Summary
在这里, 我们提出了实时监测细胞迁移在伤口愈合试验中使用 TIP60-depleted MCF10A 乳腺上皮细胞。在我们的协议中实现了活细胞成像技术, 使我们能够实时和跨时间地分析和可视化单细胞运动。
Abstract
伤口愈合试验是有效的, 也是研究细胞迁移的最经济的方法之一体外。传统上, 图像是在实验开始和结束时使用相衬显微镜, 并通过闭合伤口来评估细胞的迁移能力。然而, 细胞运动是一种动态现象, 传统的方法不允许追踪单细胞运动。为了改善目前的伤口愈合检测方法, 我们使用活细胞成像技术实时监测细胞迁移。这种方法使我们能够确定细胞迁移率的基础上的细胞跟踪系统, 并提供了更明确的区分细胞迁移和细胞增殖。在这里, 我们演示了使用活细胞成像在伤口愈合的检测, 以研究不同的迁移能力的影响乳腺上皮细胞 TIP60 的存在。由于细胞运动是高度动态的, 我们的方法提供了更多的洞察力愈合的过程, 而不是一个伤口闭合拍摄的传统成像技术用于伤口愈合化验。
Introduction
HIV-达互动蛋白 60 kDa (TIP60) 是一种赖氨酸乙酰, 可以乙酰组蛋白和非组蛋白蛋白质1,2。它的功能被发现具有多重信号通路的含义, 包括转录, DNA 损伤修复, 和凋亡 1,3,4,5,67,8. 此外, TIP60 常 downregulated 于癌症, 其下调与癌症转移和生存率差有关9、10、11、12, 13,14。肿瘤转移是癌症相关死亡的主要原因。它是一个多步过程, 转移的初始步骤涉及肿瘤细胞向相邻组织的迁移和侵袭15,16。为了做到这一点, 肿瘤细胞首先必须脱离原发肿瘤肿块, 要么以集体侵入细胞表的形式, 要么作为分离的单个细胞17。在这个过程中, 肿瘤细胞经常发生上皮间转移 (急诊), 导致形态学和细胞黏附能力的变化17,18。
对肿瘤细胞的迁移和侵袭能力进行了研究, 并对其进行了体外培养。其中, 伤口愈合试验是最有效和经济的19。首先, 这种方法涉及在细胞的汇合单层上创建人工间隙, 从而允许细胞迁移和闭合间隙。第二, 在实验开始和结束时可以捕捉到间隙的图像。最后, 通过比较间隙闭合来确定细胞迁移率。相衬显微镜通常用于捕捉图像的传统伤口愈合的化验。伤口愈合试验的另一个优点是它部分类似于体内肿瘤细胞的迁移。与体内肿瘤转移相似, 伤口愈合过程中的细胞迁移表现为上皮片的集体迁移和分离单细胞的迁移。
然而, 细胞迁移是已知的动态的, 并且有需要记录细胞的移动在实时。例如, 一个传统的伤口愈合试验不允许研究员分析单细胞运动。另一方面, 培养伤口愈合的细胞通常是缺乏血清的, 以抑制细胞增殖。这样做是为了排除因细胞增殖而导致间隙闭合的可能性。尽管如此, 还是会有一些增殖和细胞死亡, 并且在实验前后所拍摄的相衬图像无法区分它们。
活细胞成像技术解决了这一局限性的常规伤口愈合的化验。使用实时成像显微镜结合 CO2孵化器和适当的温度控制, 研究人员可以测量间隙大小及其在一段时间内的闭合速率, 同时跟踪位于侵入前线因此, 实施活细胞成像监测细胞迁移不仅将提供更好的可视化细胞迁移, 但也将允许区分细胞迁移和细胞增殖的可能性, 从而提供了一个更细胞迁移的可靠分析。
在这项研究中, MCF10A 乳腺上皮细胞被用来证明伤口愈合试验和活细胞成像的结合, 以研究 TIP60 在细胞迁移中的作用。TIP60 的耗竭导致 MCF10A 细胞迁移能力的提高。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 准备
- 准备 MCF10A 培养基: Dulbecco 氏改良鹰培养基 (DMEM)/F12 (1:1) 与5% 马血清, 20 ng/毫升上皮生长因子, 0.5 毫克/毫升的可的松, 100 ng/毫升霍乱毒素, 和10µg/毫升胰岛素。
- 制备无血清培养基: DMEM/F12 (1:1), 20 ng/毫升上皮生长因子, 0.5 毫克/毫升可的松, 100 ng/毫升霍乱毒素, 和10µg/毫升胰岛素。
- 使用以下 siRNA 序列:
siControl:
转发: 5 "-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3"
反向: 5 "-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3"
siTIP60:
转发: 5 "-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3"
反向: 5 "-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3" - 使用10厘米细胞培养皿和24孔板。
