Summary
Injeção de corante azul de metileno em pelve renal facilita a avaliação de defeitos de obstrução do trato urinário junção durante o desenvolvimento embrionário do trato urinário de rato. Aqui, um protocolo para injeção de corante azul de metileno na pelve renal é descrito.
Abstract
Defeitos de obstrução do trato urinário junção são anomalias congênitas induzindo hidronefrose e hidroureter. Defeitos de obstrução urinária murino junção podem ser avaliados pelo controle de fluxo do corante azul de metileno dentro do sistema urinário. Corante azul de metileno é injetado em pelve renal dos rins embrionários perinatais e fluxo do corante é monitorado da pelve renal do rim através do ureter e para dentro do lúmen da bexiga após a aplicação de pressão hidrostática. Acumulação de tintura será evidente no lúmen do tracto urinário perinatal normal da bexiga, mas vai ser restrita entre a pelve renal e o ponto final de um ureter anormal, se ocorrerem obstruções do trato urinário. Esse método facilita a visualização de hidronefrose e hidroureter e a confirmação da obstrução de junção do trato urinário. Este manuscrito descreve um protocolo para injeção de corante azul de metileno na pelve renal para confirmar obstruções de junção do trato urinário.
Introduction
O sistema urinário consiste de um par de rins e ureteres e um comum da bexiga e uretra. A principal função do sistema urinário é manter a homeostase do corpo gerindo o equilíbrio de água e eletrólitos do sangue. Os rins filtram o sangue para controle concentrações de eletrólitos e equilíbrio ácido-base e produzem urina para excretar o excesso de água e resíduos, incluindo solutos e metabólitos. Urina é então transportada através do ureter da pelve renal do rim para o bladderin de uma maneira unidirecional, onde é armazenado e, finalmente, eliminada através da uretra1.
Os ureteres são tubos retos, proveniente do ducto nephric. Após a brotação do ducto nephric em dia embrionário 10.5 (E10.5) no mouse, o caule do uréter alonga e diferencia em uma estrutura de várias camada chamada Urotélio, que é impermeável entre rato, E12.5 e E16.5. As células mesenquimais em torno do caule de ureter também são diferenciadas em três camadas consistindo de células do estroma internas, células de músculo liso grosso e intermediário e fibroblastos adventícia exteriores. Ondas peristálticas ureterais iniciando na pelve renal são propagadas através da camada de músculo liso da parede da uretra à bexiga para transportar urina2,3, que é produzido começando em E16.5 no rato1.
Anomalias congênitas do rim e trato urinário (CAKUT) estão entre as mais frequentes doenças genéticas, presentes em cerca de 1% dos fetos humanos1,4e composto por uma variedade de fenótipos incluindo hidronefrose e hidroureter. O acúmulo anormal de urina nos resultados da rim e do ureter no rim e hidroureter formação de hydronephrotic. Uma das causas da formação de hidronefrose e/ou hidroureter é uma obstrução do tracto urinário. Obstrução de junção de ureteric (UPJO) é causada pelo fluxo de urina aberrante, devido a um bloqueio entre o ureter proximal e a pelve renal, resultando em hidronefrose e hidroureter proximal estreitando com angulação ou dobramento persistente5, 6. Além disso, a inserção ectópica do ureter distal na parede da bexiga ou do trato reprodutivo é chamada ureter obstrução de junção (UVJO). UVJO também pode induzir a hidronefrose e hydromegaureter formação7,8. Defeito de junção (como) um ureter adicional é refluxo vesicoureteral (RVU). VUR é caracterizada pelo fluxo retrógrado de urina da bexiga para o rim em como. Em comparação com UVJO, perinatais embriões com RVU não distintamente mostra um rim distendido hydronephrotic ou grave hidroureter fenótipo9.
