Summary
Methylene blåfarge fargestoff injeksjon i nyresvikt bekkenet forenkler vurdering av urinveisinfeksjon krysset obstruksjon feil under mus embryonale urinveisinfeksjon utvikling. Her, er en protokoll som methylene blåfarge fargestoff injeksjon i nyresvikt bekkenet beskrevet.
Abstract
Urinveisinfeksjon krysset obstruksjon mangler er medfødte misdannelser inducing hydronephrosis og hydroureter. Murine urinveisinfeksjon krysset obstruksjon defekter kan vurderes ved å spore methylene blåfarge fargestoff flyte i urin-systemet. Methylene blåfarge fargestoff injiseres inn nyresvikt bekkenet av perinatal embryonale nyrer og fargestoff flyt overvåkes fra nedsatt bekkenet av nyret gjennom ureter og i blæren lumen etter anvender hydrostatisk trykk. Fargestoff akkumulering blir tydelig i blæren lumen i normal perinatal urin-område, men vil være begrenset mellom nyresvikt bekkenet og endepunktet for en unormal ureter, hvis urinveisinfeksjon hindringer oppstår. Denne metoden muliggjør bekreftelse av urinveisinfeksjon krysset hindringer og visualisering av hydronephrosis og hydroureter. Dette manuskriptet beskriver en protokoll som methylene blåfarge fargestoff injeksjon i nyresvikt bekkenet å bekrefte urinveisinfeksjon krysset hindringer.
Introduction
Urin-systemet består av to nyrene og urinlederne og en felles blære og urinrøret. Hovedfunksjonen med urin systemet er å opprettholde kroppen homeostase ved å administrere den vann og elektrolytt balansen av blod. Nyrene filtrere blodet til kontroll elektrolytt konsentrasjon og syre-base balansen og produsere urin å skille ut overskytende vann og avfall inkludert solutes og metabolitter. Urin blir deretter transportert gjennom ureter fra nedsatt bekkenet av nyrene å bladderin en enveis måte der den lagres og til slutt eliminert via urinrøret1.
Urinlederne er rett rør fra nephric kanalen. Etter spirende fra nephric kanalen på embryonale dag 10.5 (E10.5) i musen, ureter stilken elongates og skiller i et flerlags struktur kalt urothelium som er UGJENNOMTRENGELIG mellom mus E12.5 og E16.5. Mesenchymal cellene rundt ureter stilken også skilles i tre lag bestående av indre stromal celler, middels tykk glatt muskelceller og ytre adventitial fibroblaster. Ureteral peristaltiske bølger starter i nyresvikt bekkenet er overført gjennom den glatte muskulatur laget av ureter veggen blæren å transportere urin2,3, som er produsert fra E16.5 i musen1.
Medfødte misdannelser av nyre og urinveiene (CAKUT) er blant de vanligste genetiske sykdommene, i rundt 1% av menneskelig fostre1,4, og består av en rekke fenotyper inkludert hydronephrosis og hydroureter. Unormal akkumulering av urin i nyrene og ureter resulterer i hydronephrotic nyre og hydroureter dannelsen. En årsak hydronephrosis og/eller hydroureter-formasjonen er en hindring i urin-område. Ureteropelvic junction hindring (UPJO) er forårsaket av avvikende urin flyt på grunn av en blokkering mellom proksimale ureter og nyresvikt pelvis, hydronephrosis og proksimale hydroureter innsnevring med angulation eller vedvarende folding5, 6. I tillegg kalles ektopisk innsetting av distale ureter blæren veggen eller skjede ureterovesical junction hindring (UVJO). UVJO kan også føre til hydronephrosis og hydromegaureter formasjon7,8. En ekstra ureterovesical krysset (UVJ) feil er vesicoureteric reflux (VUR). VUR er preget av retrograd urin flyt fra blæren mot nyre på UVJ. Sammenlignet med UVJO, viser perinatal embryo med VUR tydelig ikke en distended hydronephrotic nyre eller alvorlig hydroureter fenotypen9.
I laboratoriet mus, kan urin flyt undersøkes ved injeksjon av en farge, som methylene blåfarge, i nyresvikt bekkenet9. Injectedmethylene blå løsningen vil spore urin banen fra nedsatt bekkenet gjennom ureter og i blæren. Hydronephrosis kan bli gjenkjent av en utvidelse av fargestoff i nyrene. UPJO kan bli oppdaget som en blokkering av fargestoff flyt på proksimale ureter med distended nyresvikt bekkenet5. En utvidelse av ureter angitt av utvidet diameter viser et eksempel på hydroureter. Endelig fargestoff akkumulering i blæren veggen eller på stedet av skjede indikerer UVJO med distended hydronephrotic nyre og utvidede hydromegaureter7,10. For å oppdage VUR, løsningen fargestoff injiseres i blæren og påfølgende retrograd flyt overvåkes i nyre9.
