Summary
Aquí, presentamos el seguimiento en tiempo real de la migración de la célula en un ensayo de cicatrización utilizando células epiteliales de mama MCF10A TIP60-agotado. La aplicación de técnicas de imagen de células vivas en nuestro protocolo nos permite analizar y visualizar sola célula movimiento en tiempo real y a través del tiempo.
Abstract
La cicatrización es eficiente y una de las maneras más económicas para el estudio de la migración celular in vitro. Convencionalmente, se toman imágenes al principio y al final de un experimento usando un microscopio de contraste de fase, y se evalúan las capacidades de migración de las células por el cierre de heridas. Sin embargo, movimiento celular es un fenómeno dinámico, y un método convencional no permite rastrear movimiento unicelular. Para mejorar el actuales análisis de cicatrización, utilizamos técnicas de imágenes de células vivas para controlar la migración de la célula en tiempo real. Este método permite determinar la tasa de migración de la célula basada en una sistema de seguimiento de la célula y proporciona una distinción más clara entre la migración celular y proliferación celular. Aquí, se demuestra el uso de imágenes de células vivas en la cicatrización de ensayos para el estudio de las capacidades diferentes de la migración de células epiteliales de mama por la presencia de TIP60. Como la motilidad celular es altamente dinámica, nuestro método ofrece más ideas en los procesos de cicatrización que una instantánea del encierro de la herida con las tradicionales técnicas de imagen utilizadas para los ensayos de la cicatrización.
Introduction
Proteína VIH Tat interactivo 60 kDa (TIP60) es una lisina acetiltransferasa que puede acetylate histonas y proteínas no histonas1,2. Sus funciones se encuentran que tienen implicaciones en múltiples vías de señalización, incluyendo transcripción, reparación del daño de la DNA y apoptosis1,3,4,5,6, 7 , 8. Además, TIP60 es a menudo o en casos de cáncer y su regulación a la baja se correlaciona con la metástasis de cáncer y supervivencia pobre precios9,10,11,12, 13,14. Metástasis tumoral es la principal causa de muerte relacionada con cáncer. Es un proceso multi-step, y el paso inicial de la metástasis implica la migración y la invasión de células tumorales en los tejidos adyacentes15,16. Para ello, las células del tumor primero deben separar de la masa del tumor primario, ya sea en la forma de una hoja de células colectivamente invasores o como independiente de las células17. Durante este proceso, las células del tumor a menudo se someten a epitelial de transición mesenquimal (EMT), resultando en cambios en la morfología y la célula adherencia capacidad17,18.
Se han desarrollado algunas técnicas para estudiar la migración y capacidad de invasión del tumor de las células en vitro. Entre ellos, la cicatrización es más eficiente y económico19. En primer lugar, este método implica la creación de un espacio artificial en una monocapa confluente de células, lo que permite a las células migrar y cerrar la brecha. En segundo lugar, se pueden capturar imágenes de los espacios al principio y al final del experimento. Por último, una comparación de cierre de brecha se utiliza para determinar la tasa de migración de la célula. Un microscopio de contraste de fase se utiliza generalmente para capturar imágenes para los ensayos convencionales de cicatrización. Otra de las ventajas del ensayo de cicatrización es que en parte se asemeja en vivo la migración celular tumoral. Del mismo modo a metástasis de tumor en vivo , migración celular en la cicatrización de los ensayos muestra la migración colectiva de hojas epiteliales y la migración de las células individuales separadas.
Sin embargo, la migración celular es conocida por ser dinámico y es necesario documentar el movimiento de las células en tiempo real. Por ejemplo, un ensayo de cicatrización convencional no permite un investigador analizar sola célula movimiento. Por otro lado, las células cultivadas para los ensayos de cicatrización suelen ser sediento de suero para inhibir la proliferación celular. Esto se hace para descartar la posibilidad de cierre de la brecha debido a la proliferación celular. Sin embargo, todavía habrá algunos proliferación y muerte celular e imágenes de contraste de fase tomadas antes y después del experimento son incapaces de distinguir entre ellos.
