urinewegen obstructie.
Opmerking: Voer eerste kleurstof van injectie in een abnormale nier 7 door het volgen van de dezelfde manier om te bepalen van de obstructie van de urinewegen. - Til de injectiespuit omhoog ongeveer 20 cm te voorzien van hydrostatische druk en laat 15 µL - 60 µL van de kleurstof oplossing stroom. Het debiet zullen ongeveer 3 µL/s als de spuit is verhoogd naar deze hoogte boven het embryo.
- Volgen de blauwe kleur van de kleurstof beginnen eerst in het bekken renal, dan in de lengte van de urineleider, en tenslotte in de blaas lumen.
Opmerking: Het duurt ongeveer 5 s om te zien een zwakke afdrukkleur ontstaan binnen het lumen van de blaas als de ureter in de blaas juist is geplaatst. Toestaan dat de kleurstof te accumuleren op de geblokkeerde site ongeveer 15 s als geen kleurstof kleur wordt weergegeven in de blaas lumen. - Plaats de injectiespuit tot stop kleurstof stroom en verwijder de naald uit de nieren.
- Neem beelden van de nier en de ureter de blaas getraceerd met kleurstof oplossing met behulp van de camera en beeldvorming wordt verbonden met een stereomicroscoop.
- Hydronephrosis van de nier, hydroureter en het definitieve standpunt van de kleurstof oplossing noteert in een lab notebook.
- Uitvoeren injectie van de contralaterale nier zoals beschreven in afdelingen 3.1) tot 3,5) en kleurstof stroom ongeveer 20 s Intotaalwerden.
Opmerking: De blaas lumen zal worden gevuld met kleurstof oplossing, aangegeven door een sterke blauwe kleur en als de ureter in de blaas lumen juist is geplaatst. Na beoordeling van de urinewegen junction obstructie, de urineleiders en de blaas kunnen worden vastgesteld voor het segmenteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De nieren en de lagere urinewegen bevinden zich dorsale tot de meeste andere inwendige organen zoals de lever en de darm. Na het verwijderen van deze andere inwendige organen, zijn een paar van de nieren en de urineleiders en de blaas van een enkel zichtbaar (figuur 1A). Na succesvolle dissectie, zal de kleurstof ingespoten in het bekken renal vloeien voort uit de nier naar de blaas via de urineleider. Het bekken renal is het trechter-achtige verwijde proximale deel van de urineleider in de nier. Daarom is de kleurstof inspuittijdstip in de buurt van de zichtbare proximale urineleider verbonden met de nier zoals aangegeven met zwarte pijlen (figuur 1B-1 C). Na injectie met kleurstof methyleenblauwoplossing in één nier stroomt de kleurstof uit de renal bekken via de urineleider en in de blaas wat resulteert in een zichtbare blauwe kleur in de ureter en blaas lumen, als urinewegen obstakels bestaan niet (figuur 1B ). De kleurstof oplossing meestal in een normale urineleider snel verdwijnt nog voor beeldvorming, en de kleur van de kleurstof in de urineleider is zwak, omdat de normale urineleider een dunne buis is. Echter, kleurstof stroming in de ureter kan worden waargenomen met een ontleden Microscoop. Een sterke blauwe kleur in het lumen van de blaas wordt weergegeven als het resultaat van een lange stroom van ongeveer 20 s in totaal na injectie van beide nieren met de kleurstof oplossing (Figuur 1 c). Accumulatie van de kleurstof in de blaas na het contralaterale injectie geeft aan dat de tweede urine-systeem niet elke urinewegen junction obstructie hoeft.
Het is redelijk om te injecteren een duidelijk abnormale nier eerst om te bevestigen eventuele urinewegen junction obstakels. Abnormale hydronephrotic nieren kunnen worden herkend door hun grotere omvang of dunne transparante oppervlak met een verruimde renal bekken. Een voorbeeld opgezwollen hydronephrotic nier en een abnormaal verwijde hydroureter zijn afgebeeld in figuur 2A. Een verwijde hydroureter resulteert meestal in een veel sterkere visualisatie omdat haar uitgebreide volumes veel meer kleurstof oplossing dan een normale, dunne urineleider behoudt. Als de nieren en/of de urineleiders zijn beschadigd tijdens de dissectie, is het onderzoek van de urinewegen junction obstakels onmogelijk omdat de kleurstof aberrantly op de aangetaste locatie uitlekken zal. Bijvoorbeeld, de abnormale hydroureter in figuur 2A werd beschadigd in haar midden, daarom het definitieve standpunt van de kleurstof oplossing is onduidelijk en UVJO kan niet worden geverifieerd ondanks het ontbreken van de kleurstof in de blaas lumen (figuur 2A). Deze perinatale urinewegen met verwijde hydroureter en opgezwollen hydronephrotic nier kan echter UVJO hebben, zoals de ureter is verbreed langs de lengte en de nier is duidelijk opgezwollen. De contralaterale urinewegen verschijnt normaal als er een dunne urineleider en de kleurstof vervolgens de blaas lumen (figuur 2B komt).
