Summary
نقدم هنا، رصد في الوقت الحقيقي للهجرة الخلية في مقايسة التئام الجروح استخدام TIP60 المنضب MCF10A الثدي الخلايا الظهارية. تنفيذ تقنيات التصوير خلية يعيش في أن البروتوكول يسمح لنا بتحليل ووضع تصور لحركة خلية واحدة في الوقت الحقيقي وعبر الوقت.
Abstract
والرزن التئام الجروح بكفاءة، وواحدة من الطرق الأكثر اقتصادا لدراسة الهجرة الخلايا في المختبر. تقليديا، يتم أخذ صور في بداية ونهاية لتجربة استخدام مجهر تباين مرحلة، ويتم تقييم قدرات الهجرة من الخلايا بواسطة إغلاق الجروح. بيد أن حركة الخلية ظاهرة ديناميكية ولا تسمح طريقة تقليدية لتتبع حركة خلية واحدة. تحسين فحوصات التئام الحالية، نحن نستخدم تقنيات التصوير خلية يعيش لمراقبة الهجرة الخلية في الوقت الحقيقي. هذا الأسلوب يسمح لنا بتحديد معدل الهجرة الخلية استناداً إلى خلية تتبع النظام ويوفر تمييز أوضح بين الهجرة الخلية وتكاثر الخلايا. هنا، نحن توضح استخدام التصوير خلية يعيش في التئام فحوصات لدراسة قدرات الهجرة مختلفة من الخلايا الظهارية في الثدي تتأثر بوجود TIP60. كما خلية حركية ديناميكية للغاية، لدينا أسلوب يوفر المزيد من الأفكار في العمليات للشفاء من لقطة لإغلاق الجرح المتخذة مع تقنيات التصوير التقليدية المستخدمة لفحوصات التئام الجرح.
Introduction
فيروس نقص المناعة البشرية-تأت-التفاعلية البروتين 60 كاتشين (TIP60) هو أسيتيلترانسفيراسي يسين التي يمكن acetylate هيستون والبروتينات غير هيستون1،2. تم العثور على وظائفها أن تترتب عليه آثار في مسارات إشارات متعددة، بما في ذلك النسخ وإصلاح أضرار الحمض النووي، والمبرمج1،،من34،،من56، 7 , 8-وعلاوة على ذلك، TIP60 في كثير من الأحيان دوونريجولاتيد في أمراض السرطان، ويرتبط به دوونريجوليشن بسرطان خبيث ومعدلات البقاء على قيد الحياة الفقيرة9،10،،من1112، 13،14. ورم خبيث هو السبب الرئيسي للوفاة المتعلقة بالسرطان. أنها عملية متعددة الخطوات، وأن الخطوة الأولى لورم خبيث ينطوي على الهجرة وغزو الخلايا السرطانية في الأنسجة المجاورة15،16. أولاً الخلايا السرطانية يجب فصلها من كتلة الورم الرئيسي، أما في شكل ورقة الخلية الغازية جماعياً من أجل القيام بذلك، أو كفصل الخلايا المفردة17. أثناء هذه العملية، كثيرا ما الخضوع ورم الخلايا الظهارية للمرحلة الانتقالية الوسيطة (EMT)، أسفر عن تغييرات في خلية ومورفولوجيا التصاق قدرة17،18.
وقد وضعت بعض التقنيات لدراسة الهجرة والقدرة على غزو من ورم الخلايا في المختبر. فيما بينها، هو مقايسة التئام الأكثر كفاءة واقتصادا19. أولاً، يتضمن هذا الأسلوب إنشاء فجوة مصطنعة على أحادي الطبقة المتلاقية للخلايا، مما يسمح للخلايا ترحيل وسد الفجوة. ثانيا، يمكن التقاط الصور للثغرات الموجودة في بداية ونهاية التجربة. وأخيراً، يستخدم مقارنة لإغلاق الفجوة لتحديد معدل الهجرة الخلية. مجهر تباين مرحلة يستخدم عادة لالتقاط الصور لفحوصات التئام التقليدية. ميزة أخرى للمقايسة التئام الجروح أنه يشبه جزئيا في فيفو ورم الخلايا الهجرة. وبالمثل في فيفو ورم خبيث، الهجرة الخلية في فحوصات التئام يبين الهجرة الجماعية من أوراق الظهارية وهجرة الخلايا المفردة المنفصلة.