2. 使用 siRNA 的瞬态损耗 TIP60
- 在1天, 分15µL 转染试剂 (例如,体 RNAiMAX) 和2毫升的还原血清培养基 (例如,优化-记忆), 并将它们与每µL (10 siRNA 库存) 的10µM 分别混合。
- 室温下孵育混合物20分钟。
- 种子 1 x 106 MCF10A 细胞连同3毫升培养基在 10 cm 盘中。使用例计数单元格。
- 加入 siRNA 混合物滴到10厘米的盘子里。
- 摇动盘子, 确保细胞在放入37° c 恒温箱前均匀分布。
- 经过6小时的孵化, 用8毫升的新鲜培养基取代含 siRNA 的培养基。
- 2天, 准备另一批 siRNA 混合物, 在室温下孵育20分钟。
- 抽出8毫升的培养基添加在1天, 代之以3毫升的新鲜培养基。
- 将第二批 siRNA 的混合物放到盘子里滴下。摇动碗碟, 确保试剂在放入孵化箱前完全混合。
- 6 h 后, 用8毫升的新鲜培养基取代含 siRNA 的培养基。
3. 伤口愈合试验用种子细胞
- 在3天, 丢弃培养基, 用2毫升磷酸缓冲盐 (PBS) 缓冲液冲洗细胞一次。丢弃 PBS 缓冲区。
- 处理 siControl 和 siTIP60-treated 细胞, 加入1毫升的1x 胰蛋白酶-EDTA 缓冲到板块。把它放回孵化器20分钟。
- 添加4毫升的完整培养基到每个板块, 重细胞的移, 并转移到一个15毫升的管。
- 离心机在200克为5分钟, 并删除上清液。
- 用5毫升无血清培养基重新悬浮细胞, 用例计数细胞。
- 为 siControl 和 siTIP60 准备一个 6 x 105细胞/毫升的细胞悬浮液;确保细胞混合良好。将500µL 的细胞悬浮液添加到24孔板的一个井中, 以确保 100% 70-100。种子5至6口井分别为 siControl 和 siTIP60。
- 轻轻摇晃板来回, 然后侧面, 以确保均匀分配。避免圆周运动。把盘子放在孵化箱里24小时。
- 收获剩余的细胞以检查 TIP60 的击倒效率。为此, 将剩余的细胞悬浮在200克, 5 分钟, 除去上清液。
- 使用商业试剂分离 RNA, 按照制造商的协议, 并进行实时定量 PCR 评估击倒效率。
4. 创建伤口
- 在相衬显微镜下检查, 确保细胞完全附着。观察显微镜下的细胞 (4X、10X 和20X 的放大倍数), 以确保细胞完全附着, 形成一个汇合的单层细胞。
注: siControl 细胞通常比 siTIP60 细胞附着更好。这是意料之中的, 因为 TIP60 的耗尽使细胞的间质更像20。在这里, 使用正常的台式白光相衬显微镜。 - 要产生伤口, 用200µL 吸管尖端轻轻划伤一条穿过井中心的直线;所产生的伤口长度与井径相同。对余下的水井重复这一步。每井使用一个新的吸管尖端。
- 用无血清培养基轻轻冲洗每一个井5次, 去除分离的细胞。
- 每井加1毫升无血清培养基, 并进行活体细胞成像。
5. 活细胞成像的设置
- 在设置活细胞成像之前, 打开显微镜和温度控制至少1小时, 以确保燃烧室内的温度达到37° c。
- 在开始活细胞成像之前, 打开二氧化碳 (CO2) 气体供应。将 CO2浓度设置为5%。
- 将24井板放在显微镜的舞台上, 选择物镜, 10X 放大成像。将发射的光直接放到目镜而不是相机上, 调整焦点以定位伤口和周围的细胞。
注: 在这种情况下, 使用了相衬的白光。 - 使用活细胞观察系统来标记伤口在每个井中的位置。
注: 活细胞成像系统的自动化阶段允许在多个位置进行图像采集。每隔一段时间就会对每个标记位置进行图像处理。 - 设置时间条件: 1 小时间隔和72小时;根据这个设置, 系统将每小时在每一个标记的位置上拍照 72 h. 设置任何所需的时间间隔和监视期间。
注意: 在这里, 72 h 的持续时间是最好的, 因为这些细胞在无血清培养基中72小时后开始死亡。
6. 跟踪单细胞移动
- 在72小时后导出数据. 将数据同时导出为 JPEG 格式的图像和 AVI 格式的视频。
注意: 这很重要, 因为 ImageJ 软件只能识别 AVI 格式的视频。siTIP60 和 siControl 细胞之间的不同细胞迁移速度可以在视频中清晰地观察到。 - 在 ImageJ 软件中打开 AVI 视频。
- 打开 MTrackJ 插件 (必须单独下载和安装插件): 插件 > MTrackJ。
- 通过单击 MtrackJ 工具栏中的 "添加" 选项卡, 为从视频中选择的单个单元格添加音轨。在侵入前的尖端选择一个细胞, 一个可以自行迁移的细胞 (单细胞迁移)。跟踪视频中所选单元格的移动并使用 MtrackJ 跟踪它们。
- 通过单击工具栏上的 "测量" 选项卡来测量移动距离。
