Summary
כאן, אנו מציגים את ניטור בזמן אמת של נדידת תאים בשיטת ריפוי פצע באמצעות תאי האפיתל של השד מדולדל TIP60 MCF10A. היישום של טכניקות הדמיה לחיות תאים בפרוטוקול שלנו מאפשר לנו נתח והמחש תא בודד תנועה בזמן אמת ולאורך זמן.
Abstract
ריפוי פצע וזמינותו יעיל ואחת הדרכים החסכונית ביותר ללמוד תא העברה בתוך חוץ גופית. כמקובל, תמונות נלקחים ב ההתחלה ואת הסוף של ניסוי בעזרת מיקרוסקופ שלב-ניגודיות, היכולות ההעברה של תאים מוערכות על-ידי סגירת פצעי. עם זאת, תנועת התא הוא תופעה דינמית, שיטה המקובלת אינה מאפשרת מעקב אחר תנועה תא בודד. כדי לשפר את מבחני ריפוי פצע הנוכחי, אנו משתמשים בטכניקות הדמיה לחיות תאים לעקוב אחר נדידת תאים בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת לנו לקבוע את קצב ההעברה תא מבוססת על תא מערכת מעקב ומספק הבחנה ברורה בין נדידת תאים והתפשטות תאים. . הנה, נדגים את השימוש הדמיה לחיות תאים של ריפוי פצע מבחני ללמוד על היכולות ההעברה שונה של תאי אפיתל כנגד השד מושפע הנוכחות של TIP60. כמו תא תנועתיות הוא דינמי מאוד, השיטה שלנו מספק יותר תובנות תהליכי ריפוי מאשר תמונה של סגירת הפצע שצולמו באמצעות טכניקות הדימות המסורתי המשמש עבור מבחני ריפוי פצע הפצע.
Introduction
HIV-טאט-אינטראקטיבי חלבון 60 kDa (TIP60) הוא acetyltransferase ליזין זה יכול acetylate היסטון והן הלא-היסטון חלבונים1,2. הפונקציות שלה נמצאים יש השלכות במשעולים איתות מרובים, כולל תמלול, תיקון נזק לדנ א של אפופטוזיס1,3,4,5,6, 7 , 8. יתר על כן, TIP60 הוא לרוב downregulated ב סרטן, ואת downregulation שלו הוא מתואם עם גרורות סרטן,9,10,11,12, שיעורי ההישרדות המסכן 13,14. גרורות הגידול הוא הגורם העיקרי של מוות מסרטן. זהו תהליך רב שלבי, השלב הראשוני של גרורות מערבת את ההעברה ואת הפלישה של תאים סרטניים לתוך לרקמות סמוכות15,16. לשם כך, תאים סרטניים תחילה יש לנתק בין המוני הגידול העיקרי, גם בצורה של גיליון תא קולקטיבי הפולש או כמו מנותק תאים בודדים17. במהלך תהליך זה, תאים סרטניים לעתים קרובות עוברים אפיתל המעבר mesenchymal (אמבולנס), וכתוצאה מכך לשינויים מורפולוגיה ותא אדהזיה יכולת17,18.
כמה טכניקות פותחו כדי ללמוד את ההעברה, הפלישה יכולת גידול של תאי במבחנה. ביניהם, וזמינותו ריפוי פצע הוא הכי יעיל וחסכוני19. ראשית, שיטה זו כרוכה היצירה של הפער המלאכותי טפט confluent של תאים, ובכך מאפשר לתאים להעביר ולסגור את הפער. שנית, ניתן ללכוד תמונות של הפערים-ההתחלה ואת הסוף של הניסוי. לבסוף, השוואה של סגירת הפער משמש כדי לקבוע את הקצב של נדידת תאים. מיקרוסקופ שלב-ניגודיות משמש בדרך כלל כדי ללכוד תמונות עבור קונבנציונאלי מבחני ריפוי פצע. יתרון נוסף של ריפוי פצע וזמינותו היא כי חלקית דומה ויוו נדידת תאים סרטניים. באופן דומה ל ויוו גרורות הגידול, נדידת תאים במבחני ריפוי פצע מציג את ההעברה קולקטיבית של גיליונות אפיתל והן את ההעברה של תאים בודדים מנותקת.