La técnica de imágenes de células vivas dirige a esta limitación de ensayos convencionales de cicatrización. Utilizando un microscopio de proyección de imagen en vivo combinado con un incubador de CO2 y control de la temperatura adecuada, los investigadores pueden medir el tamaño de la brecha y su velocidad de cierre en el tiempo mientras que rastrear el movimiento de migración activa de células ubicadas en las puntas de los frente invasivo. Por lo tanto, la aplicación de células vivas para controlar la migración de células de la proyección de imagen no sólo proporcionará el mejor visualización de la migración de la célula, pero también permite la posibilidad de diferenciar entre la migración celular y proliferación celular, proporcionando así más Análisis fiable de la migración de la célula.
En este estudio, las células epiteliales de la mama MCF10A fueron utilizadas para demostrar la combinación de la cicatrización análisis y proyección de imagen para estudiar el papel de TIP60 en migración celular con células vivas. El agotamiento de los TIP60 resultados en habilidades de aumento de la migración de células MCF10A.
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Protocol
1. preparación
- Preparar medio de cultivo MCF10A: modificado Eagle Medium (DMEM de Dulbecco) F12 (1:1) con 5% caballo suero 20 ng/mL del factor de crecimiento epitelial, hidrocortisona 0.5 mg/mL, la toxina del cólera 100 ng/mL e insulina de 10 μg/mL.
- Preparar medio libre de suero: DMEM/F12 (1:1) con 20 ng/mL del factor de crecimiento epitelial, hidrocortisona 0.5 mg/mL, la toxina del cólera 100 ng/mL e insulina de 10 μg/mL.
- Utilice la siguiente secuencia de siRNA:
siControl:
Forward: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
Reverso: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
siTIP60:
Forward: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
Reverso: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3' - Utilice platos de cultivo celular de 10 cm y placas de 24 pocillos.
2. transitorio agotamiento del siRNA usando TIP60
- El día 1, alícuotas de 15 μl de reactivo de transfección (p. ej., Lipofectamine RNAiMAX) y 2 mL de reducción medio de suero (por ejemplo, Opti-MEM) y mezclan con 10 μl de cada siRNA (10 μm de valores), respectivamente.
- Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos.
- 1 x 106 MCF10A células junto con 3 mL de medio de cultivo en un plato de 10 cm de la semilla. Contar las células usando un hemocitómetro.
- Agregar la mezcla de siRNA gota a gota en el plato de 10 cm.
- Agite el plato para asegurarse de que las células se distribuyen igualmente antes de poner en la incubadora de 37 ° C.
- Después de 6 h de incubación, sustituir el medio que contiene siRNA con 8 mL de medio de cultivo fresco.
- Día 2, preparar otra tanda de mezclas de siRNA e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
- Aspire a 8 mL de medio de cultivo añadido el día 1 y reemplazarlo con 3 mL de medio de cultivo fresco.
- Añadir el segundo lote de la mezcla de siRNA a los platos gota a gota. Agite los platos para asegurar que los reactivos se mezclan completamente antes de ponerlos en la incubadora.
- Después de 6 h, sustituir el medio que contiene siRNA con 8 mL de medio de cultivo fresco.
3. semillas células para el ensayo de cicatrización
- El día 3, deseche el medio y las células una vez con 2 mL de tampón fosfato salino (PBS) tampón de lavado. Desechar el tampón de PBS.
- Trypsinize las células tratadas con siTIP60 y siControl añadiendo 1 mL de 1 x de buffer de tripsina-EDTA a la placa. Vuelva a colocarlo en la incubadora durante 20 minutos.
- Añadir 4 mL de medio de cultivo completo a cada plato, resuspender las células mediante pipeteo y transferirlos a un tubo de 15 mL.
- Centrifugue a 200 g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.
- Resuspenda las células con 5 mL de medio sin suero y contar las células usando un hemocitómetro.