بيد أن الهجرة الخلية من المعروف أن دينامية، وهناك حاجة توثيق حركة الخلايا في الوقت الحقيقي. على سبيل المثال، لا يسمح مقايسة التئام تقليدية باحث لتحليل حركة خلية واحدة. من ناحية أخرى، والخلايا المزروعة لفحوصات التئام غالباً المتعطشة لمصل تمنع انتشار الخلايا. ويتم ذلك لاستبعاد إمكانية إغلاق الفجوة بسبب انتشار الخلايا. ومع ذلك، ستكون هناك بعض الانتشار وموت الخلايا، ومرحلة التباين الصور التي التقطت قبل وبعد التجربة غير قادرين على التفريق بينهما.
تقنية التصوير خلية يعيش يعالج هذا التقييد لفحوصات التئام التقليدية. استخدام مجهر تصوير العيش جنبا إلى جنب مع CO2 حاضنة والتحكم في درجة الحرارة المناسبة، الباحثين ويمكن قياس حجم الفجوة ومعدل الإغلاق مع مرور الوقت في حين تتبع حركة الهجرة بنشاط الخلايا الموجودة على النصائح من الجبهة الغازية. ومن ثم، لن يوفر فقط تصور أفضل للهجرة الخلية تنفيذ خلية يعيش التصوير لمراقبة الهجرة الخلية، ولكن سيسمح أيضا بإمكانية التفريق بين الهجرة الخلية وتكاثر الخلايا، وبالتالي توفير المزيد تحليل موثوق للهجرة الخلية.
في هذه الدراسة، استخدمت MCF10A الثدي الخلايا الظهارية لإثبات الجمع بين التحليل وخلية يعيش التصوير لدراسة دور TIP60 في الهجرة الخلية التئام الجروح. نتائج استنزاف TIP60 في الهجرة زيادة القدرات في الخلايا MCF10A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد
- تعد المتوسطة MCF10A الثقافة: تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو)/F12 (1:1) مع 5% الحصان المصل، 20 عامل النمو الظهارية نانوغرام/ملليلتر، الهيدروكورتيزون 0.5 ملغ/مل، 100 نانوغرام/مليلتر الكوليرا السمية، والإنسولين 10 ميكروغرام/مل.
- تعد خالية من المصل المتوسطة: DMEM/F12 (1:1) مع 20 نانوغرام/مليلتر طلائي النمو عامل الهيدروكورتيزون 0.5 ملغ/مل، 100 نانوغرام/مليلتر الكوليرا السمية والإنسولين 10 ميكروغرام/مل.
- استخدام siRNA التسلسل التالي:
سيكونترول:
إلى الأمام: 5 '-كجواكجكجاواكووكجادتدت-3'
عكس: 5 '-أوكجاجواووككجكجواكجدتدت-3'
siTIP60:
إلى الأمام: 5 '-أوجاوكجاجووكاجكواوجادتدت-3'
عكس: 5 '-أوكاواجكوجاكوكجوكادتدت-3' - استخدم أطباق الثقافة خلية 10 سم ولوحات 24-جيدا.
2-عابر استنفاد TIP60 باستخدام siRNA
- في يوم 1، الكوة ميليلتر 15 من تعداء كاشف (مثلاً، رنيم ليبوفيكتاميني) و 2 مل من خفض المصل المتوسطة (مثلاً، غروب-الفنزويلية) ومزجها مع 10 ميليلتر من كل siRNA (10 ميكرون الأسهم)، على التوالي.
- احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
- البذور 1 × 106 MCF10A الخلايا جنبا إلى جنب مع 3 مل من الثقافة المتوسطة في صحن 10 سم. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
- إضافة خليط siRNA قطره قطره للطبق 10 سم.
- يهز الطبق التأكد من أن الخلايا هي موزعة بالتساوي قبل وضعه في حاضنة 37 درجة مئوية.
- بعد 6 ح الحضانة، يستعاض عن المتوسطة المحتوية على siRNA 8 مل من جديد الثقافة المتوسطة.
- في اليوم 2، إعداد آخر دفعة من خلائط siRNA واحتضانها لهم في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
- نضح بها 8 مل المتوسط الثقافة أضيف يوم 1 واستبدله 3 مل من جديد الثقافة المتوسطة.