No rato de laboratório, o fluxo de urina pode ser examinado por injeção de um corante, tais como o azul de metileno, para a pelve renal9. A solução de azul de injectedmethylene irá traçar a trajetória de urina da pelve renal, através da uretra e na bexiga. Hidronefrose pode ser reconhecido por uma expansão do corante no rim. UPJO pode ser detectado como uma obstrução do fluxo do corante para o ureter proximal com distendido pelve renal5. Qualquer dilatação do ureter indicado por um diâmetro ampliado demonstra um exemplo de hidroureter. Finalmente, acúmulo de tinta na parede da bexiga ou no site do tracto reprodutivo indica UVJO com rim hydronephrotic distendido e dilatada hydromegaureter7,10. Para detectar o RVU, a solução corante é injectada na bexiga e subsequente fluxo retrógrado é monitorado na renal9.
Aqui, um protocolo para injeção de corante azul de metileno em pelve renal de um embrião perinatal é apresentado. Este protocolo permite o rastreamento do fluxo de urina da pelve renal, através da uretra e na bexiga e verifica possíveis obstruções de junção do trato urinário como UPJO ou UVJO.
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Protocol
ratos (Wnt5a flox / ratos flox (Wnt5a tm1.1Tpy) e Dll1Cre linha, modelo de mouse UVJO) 7 eram geridas de acordo com as diretrizes do NIH para o cuidado e o uso de animais de laboratório e estudado sob um protocolo aprovado pelo Comitê de uso e cuidado do Animal de NCI-Frederick.
1. preparação da solução de corante azul de metileno
- medir pó de azul de metileno 0,1 g.
- Dissolver o azul de metileno em solução salina normal de 10 mL ou 1 x salina tamponada fosfato (PBS) completamente vortexing.
- A 10 mg/mL solução de azul de metileno de filtragem com um filtro de seringa (tamanho dos poros da membrana 0.45µm) para eliminar a obstrução durante a injeção.
- Montar um escalpe estéril veia conjunto (27GX3/4 ″) com uma seringa descartável de 3 mL e encha a seringa com 3ml filtrado solução de azul de metileno.
Nota: Para evitar a pressão hidrostática e fluxo subsequente tintura, coloque a ponta da agulha acima a seringa preenchida com solução de azul de metileno.
2. Dissecação de pré-natal de embriões
- limpo, dissecando a tesoura e pinça com etanol a 70%.
- Para coletar embriões perinatais em E18.5 ou E19.5, eutanásia de ratos grávidas primeiro usando a inalação de CO 2 e então executar o deslocamento cervical de acordo com as diretrizes do NIH.
Nota: O rato fêmea grávido geralmente dá à luz partida no E18.5, no entanto, os rins maiores são mais fáceis de manipular. Portanto, os rins em E19.5 perto de nascimento são mais fáceis de realizar esta análise em. No entanto, filhotes com bilateral do trato urinário obstruções morre após o nascimento. Dependendo das características dos ratos experimentais, uma dia e hora de recolha deve ser determinada empiricamente. - Spray etanol a 70% na superfície ventral abdominal e então abrir a cavidade abdominal ventralmente usando dissecação tesoura e pinça.
- Levantar o útero inteiro e separá-lo do corpo cortando com tesoura nas pontas dos cornos uterinos de dissecação.
- Lavar o útero todo com PBS 1x em uma placa de Petri.
- Corte o útero desenvolve com tesoura de dissecação e retire da placenta decídua com dissecando o fórceps para expor os embriões em gema sacs.
- Primeiro remover o saco vitelino e remova a membrana amniótica com dissecando o fórceps para libertar os embriões perinatais.
- Decapitar um embrião com tesoura de dissecação. Limpe o excesso de sangue com gaze estéril. Levanta o embrião para baixo com sua superfície ventral na dissecação microscópio equipado com uma câmera digital para a imagem latente. Recolher a sua cauda para a genotipagem, se necessário.
Nota: Executar um embrião de injeções de cada vez. - Abra cuidadosamente a cavidade abdominal de um embrião com fórceps, rasgando a pele. Em seguida, remover cuidadosamente o excesso órgãos e tecidos como fígado, estômago e intestino com fórceps cortá-los ou puxá-los para fora para expor os rins, os ureteres e a bexiga, que está localizado dorsalmente ( figura 1A). Absorver o excesso de sangue do embrião dissecado com gaze estéril, se necessário.