Figuur 1. Voorbeelden van methyleenblauw kleurstof injectie in een normale urine-systeem. (A) een typisch beeld van de urinewegen van een perinatale embryo (E19.5) na het verwijderen van overtollige weefsel. Twee nieren, twee urineleiders en een blaas worden gezien met de voortplantingsorganen, hier teelballen (B) een voorbeeld van kleurstof injectie in een normale nier. De punt van een injectie in de renal bekken van de nier (zwarte pijl) kan worden gezien. Een zwakke afdrukkleur is zichtbaar in de urineleider of de blaas lumen na het toestaan van de kleurstof te stromen voor 5 s. (C) kleurstof accumulatie in het lumen van de blaas na injectie van beide normale nieren. De kleur wordt sterk van de accumulatie van de oplossing van de kleurstof in het lumen van de blaas na het toestaan van de kleurstof te stromen voor 20 s. Het bekken renal is ook zichtbaar met de kleur van de zwakke kleurstof in de nier. B: blaas K: nier, T: testis, U: urineleider. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Voorbeelden van methyleenblauw kleurstof injectie in een urine-systeem met eenzijdige hydroureter. (A) een voorbeeld van kleurstof injectie in een urine-systeem met een hydroureter en een hydronephrotic nier van een neonatale vrouwelijke pup met kleurstof stroom van 15 s. De nier van hydronephrotic is duidelijk groter dan de contralaterale nier. De overeenkomstige urineleider is uitgezet en de afdrukkleur sterk herkenbaar is, maar de hydroureter is duidelijk beschadigd zoals waargenomen door het opborrelen van kleurstof oplossing in de lichaamsholte. (B) injectie van de kleurstof in de contralaterale nier van een urine-systeem met eenzijdige hydroureter met kleurstof stroom van 20 s. Injected kleurstof oplossing in de normale nier hoopt zich op in de blaas lumen bevestigen dat de abnormaliteit eenzijdig is. B: blaas, HK: hydronephrotic nier, HU: hydroureter K: nier, U: urineleider, Ut: baarmoeder hoorn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Muis nieren zijn functionele begin op E16.5 en een kleurstof injectie test is theoretisch mogelijk vanaf dit punt van tijd. De nier is te klein om te worden geïnjecteerd met de kleurstof oplossing echter en fenotypen zoals hydronephrosis en hydroureter niet duidelijk worden nageleefd omdat deze fenotypen een neveneffect van urine opgebouwd als gevolg van abnormale urine vervoer zijn. Deze fenotypen, van de obstakels zoals UPJO of UVJO, zijn duidelijk op E18.5 door opgezwollen nieren en urineleiders. Grotere nieren van embryo's bij E19.5 of neonatale pups zijn makkelijker te manipuleren zijn dan die van de embryo's op E18.5 of jonger. Pups echter met bilaterale urinewegen obstakels sterven na de geboorte. Daarom voeren experimenten om te CAKUT fenotypen valideren door op de juiste manier kiezen perinatale embryo's of pups afhankelijk van experimentele muis kenmerken.
Ontleden zorgvuldig te handhaven een intact urine-systeem voordat u uitvoert kleurstof injectie te onderzoeken van mogelijke gebreken. Dit is van essentieel belang zijn voor de abnormale hydronephrotic nieren en de urineleiders, die zeer opgezwollen en gemakkelijk beschadigd tijdens het verwijderen van extra weefsel bloot van de nieren en de urinewegen. Deze organen beschadigen tijdens dissectie, zal een volledige bepaling van echte gebreken voorkomen. Bijvoorbeeld afbeelding 2 ziet u verschillende verwijding van een urineleider, maar de lekkage van de kleurstof niet te tonen van de terminal punt van de distale hydroureter.
Altijd moet verwijderen van luchtbellen uit de slang en de naald vóór injectie, als deze bellen juiste kleurstof stroom blokkeert. Na succesvolle dissectie is de kritische stap te onderzoeken van de urinewegen verstopping inbrengen van de naald-tip in het bekken renal. Het inbrengen van de naald in de bovenste helft van de nier, in de buurt van de proximale urineleider, is handig om direct de tip van de naald in het bekken renal. De naald-tip erop naar de proximale ureter. Aangezien de renale bloedvaten bevinden zich in de buurt van de proximale urineleider, kan de kleurstof langs de renale bloedvaten loopt, tenzij de naald tip naar de proximale ureter wijst. In dit geval moet de naald tip in het bekken van de renal richting de proximale urineleider worden aangepast. Verder, de naald kan passeren de nier als ingevoegd te diep, waardoor de kleurstof te lekken uit de nier en in de lichaamsholte. Voorzichtig inbrengen van de naald-tip in het bekken van de renal en het toezicht op het uiteinde van de naald in het bekken renal kan helpen met het vermijden van deze mislukking. Soms, zal de naald worden geblokkeerd door nierweefsel tijdens injectie als deze niet in het bekken renal wordt ingevoegd. In dit geval verwijderen van het weefsel van de naald, resetten kleurstof stroom door de hydrostatische druk opnieuw op te starten en het uiteinde van de naald naar het bekken renal omleiden. Daarnaast fenotypen gekoppeld CAKUT mogelijk unilaterale of bilaterale. Er dus voor zorgen dat de injectie voor links en rechts urine systemen afzonderlijk wordt uitgevoerd. Optimaal, voeren eerst de injectie met een duidelijk abnormale nier om te verifiëren of UVJO eenzijdig is.