Her vises en protokoll som methylene blåfarge fargestoff injeksjon i nyresvikt bekkenet på en perinatal fosteret. Denne protokollen tillater sporing av urin flyt fra nedsatt bekkenet gjennom ureter og i blæren og kontrollerer potensielle urinveisinfeksjon krysset hindringer som UPJO eller UVJO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
mus (Wnt5a flox / flox mus (Wnt5a tm1.1Tpy) og Dll1Cre linje, UVJO musemodell) 7 var forvaltes i henhold til NIH retningslinjer og bruk av forsøksdyr og studerte under en protokoll godkjent av NCI-Frederick Animal Care og bruk komiteen.
1. forberedelse av Methylene blåfarge fargestoff løsning
- måle 0,1 g methylene blåfarge pulver.
- Oppløse methylene blåfarge i 10 mL vanlig saltvann eller 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) helt av vortexing.
- Filtrerer 10 mg/mL methylene blåfarge løsningen med en sprøyte filter (membran porestørrelse 0.45µm) å eliminere tilstopping under injeksjon.
- Sette en steril hodebunnen vene sett (27GX3/4 ″) med 3 mL disponibel sprøyte og fyll sprøyten med 3 mL filtrert methylene blåfarge løsning.
Merk: For å forhindre hydrostatisk trykk og påfølgende fargestoff flyt, plassere p over sprøyten fylt med methylene blåfarge løsning.
2. Disseksjon av Prenatal embryo
- ren dissekere saks og tang med 70% etanol.
- Samle perinatal embryoer på E18.5 eller E19.5, euthanize gravid mus først bruker CO 2 innånding og deretter utføre cervical forvridning i henhold til NIH retningslinjer.
Merk: Gravid kvinne musen føder vanligvis starter på E18.5, men større nyrer er enklere å manipulere. Nyrene på E19.5 nærmere til fødsel er derfor enklere å utføre denne analysen på. Imidlertid pups med bilaterale urinveisinfeksjon hindringer dø etter fødselen. Avhengig av egenskapene til eksperimentelle mus, en passende samling dag/tid bør empirisk bestemmes. - Spray 70% etanol på ventral abdominal overflaten og deretter åpne bukhulen ventrally bruker dissecting saks og tang.
- Løfte hele livmoren og skiller den fra kroppen ved å kutte med dissekere saks på tuppen av livmor hornene.
- Skyll hele livmoren med 1 x PBS i en Petriskål.
- Skjær livmor segmentally med dissekere saks og fjern placental decidua med dissekere tang for å vise embryoene i eggeplomme sacs.
- Først fjerne plommesekken og fjern amniotic membranen med dissekere tang for å frigjøre de perinatal embryoene.
- Halshugge et embryo med dissekere saks. Tørk av overflødig blod med sterilt gasbind pads. Feste embryoet med ventrale overflaten opp på dissecting mikroskop utstyrt med et digitalt kamera for bildebehandling. Samle halen for genotyperingteknologi eventuelt.
Merk: Utføre injeksjoner en embryoet gangen. - Nøye åpne bukhulen av et embryo med tang ved rive huden. Deretter forsiktig fjerne overflødig organer og vev som leveren, magen og tarmen med tang klippe dem eller trekke dem for å avsløre nyrene, urinlederne og blæren som er plassert på ryggen ( figur 1A). Absorberer overflødig blod fra dissekert embryoet med sterilt gasbind pads eventuelt.
Merk: Overskytende blod forstyrrer identifikasjon av nedsatt bekkenet injeksjonsvæske fargestoff.
3. Injeksjon av Methylene blåfarge fargestoff i nyresvikt bekkenet og overvåking fargestoff Flow
- Fjern bobler i nålen og rør av utvise methylene blåfarge løsning fra pinne-spissen av hydrostatisk trykk. Løft sprøyten som inneholder fargestoff løsningen over nivået på pinne-spissen starte flyt, og senk sprøyten stoppe flyten.
- Inn nyresvikt bekken nær proksimale ureter, ta vare ikke for å forstyrre det når plassert nålen. Utføre fargestoff injeksjon i en nyre til å bestemme sin urinveisinfeksjon obstruksjon.