注: 在这里, 几乎没有细胞在 siControl 移动作为单细胞, 使它难以测量单细胞移动, 而许多 siTIP60 细胞移动作为单细胞。然而, 位于侵入前沿的细胞的运动仍可在 siControl 和 siTIP60 细胞中追踪和计算。 - 用 AVI 格式的曲目保存视频。
7. 细胞迁移能力的量化
- 对于量化, 选择图像在0小时和图像在 "n" h, 其中 "n" 指的 timepoint 时, 要么 siTIP60 或 siControl 细胞完全封闭的伤口。
注: 在这里, 48 h 被选中, 因为 siTIP60 细胞的伤口几乎完全闭合。 - 使用以下公式对使用 ImageJ 的迁移百分比进行量化: (在 "n" h 的伤口面积 0 h 区)/伤口面积0ĥ x 100。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
基于活细胞成像的细胞迁移试验的一般图式
图 1A是此协议的架构。MCF10A 细胞转染 siControl 显示典型的上皮形态学。在 TIP60 耗尽后, MCF10A 细胞与对照细胞相比更具间质性 (图 1B)。
TIP60 击倒效率的检验
图 2显示了 TIP60 击倒效率。siTIP60 治疗后, TIP60 表达水平明显下降。除了 TIP60, 还检查了几个细胞迁移相关蛋白的表达20。例如, 上皮黏附分子 (EpCAM) 的表达减少了, 而纤维连接蛋白 (FN1) 和 SNAIL2 (SNAI2) (即两个急救驱动程序) 的表达在耗尽 TIP60。这些数据表明, 用于活细胞成像的 MCF10A 细胞中的 TIP60 水平得到了充分的降低。
TIP60 的耗竭改变细胞迁移的动态
图 3显示了为 siControl 和 siTIP60 单元格拍摄的视频。与 siControl 相比, 这些视频清楚地显示出 siTIP60 细胞迁移速度更快。此外, 还观察到 siControl 和 siTIP60 细胞之间的细胞迁移的动态差异 (即, siControl 细胞作为工作表移动, 而在 siTIP60 细胞中观察到更多的单细胞移动)。
TIP60 击倒后细胞迁移的增加
图 4显示了 siControl 和 siTIP60 单元格迁移的量化。在 TIP60 耗尽后, 迁移细胞的百分率显著增加。
TIP60 损耗改变细胞迁移的模式
图 5显示了跟踪单单元格移动的视频。大多数 siControl 细胞作为细胞表的一部分集体迁移, 只有两个细胞显示单细胞迁移, 而大多数 siTIP60 细胞显示单细胞迁移。细胞迁移模式的变化表明, TIP60 的细胞具有更多的间质表型。
图 1: 实验概述和代表性图像.(A) 协议的架构。(B) 转染 siControl 或 siTIP60 的 MCF10A 细胞的代表性图像。MCF10A 细胞在 TIP60 的耗竭后表现出更多的间质形态学。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: TIP60 在 siTIP60 转染后有效地耗尽.实时定量 PCR 用于检查TIP60、EpCAM、FN1和SNAI2的表达水平。总 RNA 被分离了使用 Trizol 试剂在制造的协议以后。2µg 每个样本的总 RNA 被用来制造 cDNA。结果被代表作为折叠变动。肌动蛋白被用作内部控制。误差条表示标准偏差从至少3独立实验。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: siControl 和 siTIP60 细胞的活细胞成像视频显示了不同的细胞移动模式.时间间隔被设置了到 1 h, 并且期间是到 72 h。这段视频是用蔡司活细胞观察者拍摄的。请单击此处下载这些视频.
图 4: 单元格迁移百分比的量化.(A) 有代表性的图像取自活细胞成像视频。使用了0小时和48小时拍摄的照片。(B) 使用 ImageJ 软件, 使用以下公式对48小时内细胞迁移百分率进行了量化: (在 "n" h 的伤口处 0 h 区伤口面积)/伤口面积0小时 x 100。误差条表示标准偏差从至少三独立实验。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 活细胞成像视频显示单细胞运动的跟踪.彩色线条显示每个选定隔离单个单元的迁移轨迹。请单击此处下载这些视频.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