- Preparar una suspensión de 6 x 105 células/mL de siControl y siTIP60; Asegúrese de que las células estén bien mezcladas. Añadir 500 μl de la suspensión celular a un pozo de una placa de 24 pocillos para garantizar 100% de confluencia. Semillas 5 a 6 pozos cada siControl y siTIP60.
- Agitar suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás y lateralmente para asegurar incluso la distribución. Evitar un movimiento circular. Dejar la placa en la incubadora durante 24 h.
- Las células restantes para comprobar la eficacia de la precipitación de TIP60 de la cosecha. Para ello, centrifugar la suspensión de células restantes a 200 g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.
- Aislar RNA usando un reactivo comercial, siguiendo el protocolo del fabricante y proceder a la polimerización en cadena cuantitativa en tiempo real para evaluar la eficacia de la precipitación.
4. crear la herida
- Ver bajo un microscopio de contraste de fase para asegurar que las células están completamente contactadas. Observar las células bajo el microscopio (4 X, 10 X y 20 aumentos) para asegurar que las células se unen totalmente que ha formado una monocapa confluente de células.
Nota: las células siControl generalmente fije mejor que las células siTIP60. Se espera porque el agotamiento de TIP60 hace que las células mesenquimales como mas20. Aquí, se utiliza un microscopio de contraste de fase de luz blanca de mesa normal. - Para generar la herida, raye suavemente una línea recta por el centro del pozo con una pipeta de 200 μL; la longitud de la herida generada es igual que el diámetro del pozo. Repita este paso para todos los pozos restantes. Utilice una nueva pipeta para cada pozo.
- Suavemente Lave bien cada uno 5 veces con suero medio para eliminar las células separadas.
- Añadir 1 mL de medio sin suero a cada pozo y proceder a la proyección de imagen de células vivas.
5. configuración de las imágenes de células vivas
- Encienda el microscopio y la temperatura de control al menos 1 h antes de configurar células vivas imágenes para asegurar que la temperatura en la cámara alcanza los 37 ° C.
- Encienda el suministro de gas de dióxido de carbono (CO2) antes de iniciar la proyección de imagen de células vivas. Fijar el CO2 concentración al 5%.
- Coloque la placa de 24 pocillos sobre la platina del microscopio y seleccione el objetivo con 10 aumentos para la proyección de imagen. Directa de la luz emitida a los oculares en vez de la cámara y ajustar el enfoque para localizar la herida y las células alrededor de él.
Nota: en este caso, se utilizó luz blanca con contraste de fases. - Utilice un sistema observador de células vivas para marcar la posición de la herida en cada pozo.
Nota: La etapa automatizada del sistema de proyección de imagen de células vivas permite la adquisición de imágenes en múltiples posiciones. Imágenes son tomadas en cada posición marcada una vez cada intervalo. - Establecer la condición de tiempo: 1 h intervalo y duración 72 h; Según esta configuración, el sistema tomará fotos en cada posición marcada cada hora durante 72 h. configurar cualquier intervalo de tiempo deseado y período de seguimiento.
Nota: Aquí, una duración de 72 horas es mejor ya que estas células empiezan a morir después de 72 h en medio libre de suero.
6. seguimiento de movimiento de unicelular
- Exportar los datos después de 72 h. exportar los datos como imágenes en formato JPEG y vídeos en formato AVI.
Nota: Esto es importante porque el software ImageJ puede reconocer solamente vídeos en formato AVI. Las velocidades de migración diferentes célula entre las células siTIP60 y siControl pueden observarse claramente en el video. - Abrir el video AVI en el software ImageJ.
- Abrir el plugin de MTrackJ (el plugin debe ser descargado e instalado por separado): Plugins > MtrackJ.
- Añadir una pista para las células elegido en el video haciendo clic en la opción "Agregar" en la barra de herramientas de MtrackJ. Seleccione una celda en el extremo del frente del invasor y una célula que puede migrar por cuenta propia (migración unicelular). Seguir el movimiento de las células solicitadas en el video y trazarlos usando MtrackJ.