Merk: Utføre fargestoff injeksjon i noen unormal nyre 7 første ved å følge samme måte å bestemme dens urinveisinfeksjon obstruksjon. - Løft sprøyten opp ca 20 cm hydrostatisk trykk og la 15 µL - 60 µL av fargestoff løsning. Infusjonshastigheten vil bli ca 3 µL/s Hvis sprøyten er hevet til denne høyden ovenfor fosteret.
- Overvåke blått fargestoff begynner første i nyresvikt bekkenet, så lengden på ureter, og til slutt i blæren lumen.
Merk: Det tar ca 5 s se en svak fargestoff farge dukker opp i blæren lumen hvis ureter er riktig satt inn i blæren. Tillate fargestoff å samle på de blokkerte området 15 s Hvis ingen fargestoff fargen vises i blæren lumen. - Legg sprøyten til stopp fargestoff flyt og fjerne nålen fra nyrene.
- Ta bilder av nyre, ureter og blæren spores med fargestoff løsning bruker kameraet og tenkelig program koblet til en stereomicroscope.
- Foreta en registrering av hydronephrosis av nyrene, hydroureter og den endelige plasseringen av fargestoff løsningen i en lab notatboken.
- Utføre injeksjon av kontralateral nyre som beskrevet i delene 3.1) til 3.5) og tillate fargestoff ca 20 s totalt.
Merk: Blæren lumen fylles med fargestoff løsning, angitt av en kraftig blå farge, hvis ureter er riktig satt inn i blæren lumen. Etter vurdering av urinveisinfeksjon krysset obstruksjon, urinlederne og blære kan være fast for snitting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nyrene og lavere urinveiene ligger dorsal til de fleste andre indre organer som leveren og tarmen. Etter fjerner disse andre indre organer, et par av nyrene, urinlederne og en enkelt blæren er synlig (figur 1A). Etter vellykket disseksjon, vil fargestoff injiseres nyresvikt bekkenet flyte fra nyre i blæren via ureter. Nyresvikt bekkenet er trakt-liknende strekte proksimale del av ureter i nyrene. Derfor er fargestoff injeksjon punktet nær synlig proksimale ureter knyttet nyre som indikert med svarte piler (figur 1B-1 C). Etter injeksjon methylene blåfarge fargestoff løsning i en nyre, fargestoff renner fra nedsatt bekkenet gjennom ureter og i blæren resulterer i synlige blått i ureter og blære lumen, hvis urinveisinfeksjon hindringer ikke finnes (figur 1B ). Fargestoff løsningen forsvinner vanligvis i en normal ureter raskt før bildebehandling og fargestoff fargen i ureter er svak fordi normalt ureter er en tynn slange. Imidlertid kan fargestoff flyt i ureter observeres med dissecting mikroskop. Sterk blått i blæren lumen vises som et resultat av en lengre flyt av ca 20 s totalt etter injeksjon av både nyrene med fargestoff løsning (figur 1 c). Fargestoff akkumulering i blæren etter kontralateral injeksjon angir at andre urin-systemet ikke har urinveisinfeksjon krysset renseprosessen.
Det er rimelig å injisere en åpenbart unormal nyre først for å bekrefte eventuelle urinveisinfeksjon krysset hindringer. Unormal hydronephrotic nyrene kan bli gjenkjent av deres større størrelse eller tynn gjennomsiktig overflate med en utvidet nyresvikt bekkenet. Et eksempel distended hydronephrotic nyre og en unormalt utvidede hydroureter er avbildet i figur 2A. En utvidet hydroureter resulterer vanligvis i en mye sterkere effekt fordi dens utvidet volum beholder mye mer fargestoff løsning enn en normal, tynne ureter. Hvis nyrene og/eller urinlederne er skadet under disseksjon, er undersøkelse av urinveisinfeksjon krysset hindringer umulig fordi fargestoff vil lekke ut aberrantly på skadet område. For eksempel den unormale hydroureter i figur 2A ble skadet i midten, og derfor den endelige plasseringen av fargestoff løsningen er uklart og UVJO kan ikke bekreftes til tross for fravær av fargestoff i blæren lumen (figur 2A). Men kan denne perinatal urinveiene med utvidede hydroureter og distended hydronephrotic nyre ha UVJO som ureter er utvidet langs dens lengde og nyre er tydelig distended. Den kontralateral urinveiene vises normalt som den har en tynn ureter og fargestoff deretter inn blæren lumen (figur 2B).