- إضافة الدفعة الثانية من خليط siRNA للاطباق قطره قطره. هزة الأطباق لضمان أن الكواشف مختلطة تماما قبل وضعها في الحاضنة.
- بعد ح 6، يستعاض عن المتوسطة المحتوية على siRNA 8 مل من جديد الثقافة المتوسطة.
3-بذور الخلايا للمقايسة التئام الجروح
- في يوم 3، تجاهل المتوسطة وغسل الخلايا مرة واحدة مع 2 مل من الفوسفات مخزنة المالحة العازلة (PBS). تجاهل المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني.
- تريبسينيزي سيكونترول و siTIP60 معاملة الخلايا بإضافة 1 مل 1 × يدتا التربسين المخزن المؤقت اللوحة. وضعها مرة أخرى في الحاضنة لمدة 20 دقيقة.
- إضافة 4 مل متوسطة ثقافة كاملة لكل لوحة، ريسوسبيند الخلايا التي بيبيتينج، ونقلها إلى أنبوب 15 مل.
- الطرد المركزي في 200 غ لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية.
- تعليق إعادة الخلايا مع 5 مل متوسط خالية من المصل وعد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
- إعداد تعليق خلية 6 × 105 خلايا/مل لكل من سيكونترول و siTIP60؛ التأكد من وجود الخلايا المختلطة جيدا. إضافة 500 ميليلتر من تعليق خلية إلى بئر واحدة من صفيحة 24-جيدا لضمان كونفلوينسي 100%. البذور 5 إلى 6 آبار كل سيكونترول و siTIP60.
- بلطف يهز لوحة ذهابا وإيابا ومن ثم جنبا إلى جنب لضمان التوزيع حتى. تجنب حركة دائرية. اترك اللوحة في الحاضنة ح 24.
- حصاد الخلايا المتبقية للتحقق من كفاءة TIP60 ضربة قاضية. للقيام بذلك، الطرد المركزي من تعليق خلية المتبقية في 200 غ لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية.
- عزل الحمض النووي الريبي استخدام كاشف تجاري، يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة، والمضي قدما في الوقت الحقيقي PCR الكمي لتقييم كفاءة ضربة قاضية.
4-إنشاء الجرح
- الاختيار تحت مجهر تباين المرحلة التأكد من أن الخلايا موصولة تماما. مراقبة الخلايا تحت المجهر (4 X 10 X والتكبير X 20) التأكد من أن الخلايا موصولة تماما أن شكلت أحادي الطبقة المتلاقية للخلايا.
ملاحظة: الخلايا سيكونترول عادة إرفاق أفضل من الخلايا siTIP60. ومن المتوقع لاستنزاف TIP60 يجعل الخلايا الوسيطة مثل أكثر20. هنا، يتم استخدام مجهر تباين مرحلة ضوء أبيض benchtop عادية. - لتوليد الجرح، بلطف الصفر خط مستقيم عبر وسط البئر مع تلميح ماصة 200 ميليلتر؛ طول الجرح إنشاؤها نفس قطر البئر. كرر هذه الخطوة لكل الآبار المتبقية. استخدام تلميح ماصة جديدة لكل بئر.
- تغسل بلطف كل جيدا 5 مرات باستخدام خالية من المصل المتوسط إلى إزالة الخلايا المنفصلة.
- أضف 1 مل متوسط خالية من المصل لكل بئر والشروع في تصوير خلية يعيش.
5-الإعداد لتصوير خلية يعيش
- قم بتشغيل المجهر ومراقبة درجة الحرارة على الأقل 1 ح قبل إعداد خلية يعيش التصوير لضمان أن تصل درجة الحرارة في الغرفة إلى 37 درجة مئوية.
- بدوره على إمدادات غاز ثاني أكسيد الكربون (CO2) قبل البدء في تصوير خلية يعيش. تعيين أول أكسيد الكربون تركيز2 إلى 5%.
- ضع لوحة 24-جيدا في مرحلة المجهر وحدد الهدف العدسة مع 10 X التكبير للتصوير. توجيه الضوء المنبعثة للعدسات بدلاً من الكاميرا وضبط التركيز لتحديد موقع الجرح والخلايا المحيطة به.