众所周知, 在细胞迁移的过程中, 细胞可以以附着板的形式移动;松散簇;或单个独立的单元格。细胞侵袭的模式和动力可以从一个条件变化到另一个, 而表型在数小时内就会改变。传统的伤口愈合试验是基于从显微镜拍摄的长时间间隔, 如12或24小时的快照照片。这使得难以捕捉伤口闭合的动态和细胞运动的模式。
另一方面, 活细胞成像系统监测细胞迁移在一个更短的时间间隔 (30 分钟或1小时) 和在完全相同的位置, 这是不可行的图像手动拍摄。该系统是自动化的, 研究人员只需要在实验结束时输出数据。这使得有可能实时监测细胞运动的模式和伤口闭合的过程。在这项研究中, 将定量活细胞成像系统纳入伤口愈合试验中, 可以捕获动态细胞运动, 以及控制或 TIP60-depleted 细胞的伤口闭合过程。从使用活细胞成像系统拍摄的视频中, 大多数 siControl 细胞都作为附着的纸张移动, 而 TIP60-depleted 的单元格则作为孤立的单个单元移动 (图 3和图 5)。
细胞增殖和细胞死亡可能使细胞迁移的研究复杂化。因此, 在无血清培养基中进行创面愈合试验, 以尽量减少细胞增殖的影响。此外, TIP60 的击倒被优化, 以减少其对细胞存活的影响。然而, 在伤口愈合试验中, 不可能消除细胞增殖和细胞死亡的影响。这些快照只能在某一特定时间点捕捉伤口闭合, 从而无法区分伤口闭合是否是由于细胞迁移或细胞增殖。活细胞成像监测细胞迁移的动力学和跟踪单个细胞的运动, 使研究人员能够区分细胞迁移, 细胞增殖和细胞死亡。在本研究中, 单细胞追踪揭示了 siTIP60 条件下孤立单细胞的迁移路径, 而 siControl 细胞主要以片状形式移动。活细胞成像系统也捕获了集体细胞迁移的增加 (即,在 siTIP60 细胞中作为一个凝聚群迁移的细胞) 与 siControl 细胞相比。从视频中, MCF10A siTIP60 显示出更多的单细胞运动和上皮细胞片比 siControl 更快的迁移 (图 5)。
该协议中使用的各种参数需要进行优化, 以避免实验失败。首先, 短暂转染后细胞死亡的数量应小于 10%, 以尽量减少细胞迁移的影响。在这种情况下, TIP60 的耗尽可能减少细胞的存活;因此, 研究人员应该意识到这种潜在的表型, 因为它可能会使细胞迁移复杂化。为了避免这个问题, 研究人员应该优化细胞数量和数量的 siRNA 用于耗尽他们的目标基因。对于 MCF10A, 1 x 106单元与 20 nM siTIP60 是本研究的优化条件。其次, MCF10A 细胞通常是聚集的, 难以计数。细胞计数的错误可能会导致在不同条件下的初始细胞数的显著差异, 这可能是一个混杂的变量在伤口愈合的化验。为了避免这个问题, 处理 MCF10A 细胞至少20分钟. 添加完全生长培养基, 以阻止 trypsinization 和混合移上下20次, 以分散的团簇, 使其更容易计数。第三, 在被播种到24井板后, 细胞通常位于井的中心。在播种后重新挂起电池, 以确保均匀分布。在把盘子放进孵化器前来回摇晃。第四, TIP60 的耗尽使细胞间更具质性, 因而难以附着。如果发生这种情况, 把盘子放在孵化器里一段较长的时间。24小时后, 细胞通常是附着的。如果细胞还没有适当的附着, 研究人员可以使用完全生长培养基进行细胞播种, 并在细胞完全附着的时候用无血清培养基代替。这些细胞在完全媒介以后通常附有 12 h。第五, 伤口的边缘可能不平滑。增加划痕的速度, 创造平滑的边缘。第六, 伤口可能太大, 无法通过显微镜的摄像头进行可视化。使用200µL 吸管小技巧, 以较少的力量产生的伤口。或者, 针头可以用来产生较小的间隙。第七, 一些在划伤时脱落的细胞可能会因洗涤不足而重新附着在伤口上。用无血清培养基清洗水井, 而不是 PBS, 至少5次。第八, 几个洗涤后, 细胞可能开始从板块分离。然而, 为了确保分离的细胞不重新附着在伤口上, 洗涤次数不能被破坏。在这种情况下, 研究人员可以轻轻地冲洗细胞3次, 并把板在孵化器内的最长时间1小时, 让细胞安顿下来, 然后继续进行其余的洗涤。第九, 显微镜可能会失去焦点, 而图像可能在实验中途变得模糊。在显微镜周围温度的变化可能是原因, 因为温度对调整的阶段距离有轻微的影响。在开始实验之前, 研究人员应先打开显微镜和温度控制至少1小时, 以确保孵化器在调整细胞焦点之前得到预热。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
我们感谢贾实验室的成员的有益的讨论和评论。s.j 得到了新加坡国家研究基金会和新加坡教育部在其卓越研究中心倡议下向新加坡癌症科学研究所 (R-713-006-014-271) 提供的赠款, 国家医学研究理事会 ( CBRG - ;BNIG11nov001 和 CS-表意文字;R-713-000-162-511), 教育部学术研究基金 (教育部 AcRF 级 1 T1-2012 10月04日)。Y.Z.、分析和 C.Y.T. 都得到新加坡国立大学新加坡癌症科学研究所颁发的研究生奖学金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
References
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
- Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53. J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).
- Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage. Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).
- Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. Cellular functions of TIP60. Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).
- Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT. Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).
- Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity. Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).
- Sykes, S. M., et al. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction. Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).
- Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis. Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).
- Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival. J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).
- Gorrini, C., et al. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response. Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).
- Jha, S., et al. Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway. Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).
- Kim, J. H., et al. Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes. Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).
- Sakuraba, K., et al. Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer. Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).
- Subbaiah, V. K., et al. E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60. Oncogene. , (2015).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Zhang, Y., et al. TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program. J Mol Cell Biol. , (2016).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