Nota: Sangue excesso interfere com a identificação da pelve renal para a injeção do corante.
3. Injeção de corante azul de metileno na pelve Renal e monitorando o fluxo de tintura
- remover bolhas na agulha e tubulação, expulsando a solução de azul de metileno da ponta de agulha por pressão hidrostática. Levantar a seringa contendo a solução de tintura acima do nível da ponta da agulha para iniciar o fluxo e em seguida baixar a seringa para parar o fluxo.
- Insira a agulha na pelve renal perto do ureter proximal, tomando cuidado para não perturbá-lo depois de colocado. Realizar injeção de corante em um rim para determinar sua obstrução do tracto urinário.
Nota: Executar tingir a injeção em qualquer anormal do rim 7 primeiro, seguindo a mesma maneira para determinar sua obstrução do tracto urinário. - Levantar a seringa até cerca de 20 cm para fornecer a pressão hidrostática e deixe 15 µ l - 60 µ l do fluxo de solução corante. A taxa de fluxo será cerca de 3 µ l/s, se a seringa é gerada para esta altura acima do embrião.
- Monitor a cor azul do corante começando primeiro na pelve renal e, em seguida, no comprimento do ureter e finalmente no lúmen da bexiga.
Nota: Demora cerca de 5 s para ver uma cor de tintura fraca emergem dentro do lúmen da bexiga se o ureter está correctamente inserido na bexiga. Permitir que a tintura a acumular-se no site bloqueado cerca de 15 s se nenhuma cor corante aparece no lúmen da bexiga. - Coloque a seringa fluxo a tintura pare e retire a agulha do rim.
- Tomar imagens do rim, ureter e bexiga rastreados com solução corante usando a câmera e imagem programa conectem a um estereomicroscópio.
- Fazer um registro de hidronefrose do rim, hidroureter e a posição final da solução corante em um caderno de anotações.
- Realizar injeção do rim contralateral conforme descrito nas seções 3.1) para 3.5) e permitir o fluxo de tinta cerca de 20 s total.
Nota: O lúmen da bexiga será preenchido com solução corante, indicada por uma cor azul forte, se o ureter está correctamente inserido o lúmen da bexiga. Após a avaliação da obstrução de junção do tracto urinário, os ureteres e a bexiga podem ser corrigidos para secionar.
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Representative Results
Rins e sistema urinário inferior estão localizados dorsal à maioria dos outros órgãos internos como o fígado e intestino. Depois de remover esses outros órgãos internos, um par de rins e ureteres e bexiga única são visíveis (figura 1A). Após dissecação bem sucedida, o corante injetado em pelve renal fluirá do rim para a bexiga através da uretra. A pelve renal é a funil-como dilatada porção proximal do ureter no rim. Portanto, o ponto de injeção do corante é perto do ureter proximal visível conectado com o rim indicadas com setas pretas (figura 1B-1C). Após a injeção com solução de corante azul de metileno em um rim, o corante flui da pelve renal, através da uretra e na bexiga resultando em uma cor azul visível no lúmen do ureter e da bexiga, se não existirem obstruções do trato urinário (figura 1B ). A solução corante normalmente desaparece em um ureter normal rapidamente antes mesmo de imagem, e a cor de tintura no ureter é fraca porque o ureter normal é um tubo fino. No entanto, fluxo de corante no ureter pode ser observado com um microscópio de dissecação. Uma cor azul forte no lúmen da bexiga aparece como resultado de um fluxo de mais de cerca de 20 s total após a injeção de ambos os rins com a solução de corante (Figura 1). Acumulação de corante na bexiga após a injeção contralateral indica que o segundo sistema urinário não tem qualquer obstrução da junção do tracto urinário.