ملاحظة: في هذه الحالة، الضوء الأبيض مع تباين المرحلة استخدمت. - استخدام نظام خلية يعيش مراقب لوضع علامة على موضع الجرح في كل بئر.
ملاحظة: المرحلة الآلي نظام التصوير بخلية يعيش يسمح للحصول على الصور في مواقع متعددة. يتم أخذ صور في كل موقف ملحوظ مرة كل فترة. - إعداد الشرط الوقت: ح 1 الفاصل الزمني ومدة 72 ح؛ وفقا لهذا الإعداد، النظام سوف التقاط الصور في كل موقف ملحوظ كل ساعة ل h. 72 إعداد أي الفترة الزمنية المطلوب والفترة للرصد.
ملاحظة: هنا، مدة 72 ساعة لأنه أفضل هذه الخلايا يبدأ الموت بعد 72 ساعة في المتوسط خالية من المصل.
6-تتبع حركة خلية واحدة
- تصدير البيانات بعد حاء 72 تصدير البيانات كالصور بتنسيق JPEG وملفات الفيديو بتنسيق AVI.
ملاحظة: هذا أمر مهم للبرامج إيماجيج يمكن أن تعترف فقط ملفات الفيديو بتنسيق AVI. ويمكن ملاحظة سرعة الهجرة خلية مختلفة بين الخلايا siTIP60 وسيكونترول وضوح في الفيديو. - فتح الفيديو أفي في برنامج إيماجيج.
- فتح البرنامج المساعد متراكج (المساعد يجب تنزيلها وتثبيتها بشكل منفصل): الإضافات > متراكج.
- إضافة مسار للخلايا المفردة المختارة من الفيديو بواسطة النقر فوق علامة التبويب "إضافة" في شريط الأدوات متراكج. اختر خلية على طرف الجبهة الغازية وخلية يمكن ترحيل بمفردها (الهجرة خلية واحدة). متابعة حركة الخلايا المختارة على الفيديو وتتبع لهم باستخدام متراكج.
- قياس مسافة الحركة بواسطة النقر فوق علامة التبويب "مقياس" على شريط الأدوات.
ملاحظة: هنا، انتقلت تقريبا أي من الخلايا في سيكونترول كالخلايا المفردة، مما يجعل من الصعب قياس حركة خلية واحدة، بينما نقل العديد من الخلايا siTIP60 كخلايا مفردة. ومع ذلك، يمكن لا تزال تتبعها حركة الخلايا الموجودة في الجبهة الغازية والمحسوبة في الخلايا سيكونترول و siTIP60. - حفظ الفيديو مع المسارات في شكل AVI.
7-التحديد الكمي لقدرة الهجرة الخلية
- للتحديد الكمي، حدد الصور والصور في ح 0 في ح "n"، حيث "n" يشير إلى تيميبوينت عند الخلايا siTIP60 أو سيكونترول وأغلقت الجرح تماما.
ملاحظة: هنا، ح 48 واختير، كالجروح في الخلايا siTIP60 وأغلقت تماما تقريبا. - قياس الهجرة نسبة استخدام إيماجيج باستخدام الصيغة التالية: (مساحة جرح في 0 ح-مساحة جرح في ح "n")/مساحة جرح في ح 0 × 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
المخطط العام للعيش-القائم على تصوير خلية الهجرة المقايسة
الشكل 1A مخطط لهذا البروتوكول. الخلايا MCF10A transfected مع سيكونترول أظهرت مورفولوجيا الظهارية نموذجية. بعد استنفاد TIP60، كانت الخلايا MCF10A الوسيطة أكثر مقارنة مع مراقبة الخلايا (الشكل 1B).
دراسة كفاءة ضربة قاضية TIP60
ويبين الشكل 2 TIP60 كفاءة ضربة قاضية. مستوى التعبير TIP60 انخفض كثيرا بعد العلاج siTIP60. بالإضافة إلى TIP60، وتعبيرات البروتينات ذات الصلة بالهجرة الخلية عدة كانت أيضا دراسة20. على سبيل المثال، انخفضت التعبير عن جزيء الالتصاق الظهارية (ابكام)، وعلامة الظهارية،، بينما عبارات فيبرونيكتين (FN1) و SNAIL2 (SNAI2)، التي تعتبر كلا السائقين EMT، زيدت عليها نفاد TIP60. تشير هذه البيانات إلى أن تم تخفيض مستويات TIP60 في الخلايا MCF10A المستخدمة لتصوير خلية يعيش بما فيه الكفاية.