- Medir la distancia de movimiento haciendo clic en la pestaña de "medida" en la barra de herramientas.
Nota: Aquí, casi no hay células en el siControl movido como las células, lo que dificulta medir sola célula movimiento, considerando que muchas de las células siTIP60 se trasladó como células individuales. Sin embargo, el movimiento de células situadas en el frente invasor puede todavía remontar y calcula en células siControl y siTIP60. - Guardar el vídeo con las pistas en formato AVI.
7. cuantificación de la capacidad de la migración celular
- Para la cuantificación, seleccione imágenes en 0 h y h "n", donde "n" se refiere al punto de tiempo cuando las células siTIP60 o siControl han cerrado totalmente la herida.
Nota: Aquí, 48 h fue elegido, como las heridas en las células siTIP60 se cerraron casi por completo. - Cuantificar la migración por ciento con ImageJ utilizando la siguiente fórmula: (área de la herida a las 0 h - zona de la herida en "n" h) / área de la herida 0 h x 100.
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Representative Results
Esquema general del ensayo de migración de células vivas basadas en la proyección de imagen de células
Figura 1A es un esquema de este protocolo. MCF10A células transfected con siControl demostrada morfología epitelial típica. Después de la depleción de TIP60, células MCF10A eran más mesenquimales comparado a las células control (figura 1B).
Examen de la eficiencia de precipitación TIP60
La figura 2 muestra la eficacia de la precipitación TIP60. El nivel de expresión TIP60 disminuyó significativamente después del tratamiento siTIP60. Además de TIP60, las expresiones de varias proteínas relacionadas con la migración de la célula también fueron examinados20. Por ejemplo, la expresión de la molécula de adhesión epitelial (EpCAM), que es un marcador epitelial, disminuyó, mientras que las expresiones de fibronectina (FN1) y SNAIL2 (SNAI2), que son los conductores de la EMT, se incrementaron en agotamiento de los TIP60. Estos datos sugieren que los niveles de TIP60 en las células MCF10A utilizadas para la proyección de imagen de células vivas se redujeron lo suficiente.
Agotamiento de TIP60 cambia la dinámica de la migración de la célula
La figura 3 muestra los videos tomados por células siControl y siTIP60. Los videos muestran claramente una rápida migración de la célula de siTIP60 comparado con siControl. Aparte de esto, también se observó una diferencia en la dinámica de migración de la célula entre las células siControl y siTIP60 (es decir, células de siControl se movió como una hoja, mientras que más movimiento de unicelular se observó en las células siTIP60).
Aumento de migración de la célula después de la caída TIP60
La figura 4 muestra la cuantificación de la migración de la célula de células siControl y siTIP60. El porcentaje de células migradas aumentó significativamente después de la depleción de TIP60.
TIP60 Agotamiento cambia el patrón de migración de la célula
La figura 5 muestra videos movimiento de seguimiento unicelular. La mayoría de las células de siControl migra colectivamente como parte de las hojas de la célula y sólo dos células demostradas unicelular migración, mientras que la mayoría de las células siTIP60 demostró migración unicelular. Los cambios en el patrón de migración celular indican que las células con TIP60 empobrecido tienen un fenotipo mesenquimal más.
Figura 1: Resumen Experimental e imágenes representativas. (A) esquema del protocolo. (B) imágenes representativas de MCF10A células transfected con siControl o siTIP60. MCF10A células muestran una morfología mesenquimal más tras el agotamiento de los TIP60. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: TIP60 eficientemente fue agotado después de transfección siTIP60. Se utilizó PCR cuantitativa en tiempo real para verificar el nivel de expresión de TIP60, EpCAM FN1y SNAI2. El ARN total fue aislado utilizando reactivo Trizol siguiendo el protocolo del fabricante. 2 μg de ARN total de cada muestra fue utilizada para hacer cDNA. Los resultados se representan como el doble cambio. Actina se utilizó como control interno. Barra de error indica la desviación estándar de al menos 3 experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: videos de células vivas de células siControl y siTIP60 muestran patrones diferentes de movimiento celular. El intervalo de tiempo fue fijado a 1 h y la duración es de 72 h. El video fue tomado con un observador de células vivas de Zeiss. Haga clic aquí para descargar estos videos.