Figur 1. Eksempler på methylene blåfarge fargestoff injeksjon i en normal urinveiene. (A) et typisk bilde av urin-systemet fra en perinatal embryo (E19.5) etter fjerner overflødig vev. To nyrene, to urinlederne og en blære er sett med reproduktive organer, her testiklene (B) et eksempel på fargestoff injeksjon i en normal nyre. En injeksjon punkt i nyresvikt bekkenet av nyre (svart pil) kan sees. En svak fargestoff farge er synlig i ureter og blæren lumen etter tillater fargestoff å strømme for 5 s. (C) fargestoff akkumulering i blæren lumen etter injeksjon av både normale nyrer. Fargen blir sterk fra akkumulering av fargestoff løsningen i blæren lumen etter tillater fargestoff å strømme for 20 s. Nyresvikt bekkenet er også synlig med svak farge farge i nyrene. B: blæren, K: nyre, T: testikkel, U: ureter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Eksempler på methylene blåfarge fargestoff injeksjon i en urin system med ensidige hydroureter. (A) et eksempel på fargestoff injeksjon i en urin system med en hydroureter og en hydronephrotic nyre av en neonatal kvinnelige pup med fargestoff flyt av 15 s. Hydronephrotic nyre er klart større enn kontralateral nyrene. Tilsvarende ureter dilated og fargestoff fargen er sterkt gjenkjennelig, men hydroureter er åpenbart skadet som observert av lekker fargestoff løsning i kroppens hulrom. (B) fargestoff injeksjon i kontralateral nyre av en urin system med ensidig hydroureter med fargestoff flyt av 20 s. injisert fargestoff løsning i normal nyre akkumuleres i blæren lumen bekrefter at abnormiteten er ensidig. B: blæren, HK: hydronephrotic nyre, HU: hydroureter K: nyre, U: ureter, Ut: livmor horn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Musen nyrer er funksjonell begynnelsen på E16.5 og en dye injeksjon test er teoretisk mulig fra dette tidspunkt. Men nyre er for liten til å være injisert med fargestoff løsningen og fenotyper som hydronephrosis og hydroureter er ikke klart observert siden disse fenotyper er en sekundær virkning av urin bygget opp på grunn av unormal urin transport. Disse fenotyper, fra hindringer som UPJO eller UVJO, er tydelig på E18.5 av distended nyrene og urinlederne. Større nyrene embryoer på E19.5 eller neonatal pups er enklere å manipulere enn embryoer på E18.5 eller yngre. Imidlertid pups med bilaterale urinveisinfeksjon hindringer dø etter fødselen. Derfor utføre eksperimenter for å validere CAKUT fenotyper ved å velge riktig perinatal embryo eller pups avhengig av eksperimentelle musen egenskaper.
Dissekere nøye for å opprettholde en intakt urinveiene før du utfører farge injeksjon for å undersøke defekter. Dette er egentlig viktig for unormal hydronephrotic nyrer og urinlederne, som er svært distended og lett skadet under fjerning av ekstra vev å avsløre nyrene og urin. Skade disse organene i disseksjon vil hindre en full fastsettelse av virkelig mangler. For eksempel figur 2 viser tydelig utvidelse av en ureter, men fargestoff lekkasje mislykkes å vise terminal poenget med den distale hydroureter.
Alltid være sikker å fjerne luftbobler fra slangen og nålen før injeksjon, idet disse boblene vil blokkere riktig fargestoff flyt. Etter vellykket disseksjon er det kritiske trinnet undersøke urinveisinfeksjon hindringen innsetting av pinne-spissen nyresvikt bekkenet. Innsetting av nålen i den øvre halvdelen av nyre, nær proksimale ureter, er nyttig å direkte pinne-spissen til nyresvikt bekkenet. Pinne-spissen skal peke mot proksimale ureter. Siden nyre blodkar ligger nær proksimale ureter, kan fargestoff flyte langs nyre blodkar med mindre pinne-spissen peker mot proksimale ureter. I dette tilfellet bør pinne-spissen justeres i nyresvikt bekkenet mot proksimale ureter. Videre kan nålen passere gjennom nyrene Hvis satt for dyp, forårsaker fargestoff å lekke ut av nyrene og i kroppens hulrom. Forsiktig innsetting av pinne-spissen nyresvikt bekkenet og overvåking pinne-spissen i nyresvikt bekkenet å unngå denne feilen. Noen ganger vil nålen bli blokkert av nyre vev under injeksjon hvis det ikke er satt inn i nyresvikt bekkenet. I dette tilfellet fjerner vev fra nålen, Tilbakestill fargestoff flyt ved å starte hydrostatisk trykk og omdirigere pinne-spissen mot nyresvikt bekkenet. I tillegg kan fenotyper knyttet CAKUT være unilateral eller bilaterale. Derfor sikre at injeksjon fremført separat for venstre og høyre urin-systemer. Optimalt, utføre injeksjon først med en åpenbart unormal nyre kontrollere om UVJO er ensidig.