Afbeelding direct na de injectie test aangezien de kleurstof uit de renal bekken via de urineleider gaat snel voorbij. Het is moeilijk om te zien de kleur tijdens de beeldvorming van een normale urineleider omdat een normale urineleider een dunne buis is, hoewel kleurstof stroom onder de ontleden Microscoop kan worden gecontroleerd. Als een alternatief voor methyleenblauw, 1% snel groen in 1 x PBS kan ook worden gebruikt en weergegeven als een donkergroen-9. Naast kleurstof injectie, histologisch secties van de nieren en de urineleiders na H & E kleuring zal bevestigen de gebreken binnen de nieren en de urineleiders. Beeldvorming van de secties met een specifieke verslaggever van urineleider is ook een extra manier om te bevestigen UVJO7. Echter deze secties moet intact en seriële segmenteren is noodzakelijk om te voorkomen dat valse positieven. Vergeleken met traditionele sectie gebaseerde analyses van urine systemen, is deze kleurstof injectie-protocol een instant manier om het observeren van de integriteit van de nier en urineleider octrooi en te visualiseren obstakels zoals UPJO of UVJO.
Dit protocol biedt een eenvoudige en ongecompliceerde methode toquickly visualiseren urinewegen structuur in de late fase muis ontwikkeling, waardoor de analyse van de ontwikkeling van de urinewegen. De hier beschreven methode kan worden gebruikt ter beoordeling van de mutaties die leiden tot ontwikkelingsstoornissen urinewegen gebreken, als een middel om veranderingen in urinewegen rijping of urineleider ontwikkeling te identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft niets te onthullen.
Acknowledgments
Dank u Dr. Alan O. Perantoni (CDBL/NCI/NIH) voor de ondersteuning van de indiening van dit manuscript. Ik dank ook Dr. Michael Hall (CDBL/NCI/NIH) en Nirmala Sharma (CDBL/NCI/NIH) voor het bewerken van dit manuscript. Ik ben dankbaar aan Lai Thang (SAIC) voor zijn uitstekende muis veehouderij. Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health, National Cancer Institute en het Center for Cancer Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML | Fisherscientific | 50-983-204 | |
| 3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip | BD | 309657 | |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall corporation | 4614 | |
| Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12" | EXELINT | 26709 | |
| Delicate Operating Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6702 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5135 | |
| Dumont Tweezers; Pattern #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2" | BD | 305106 |
References
- Rasouly, H. M., Lu, W. Lower urinary tract development and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 307-342 (2013).
- Kispert, A. T-Box Genes in the Kidney and Urinary Tract. Curr Top Dev Biol. 122, 245-278 (2017).
- Bohnenpoll, T., Kispert, A. Ureter growth and differentiation. Semin Cell Dev Biol. 36, 21-30 (2014).
- Nicolaou, N., Renkema, K. Y., Bongers, E. M., Giles, R. H., Knoers, N. V. Genetic, environmental, and epigenetic factors involved in CAKUT. Nat Rev Nephrol. 11, 720-731 (2015).
- Tripathi, P., Wang, Y., Casey, A. M., Chen, F. Absence of canonical Smad signaling in ureteral and bladder mesenchyme causes ureteropelvic junction obstruction. J Am Soc Nephrol. 23, 618-628 (2012).
- Aoki, Y., et al. Id2 haploinsufficiency in mice leads to congenital hydronephrosis resembling that in humans. Genes Cells. 9, 1287-1296 (2004).
- Yun, K., Perantoni, A. O. Hydronephrosis in the Wnt5a-ablated kidney is caused by an abnormal ureter-bladder connection. Differentiation. 94, 1-7 (2017).
- Uetani, N., Bouchard, M. Plumbing in the embryo: developmental defects of the urinary tracts. Clin Genet. 75, 307-317 (2009).
- Murawski, I. J., Watt, C. L., Gupta, I. R. Assessing urinary tract defects in mice: methods to detect the presence of vesicoureteric reflux and urinary tract obstruction. Methods Mol Biol. 886, 351-362 (2012).
- Weiss, A. C., et al. Nephric duct insertion requires EphA4/EphA7 signaling from the pericloacal mesenchyme. Development. 141, 3420-3430 (2014).