Figura 4: cuantificación del porcentaje de migración celular. Se obtuvieron imágenes representativas (A) de videos imágenes de células vivas. Se utilizaron fotografías tomadas a las 0 h y 48 h. (B) cuantificación del porcentaje de migración de la célula dentro de las 48 h se realizó utilizando el software ImageJ utilizando la siguiente fórmula: (área de la herida a las 0 h - zona de la herida en "n" h) / área de la herida 0 h x 100. La barra de error indica que la desviación estándar de al menos tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: videos de células vivas muestran el seguimiento de movimiento solo celular. Las líneas de colores muestran la pista migratoria de cada célula individual aislado seleccionada. Haga clic aquí para descargar estos videos.
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Discussion
Se sabe que en el proceso de migración de la célula, las células pueden cualquiera movimiento en forma de fichas de adherentes; racimos flojos; o células individuales, aisladas. El modo y la dinámica de invasión celular pueden variar de un estado a otro, y el fenotipo puede cambiar dentro de las horas. El ensayo de cicatrización tradicional se basa en fotografías instantáneas de un microscopio con un intervalo de tiempo, tales como de 12 o 24 horas. Esto hace difícil de capturar la dinámica de cierre de la herida y el patrón de movimientos celulares.
Por otro lado, sistemas de imagen de células vivas supervisan la migración de la célula sobre un intervalo mucho más corto (30 min o 1 h) y en la misma posición exacta, que no es factible para imágenes tomadas manualmente. El sistema está automatizado, y los investigadores sólo tiene que exportar los datos al final de los experimentos. Esto hace posible controlar el patrón de movimiento celular y el proceso de cierre de la herida en tiempo real. En este estudio, la incorporación de un sistema de imagen cuantitativa de células vivas en los ensayos de cicatrización permite la captura de movimiento dinámico de la célula, así como el proceso de cierre de la herida en el control o las células TIP60-agotado. En el video tomado con un sistema de imágenes de células vivas, la mayoría de las células de siControl se trasladó como una hoja de adherente, mientras que las células TIP60-agotado se trasladó como células individuales aisladas (figura 3 y figura 5).
Proliferación celular y muerte celular podrían complicar el estudio de la migración de la célula en un ensayo de cicatrización. Por lo tanto, el ensayo de cicatrización se realiza en medio libre de suero para minimizar el efecto de la proliferación celular. También, la caída de TIP60 fue optimizada para reducir su impacto en la supervivencia de la célula. Sin embargo, es imposible eliminar las influencias de la proliferación celular y muerte celular en ensayos de cicatrización. Las instantáneas pueden sólo captura la herida cierre en un cierto momento, haciendo imposible distinguir si el cierre de la herida fue debido a migración de la célula o proliferación celular. Proyección de imagen de células vivas controla la dinámica de la migración celular y pistas de movimiento de la célula individual, lo que permite a los investigadores distinguir migración de la célula de la proliferación celular y muerte celular. En este estudio, unicelular seguimiento reveló la ruta de migración de las células aisladas en la condición de siTIP60, mientras que las células siControl movieron sobre todo en forma de hojas. El sistema de imágenes de células vivas también capturó un aumento en la migración de la célula colectiva (es decir, las células migran como un grupo cohesivo) en células de siTIP60 en comparación con las células siControl. De los videos, siTIP60 MCF10A demostró más unicelulares movimientos y rápida migración de hojas de células epiteliales en comparación con siControl (figura 5).