Bildet umiddelbart etter injeksjon testen siden fargestoff går fra nedsatt bekkenet gjennom ureter fort. Det er vanskelig å se fargen under imaging av en normal ureter fordi en normal ureter er en tynn slange, selv om fargestoff flyt kan overvåkes under dissecting mikroskop. Som et alternativ methylene blåfarge, 1% rask grønn i 1 x PBS kan også brukes og vises som en mørkegrønne fargen9. I tillegg til fargestoff injeksjon, histologiske delene av nyrene og urinlederne etter H & E flekker vil bekrefte defekter i nyrene og urinlederne. Også er bildebehandling deler med ureter bestemt reporter en ekstra måte å bekrefte UVJO7. Men disse delene bør være intakt og føljetong snitting er nødvendig for å unngå falske positiver. Sammenlignet med tradisjonelle delen-baserte analyser av urin-systemer, er denne fargestoff injeksjon protokollen en umiddelbar måte å observere integriteten til nyrene og patent ureter og visualisere hindringer som UPJO eller UVJO.
Denne protokollen gir en enkel og grei metode toquickly visualisere urinveisinfeksjon strukturen i sent stadium musen utvikling, som tillater analyse av urinveisinfeksjon utvikling. Metoden beskrevet her kan brukes til å vurdere mutasjoner som forårsaker utviklingsmessige urinveisinfeksjon defekter, som en måte å identifisere endringer i urin skrift modning eller ureter utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Jeg takker Dr. Alan O. Perantoni (CDBL/NCI/NIH) for å støtte innlevering av dette manuskriptet. Jeg takker også Dr. Michael Hall (CDBL/NCI/NIH) og Nirmala Sharma (CDBL/NCI/NIH) for redigering dette manuskriptet. Jeg er takknemlig til Lai Thang (SAIC) for sin utmerkede musen dyrehold. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health National Cancer Institute og Center for Cancer Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML | Fisherscientific | 50-983-204 | |
| 3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip | BD | 309657 | |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall corporation | 4614 | |
| Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12" | EXELINT | 26709 | |
| Delicate Operating Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6702 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5135 | |
| Dumont Tweezers; Pattern #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2" | BD | 305106 |
References
- Rasouly, H. M., Lu, W. Lower urinary tract development and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 307-342 (2013).
- Kispert, A. T-Box Genes in the Kidney and Urinary Tract. Curr Top Dev Biol. 122, 245-278 (2017).
- Bohnenpoll, T., Kispert, A. Ureter growth and differentiation. Semin Cell Dev Biol. 36, 21-30 (2014).
- Nicolaou, N., Renkema, K. Y., Bongers, E. M., Giles, R. H., Knoers, N. V. Genetic, environmental, and epigenetic factors involved in CAKUT. Nat Rev Nephrol. 11, 720-731 (2015).
- Tripathi, P., Wang, Y., Casey, A. M., Chen, F. Absence of canonical Smad signaling in ureteral and bladder mesenchyme causes ureteropelvic junction obstruction. J Am Soc Nephrol. 23, 618-628 (2012).
- Aoki, Y., et al. Id2 haploinsufficiency in mice leads to congenital hydronephrosis resembling that in humans. Genes Cells. 9, 1287-1296 (2004).
- Yun, K., Perantoni, A. O. Hydronephrosis in the Wnt5a-ablated kidney is caused by an abnormal ureter-bladder connection. Differentiation. 94, 1-7 (2017).
- Uetani, N., Bouchard, M. Plumbing in the embryo: developmental defects of the urinary tracts. Clin Genet. 75, 307-317 (2009).
- Murawski, I. J., Watt, C. L., Gupta, I. R. Assessing urinary tract defects in mice: methods to detect the presence of vesicoureteric reflux and urinary tract obstruction. Methods Mol Biol. 886, 351-362 (2012).
- Weiss, A. C., et al. Nephric duct insertion requires EphA4/EphA7 signaling from the pericloacal mesenchyme. Development. 141, 3420-3430 (2014).