استنفاد TIP60 التغيرات الدينامية للهجرة الخلية
ويبين الشكل 3 أشرطة الفيديو التي اتخذت للخلايا سيكونترول و siTIP60. أشرطة الفيديو تظهر بوضوح هجرة خلية أسرع بالمقارنة مع سيكونترول siTIP60. بخلاف ذلك، لوحظ فرق في دينامية الهجرة الخلية بين الخلايا سيكونترول و siTIP60 أيضا (أي، انتقلت كورقة، بينما لوحظ حركة أكثر من خلية واحدة في الخلايا siTIP60 الخلايا سيكونترول).
زيادة في الهجرة الخلية بعد ضربة قاضية TIP60
ويبين الشكل 4 التحديد الكمي للهجرة الخلية للخلايا سيكونترول و siTIP60. النسبة المئوية للخلايا التي تم ترحيلها زيادة كبيرة بعد نفاد TIP60.
TIP60 استنفاد تغيير نمط الهجرة الخلية
يبين الشكل 5 أشرطة الفيديو تتبع حركة خلية واحدة. جماعياً ترحيل معظم الخلايا سيكونترول كجزء من أوراق الخلية، وخليتين فقط أظهرت الهجرة خلية واحدة، بينما معظم siTIP60 الخلايا تظهر الهجرة خلية واحدة. التغيرات في نمط الخلية الهجرة تشير إلى أن الخلايا مع TIP60 المستنفد النمط الظاهري الوسيطة أكثر.
رقم 1: نظرة عامة على التجريبية والصور التمثيلية. مخطط (أ) من البروتوكول. (ب) صور الممثل من الخلايا MCF10A transfected مع سيكونترول أو siTIP60. إظهار الخلايا MCF10A مورفولوجيا الوسيطة أكثر بعد نفاد TIP60. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: كفاءة قد نفدت TIP60 بعد تعداء siTIP60- واستخدمت PCR الكمي في الوقت الحقيقي للتحقق من مستوى التعبير TIP60، ابكام، FN1، و SNAI2. الجيش الملكي النيبالي إجمالي كانت معزولة باستخدام كاشف تريزول بعد البروتوكول الصنع. تم استخدام 2 ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي إجمالي لكل عينة لجعل كدنا. يتم تمثيل النتائج الحظيرة-التغيير. أكتين استخدمت كرقابة داخلية. شريط خطأ يشير إلى الانحراف المعياري من تجارب مستقلة على الأقل 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: إظهار الفيديو التصوير يعيش خلية من الخلايا سيكونترول و siTIP60 أنماط مختلفة من حركة الخلية- وكان تعيين الفاصل الزمني إلى ح 1 وكانت المدة 72 ساعة. الفيديو اتخذ باستخدام أحد مراقبي خلية يعيش زايس. اضغط هنا لتحميل أشرطة الفيديو هذه.
الشكل 4: تقدير النسبة المئوية للهجرة الخلية. تم الحصول على صور الممثل (A) من خلية يعيش تصوير أشرطة الفيديو. واستخدمت الصور التي التقطت في ح 0 وح 48. (ب) التحديد الكمي للنسبة المئوية للهجرة الخلية ضمن ح 48 تم استخدام البرمجيات إيماجيج باستخدام الصيغة التالية: (مساحة جرح في 0 ح-مساحة جرح في ح "n")/مساحة جرح في ح 0 × 100. شريط خطأ يشير إلى الانحراف المعياري من التجارب المستقلة ثلاثة على الأقل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: خلية يعيش تصوير أشرطة فيديو تظهر تتبع حركة خلية واحدة- خطوط ملونة تبين المسار المهاجرة من كل خلية مفردة معزولة المحدد. اضغط هنا لتحميل أشرطة الفيديو هذه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ومن المعروف أن الخلايا يمكن أن عملية الهجرة الخلية، أما التحرك في شكل أوراق ملتصقة؛ مجموعات فضفاضة؛ أو خلايا وحيدة ومعزولة. الوضع ودينامية لغزو الخلية يمكن أن تختلف من شرط واحد إلى آخر، ويمكنك تغيير النمط الظاهري في غضون ساعة. ويستند المقايسة التئام التقليدية صور لقطة مأخوذة من مجهر مع فترة زمنية طويلة، مثل 12 أو 24 ساعة. وهذا يجعل من الصعب على التقاط الدينامية لإغلاق الجرح ونمط الخلية الحركات.