Diversos parámetros utilizados en el presente Protocolo necesitan ser optimizados para evitar el fallo experimental. En primer lugar, el número de muertes de la célula después de transfección transitoria debe ser menos del 10% para minimizar el efecto sobre la migración de la célula. En este caso, el agotamiento de los TIP60 puede reducir la sobrevivencia celular; por lo tanto, los investigadores deben ser conscientes de este fenotipo potencial, ya que puede complicar la migración celular. Para evitar este problema, los investigadores deben optimizar el numero de celular y la cantidad de siRNA solía agotar su gene de la blanco. Para MCF10A, 1 x 106 células con 20 nM siTIP60 era la condición optimizada en este estudio. En segundo lugar, las células MCF10A suelen agrupado y difícil de contar. Errores en el recuento pueden llevar a una diferencia significativa en el número inicial de células a través de diferentes condiciones, y esto podría ser una variable de confusión en los ensayos de la cicatrización. Para evitar este problema, trypsinize células MCF10A durante al menos 20 min agregar medio completo para parar la tripsinización y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo 20 veces para dispersar los grumos y para que sea más fácil de contar. En tercer lugar, las células son generalmente en el centro del pozo después de ser sembrado en la placa de 24 pocillos. Resuspenda las células después de la siembra para asegurar una distribución uniforme. Agitar la placa hacia adelante y hacia atrás y de lado a lado antes de poner en la incubadora. En cuarto lugar, el agotamiento de TIP60 hace la célula mesenquimal más y así más difícil de fijar. Si esto sucede, deje la placa en la incubadora por un período más largo de tiempo. Después de 24 h, generalmente se unen las células. Si las células están aún no debidamente instaladas, los investigadores podrían utilizar medio de cultivo completo para la siembra de células y sustituirla por medio sin suero cuando las células se unen totalmente. Estas células se unen generalmente después de 12 h en el medio completo. En quinto lugar, el borde de la herida no sea liso. Aumentar la velocidad de rasguño para crear bordes lisos. En sexto lugar, la herida puede ser demasiado grande para visualizar a través de la cámara del microscopio. Usar puntas de pipeta de 200 μL con menos fuerza para generar la herida. Alternativamente, puede utilizarse una aguja para generar un espacio más pequeño. En séptimo lugar, algunas células que están separadas durante el rascado pueden vuelva a acoplar a la herida debido a lavados insuficientes. Lavar los pocillos con medio libre de suero en lugar de PBS al menos 5 veces. Octavo, las células pueden empezar a separarse de la placa después de algunos lavados. Sin embargo, el número de lavados no puede ser comprometido para garantizar que las células separadas no vuelva a acoplar a la herida. En este caso, los investigadores pueden lavar las células 3 veces suavemente y dejar la placa dentro de la incubadora durante un tiempo máximo de 1 h para dejar las células establecerse antes de proceder con el resto de los lavados. Noveno, el microscopio puede perder el enfoque, y las imágenes sean borrosas a mitad de camino a través de la experiencia. Un cambio de temperatura en el microscopio puede ser la razón, como la temperatura tiene un efecto menor sobre la distancia de fase ajustado. Investigadores deben encenderse en el microscopio y control de la temperatura por lo menos 1 h antes de iniciar el experimento para asegurarse de que la incubadora se calienta antes de ajustar el foco en las células.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros del laboratorio Jai por su útil discusión y comentarios. S.J. fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de investigación de Singapur y el Ministerio de Educación de Singapur en sus centros de investigación de la iniciativa de excelencia al cáncer la ciencia Instituto de Singapur (R-713-006-014-271), los médicos nacionales Consejo de investigación (CBRG-NIG; BNIG11nov001 y CS-IRG; R-713-000-162-511), el fondo de investigación del Ministerio de Educación (MOE AcRF nivel 1 T1-2012 Oct -04). Y.Z. G.S.C. y C.Y.T. fueron apoyados por una beca de postgrado otorgada por el Instituto de ciencia cáncer de Singapur, Universidad Nacional de Singapur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
References
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