É razoável injetar um rim obviamente anormal primeiro para confirmar qualquer obstrução da junção do trato urinário. Hydronephrotic anormal rins podem ser reconhecidos pelo seu maior tamanho ou superfície transparente fina com uma ampliação pelve renal. Um rim distendido hydronephrotic de exemplo e um hidroureter anormalmente dilatado estão representados na Figura 2A. Uma dilatada hidroureter geralmente resulta em uma visualização muito mais forte, porque seu volume expandido retém a solução de corante muito mais do que um ureter normal, fina. Se os rins e/ou os ureteres estiverem danificados durante a dissecção, o exame das obstruções de junção do trato urinário é impossível porque o corante irá vazar aberrantly no local danificado. Por exemplo, a hidroureter anormal na Figura 2A foi danificado em seu meio e, portanto, desconhece-se a posição final da solução corante e UVJO não pode ser verificada, apesar da ausência do corante no lúmen da bexiga (Figura 2A). No entanto, este sistema urinário perinatal com dilatada hidroureter e rim hydronephrotic distendido pode ter UVJO como o ureter é ampliado ao longo de seu comprimento, e o rim é distintamente distendido. O sistema urinário contralateral aparece normal, pois tem um ureter fina e o corante entra posteriormente o lúmen da bexiga (Figura 2B).
Figura 1. Exemplos de injeção de corante azul de metileno em um sistema urinário normal. (A) uma imagem típica do sistema urinário de um embrião perinatal (E19.5) depois de retirar o excesso de tecido. Dois rins, dois ureteres e a bexiga são vistos com órgãos reprodutores, testículos aqui (B) um exemplo de injeção de tinta em um rim normal. Um ponto de injeção em pelve renal do rim (seta preta) pode ser visto. Uma cor de tintura fraca é visível no ureter e o lúmen da bexiga após permitindo que a tinta flua para 5 s. acumulação de tintura (C) no lúmen da bexiga após a injeção de ambos os rins normais. A cor se torna forte a partir da acumulação da solução corante no lúmen da bexiga após permitindo que a tinta flua por 20 s. A pelve renal é também visível com a cor de tintura fraca no rim. B: bexiga, rim k:, t: testículo, u: ureter. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Exemplos de azul de metileno tingem injeção em um aparelho urinário com unilateral hidroureter. (A) um exemplo de injeção de tinta em um aparelho urinário com um hidroureter e um rim de hydronephrotic de um filhote fêmea neonatal com fluxo de tintura de 15 s. O rim de hydronephrotic é claramente maior do que o rim contralateral. O ureter correspondente está dilatado e a cor da tintura é fortemente reconhecível mas a hidroureter claramente está danificado, como observado por vazando solução corante na cavidade do corpo. (B) injeção de corante no rim contralateral de um sistema urinário com hidroureter unilateral com fluxo de tintura de 20 s. solução de corante injetado para o rim normal acumula o lúmen da bexiga confirmando que a anormalidade é unilateral. B: bexiga, HK: rim hydronephrotic, HU: hidroureter k: rim, u: ureter, Ut: corno uterino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Rins de mouse são funcional início em E16.5 e um teste de injeção de corante é teoricamente possível deste ponto do tempo. No entanto, o rim é muito pequeno para ser injetado com a solução de corante e fenótipos como hidronefrose e hidroureter não são claramente observados desde que estes fenótipos são um efeito secundário da urina acumulada devido ao transporte de urina anormal. Estes fenótipos, desde as obstruções, como UPJO ou UVJO, são evidentes no E18.5 por distendido rins e ureteres. Maiores rins de embriões em E19.5 ou filhotes neonatais são mais fáceis de manipular do que aqueles de embriões no E18.5 ou mais jovens. No entanto, filhotes com bilateral do trato urinário obstruções morre após o nascimento. Portanto, realizar experimentos para validar fenótipos CAKUT escolhendo adequadamente perinatais embriões ou filhotes dependendo das características do rato experimental.
Disse cuidadosamente para manter um sistema urinário intacto antes de realizar injeção de corante para examinar possíveis defeitos. Isso é essencialmente importante para o anormal hydronephrotic rins e ureteres, que são muito distendido e facilmente danificadas durante a remoção do tecido extra para expor os rins e urinárias. Danificar estes órgãos durante a dissecção impedirá uma determinação cheia de defeitos reais. Por exemplo, a Figura 2 mostra a dilatação distinta de um ureter, mas o vazamento de tinta não consegue mostrar o ponto terminal da hidroureter distal.