من ناحية أخرى، رصد نظم التصوير خلية يعيش الهجرة الخلية على مدى فترة أقصر (30 دقيقة أو ح 1)، وفي نفس الموضع الدقيق، الذي ليس من الممكن للصور الملتقطة يدوياً. هو النظام الآلي، والباحثين بحاجة فقط لتصدير البيانات في نهاية التجارب. وهذا يجعل من الممكن لرصد نمط حركة الخلية وعملية إغلاق الجرح في الوقت الحقيقي. في هذه الدراسة، يتيح إدماج نظام التصوير الكمي لخلية يعيش في فحوصات التئام للقبض على خلية دينامية الحركة، فضلا عن عملية إغلاق الجرح في عنصر التحكم أو المنضب TIP60 الخلايا. من الفيديو اتخذت باستخدام نظام تصوير خلية يعيش، انتقلت معظم الخلايا سيكونترول كورقة ملتصقة، بينما انتقل المنضب TIP60 الخلايا كخلايا مفردة معزولة (الشكل 3 و الشكل 5).
تكاثر الخلايا وموت الخلية قد يعقد دراسة الهجرة الخلية في مقايسة التئام الجروح. ولذلك تتم مقايسة التئام في المتوسط خالية من المصل للتقليل من تأثير انتشار الخلايا. أيضا، ضربة قاضية ل TIP60 الأمثل للحد من أثرها على بقاء الخلية. ومع ذلك، من المستحيل القضاء على التأثيرات من تكاثر الخلايا وموت الخلايا في فحوصات التئام الجروح. اللقطات يمكن إغلاق التقاط الجرح فقط في نقطة معينة من الزمن، مما يجعل من المستحيل التمييز بين ما إذا كان إغلاق الجرح بسبب الهجرة الخلية أو تكاثر الخلايا. تصوير خلية يعيش يرصد ديناميات الهجرة الخلية ومسارات حركة الخلايا الفردية، مما يجعل من الممكن للباحثين التمييز بين الهجرة الخلية من تكاثر الخلايا وموت الخلايا. في هذه الدراسة، كشفت خلية واحدة تتبع مسار هجرة الخلايا وحيدة منعزلة في حالة siTIP60، بينما نقل الخلايا سيكونترول معظمها في شكل أوراق. نظام التصوير خلية يعيش استولت أيضا زيادة في الهجرة الجماعية من الخلية (أي الخلايا التي تم ترحيلها كمجموعة متماسكة) في الخلايا siTIP60 مقارنة بالخلايا سيكونترول. من أشرطة الفيديو، أظهر MCF10A siTIP60 أكثر الحركات خلية واحدة والهجرة أسرع من الخلايا الظهارية أوراق سيكونترول (الشكل 5) بالمقارنة.
المعلمات المختلفة المستخدمة في هذا البروتوكول بحاجة إلى أن يكون الأمثل لتجنب فشل التجريبية. أولاً، ينبغي أن يكون عدد الوفيات الخلية بعد تعداء عابر أقل من 10% إلى أدنى حد من أثر على الهجرة الخلية. وفي هذه الحالة، قد يقلل من استنزاف TIP60 بقاء الخلية؛ ومن ثم، ينبغي أن يكون الباحثون علم بهذا النمط الظاهري المحتملة، كما أنها قد تؤدي إلى تعقيد الهجرة الخلية. لتجنب هذه المشكلة، ينبغي تحسين الباحثين بعدد الخلايا ومقدار siRNA المستخدمة إلى استنزاف هذه الجينات المستهدفة. 1 × 106 خلايا مع 20 نانومتر siTIP60 MCF10A، كان الشرط الأمثل في هذه الدراسة. وثانيا، MCF10A الخلايا غالباً ما تكون متفاوت المسافات وصعوبة الاعتماد. أخطاء في حساب الخلية قد يؤدي إلى اختلاف كبير في أرقام الخلية الأولى عبر ظروف مختلفة، وهذا يمكن أن يكون متغير التباس في فحوصات التئام الجروح. لتجنب هذه المشكلة، تريبسينيزي الخلايا MCF10A على الأقل 20 دقيقة المتوسطة النمو الكامل إضافة وقف تريبسينيزيشن ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 20 مرة لتفريق في كتل وجعله أسهل لعد. ثالثا، الخلايا عادة في وسط البئر بعد يجري المصنف إلى لوحة 24-جيدا. إعادة تعليق الخلايا بعد البذر لضمان توزيع حتى. هز اللوحة ذهابا وإيابا، وجنبا إلى جنب قبل وضعه في الحاضنة. رابعا، يجعل استنفاد TIP60 الخلية الوسيطة أكثر وأكثر صعوبة مما يعلق. إذا حدث هذا، اترك اللوحة في الحاضنة لفترة أطول من الزمن. بعد 24 ساعة، وعادة ما يتم إرفاق الخلايا. إذا كان لا يزال غير صحيح يتم إرفاق الخلايا، يمكن استخدام متوسط النمو الكامل لبذر خلية الباحثين واستبدالها بالمتوسط خالية من المصل عندما يتم إرفاق الخلايا تماما. وعادة ما يتم إرفاق هذه الخلايا بعد 12 ساعة في المتوسط كاملة. خامسا، قد لا تكون على حافة الجرح السلس. زيادة سرعة الخدش لإنشاء حواف ناعمة. سادسا، الجرح قد تكون كبيرة جداً لتصور من خلال كاميرا المجهر. استخدام 200 ميليلتر ماصة نصائح مع أقل قوة لتوليد الجرح. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام إبرة لتولد فجوة أصغر. سابعا، يجوز إعادة إرفاق بعض الخلايا التي يتم فصل أثناء الخدش للجرح بسبب عدم كفاية يغسل. غسل الآبار مع المتوسط خالية من المصل بدلاً من برنامج تلفزيوني 5 مرات على الأقل. ثامنا، قد تبدأ الخلايا لفصل من اللوحة بعد قليل يغسل. ومع ذلك، لا يمكن المساس بعدد يغسل بغية التأكد من أن الخلايا المنفصلة لا إعادة إرفاق للجرح. وفي هذه الحالة، يمكن غسل الخلايا بلطف 3 مرات الباحثين وترك اللوحة داخل الحاضنة لفترة الحد أقصى من ح 1 للسماح للخلايا تستقر قبل الانتقال إلى بقية يغسل. تاسعا، المجهر قد تفقد التركيز، والصور قد تصبح ضبابية في منتصف الطريق من خلال التجربة. قد يكون تغيير في درجة الحرارة حول المجهر السبب، درجة الحرارة له تأثير طفيفة على المسافة المرحلة المعدلة. يجب تشغيل الباحثين بالمجهر ومراقبة درجة الحرارة على الأقل 1 ح قبل البدء بالتجربة إلى التأكد من أن الحاضنات هو استعد قبل ضبط التركيز على الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ونشكر أعضاء المختبر جها لمناقشة مفيدة وتعليقات. وأيده عدد المنح المقدمة من سنغافورة "المؤسسة الوطنية للبحوث" ووزارة التعليم سنغافورة تحت مراكزها البحثية لمبادرة التميز "السرطان العلوم معهد سنغافورة" (R-713-006-014-271)، الطبية الوطنية مجلس البحوث (كبرج-NIG؛ BNIG11nov001 وخدمات العملاء-أسندت؛ R-713-000-162-511)، صندوق البحث الأكاديمي في وزارة التربية والتعليم (وزارة التربية والتعليم أكرف الطبقة الأولى T1-2012 أكتوبر-04). وأيد زمالة الدراسات العليا تمنحها "السرطان العلوم معهد سنغافورة"، جامعة سنغافورة الوطنية، Y.Z.، G.S.C.، و C.Y.T..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
References
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
- Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53. J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).
- Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage. Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).
- Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. Cellular functions of TIP60. Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).
- Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT. Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).
- Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity. Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).
- Sykes, S. M., et al. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction. Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).
- Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis. Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).
- Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival. J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).
- Gorrini, C., et al. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response. Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).
- Jha, S., et al. Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway. Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).
- Kim, J. H., et al. Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes. Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).
- Sakuraba, K., et al. Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer. Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).
- Subbaiah, V. K., et al. E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60. Oncogene. , (2015).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Zhang, Y., et al. TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program. J Mol Cell Biol. , (2016).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