Sempre certifique-se remover bolhas de ar da tubulação e a agulha antes da injeção, como essas bolhas irão bloquear o fluxo de tinta adequada. Após a dissecação, bem sucedida, o passo fundamental para examinar a obstrução do trato urinário é a inserção da ponta da agulha na pelve renal. A inserção da agulha na parte superior do rim, perto do ureter proximal, é útil para direcionar a ponta da agulha para a pelve renal. A ponta da agulha deve apontar para o ureter proximal. Desde que os vasos sanguíneos renais estão localizados perto do ureter proximal, a tintura pode fluir ao longo dos vasos sanguíneos renais, a menos que a ponta da agulha aponta para o ureter proximal. Neste caso, a ponta da agulha deve ser ajustada na pelve renal para o ureter proximal. Além disso, a agulha pode passar através do rim se inseridos muito fundo, fazendo com que o corante vazar o rim e na cavidade do corpo. Cuidado, inserção da ponta da agulha na pelve renal e acompanhamento a ponta da agulha na pelve renal pode ajudar a evitar essa falha. Às vezes, a agulha vai tornar-se bloqueado por tecido renal durante a injeção se ele não é inserido com a pelve renal. Neste caso, remova o tecido da agulha, redefinir o fluxo do corante reiniciando a pressão hidrostática e redirecionar a ponta da agulha em direção a pelve renal. Além disso, os fenótipos associados com CAKUT podem ser unilateral ou bilateral. Portanto, certifique-se que a injeção é realizada separadamente para esquerda e direita urinários sistemas. Forma otimizada, realizar a injeção primeiro com um rim obviamente anormal para verificar se o UVJO é unilateral.
Imagem imediatamente após o teste de injeção desde que o corante passa da pelve renal ureter rapidamente. É difícil ver a cor durante a imagem de um ureter normal porque um ureter normal é um tubo fino, embora o fluxo de tinta pode ser monitorado ao microscópio de dissecação. Como uma alternativa ao azul de metileno, 1% rápido verde em 1X PBS também pode ser usado e aparecerá como uma cor verde escura,9. Além de injeção de corante, cortes histológicos dos rins e ureteres seguindo H & E coloração confirmará os defeitos dentro dos rins e ureteres. Além disso, imagem de seções com um repórter específico do ureter é uma maneira adicional para confirmar UVJO7. No entanto, estas seções devem estar intactas e seccionamento serial é necessário para evitar falsos positivos. Comparado com as análises tradicionais baseados na seção dos sistemas urinários, este protocolo de injeção de tinta é uma forma instantânea para observar a integridade do rim e ureter patente e a visualização de obstruções, como UPJO ou UVJO.
Este protocolo fornece um simples e simples método toquickly Visualizar a estrutura do trato urinário em fase desenvolvimento atrasado do mouse, que permite a análise do desenvolvimento do trato urinário. O método descrito aqui pode ser usado para avaliar as mutações que causam defeitos no desenvolvimento do trato urinário, como um meio de identificar mudanças no desenvolvimento de maturação ou ureter do trato urinário.
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Disclosures
O autor não tem nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradeço o Dr. Alan O. Perantoni (CDBL/ICN/NIH) para apoiar a apresentação deste manuscrito. Agradeço também a Dr. Michael Hall (CDBL/ICN/NIH) e Nirmala Sharma (CDBL/ICN/NIH) para editar este manuscrito. Eu sou grato a Lai Thang (SAIC) para sua criação do mouse excelente. Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de saúde, Instituto Nacional de câncer e o centro para pesquisa do câncer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML | Fisherscientific | 50-983-204 | |
| 3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip | BD | 309657 | |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall corporation | 4614 | |
| Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12" | EXELINT | 26709 | |
| Delicate Operating Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6702 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5135 | |
| Dumont Tweezers; Pattern #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2" | BD | 305106 |
References
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