עם זאת, נדידת תאים ידוע להיות דינמי, יש צורך לתעד את התנועה של תאים בזמן אמת. למשל, וזמינותו המקובלת ריפוי פצע אינו מאפשר חוקר לנתח את התנועה תא בודד. מצד שני, תאים תרבותי עבור מבחני ריפוי פצע לעיתים קרובות מורעבים סרום כדי לעכב את התפשטות תאים. זה נעשה כדי לשלול את האפשרות של סגירת הפער עקב התפשטות תאים. למרות זאת, עדיין יהיו כמה התפשטות מוות תאי ואת שלב-ניגודיות מתמונות שצולמו לפני ואחרי הניסוי אינם מסוגלים להבחין ביניהם.
טכניקת דימות לחיות תאים מטפל ם קונבנציונאלי מבחני ריפוי פצע. באמצעות מיקרוסקופ הדמיה לחיות בשילוב עם CO2 החממה ואת בקרת הטמפרטורה המתאימה, חוקרים יכולים למדוד את גודל הפער, את קצב סגירת לאורך זמן תוך מעקב תנועת פעיל העברת תאים הממוקם בקצות חזית פולשני. לפיכך, המימוש של תאים חיים הדמיה לעקוב אחר נדידת תאים לא נספק רק כדי שתראי טוב יותר של נדידת תאים, אך יאפשר גם את האפשרות להבחין בין נדידת תאים והתפשטות תאים, ובכך מספק יותר ניתוח אמין של נדידת תאים.
במחקר זה, לתאי האפיתל של השד MCF10A שימשו כדי להדגים את השילוב של ריפוי פצע assay, תאים חיים הדמיה כדי לחקור את התפקיד של TIP60 ב נדידת תאים. דלדול של TIP60 תוצאות יכולות העברה מוגברת בתאי MCF10A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה
- להכין MCF10A תרבות בינוני: של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) / F12 (1:1) עם 5% סוסים סרום 20 ng/mL פקטורי גדילה אפיתל, 0.5 מ"ג/מ"ל הידרוקורטיזון, 100 ננוגרם למ"ל כולרה הרעלן, אינסולין µg 10/mL.
- להכין ללא סרום בינוני: DMEM/F12 (1:1) עם 20 ng/mL פקטורי גדילה אפיתל, 0.5 מ"ג/מ"ל הידרוקורטיזון, 100 ננוגרם למ"ל כולרה הרעלן אינסולין µg 10/mL.
- להשתמש ברצף siRNA הבא:
siControl:
קדימה: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
הפוך: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
siTIP60:
קדימה: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
הפוך: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3' - להשתמש בתרבות תא ס מ-10 מנות וצלחות 24-. טוב.
2. ארעי דלדול של TIP60 באמצעות siRNA
- יום 1, aliquot 15 µL של תרביות תאים ריאגנט (למשל, Lipofectamine RNAiMAX) ו- 2 מיליליטר מופחת סרום בינונית (למשל, Opti-מ) ומערבבים אותם עם 10 µL של כל siRNA (10 מיקרומטר מלאי), בהתאמה.
- דגירה התערובת בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
- זרע עונה 1 פרק 10 תאים6 MCF10A יחד עם 3 מ"ל של תרבות בינוני בקערה 10 ס מ. לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
- להוסיף את התערובת siRNA טיפה על ידי שחרור המנה 10 ס מ.
- לנער את המנה כדי להבטיח כי התאים מופצים בצורה שווה לפני לשים אותו לתוך החממה 37 º C.
- לאחר 6 שעות של דגירה, החלף המדיום המכיל siRNA 8 מ של טרי בינוני תרבות.
- יום 2, להכין עוד קבוצה של siRNA תערובות, דגירה אותם בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
- תשאף החוצה 8 מ של המדיום לתרבות הוסיף ביום 1 ולהחליף אותו עם 3 מ"ל של מדיום תרבות טריים.
- להוסיף הקבוצה השנייה של תערובת siRNA המנות טיפה על ידי ירידה. לנער את הכלים על מנת להבטיח כי ריאגנטים מעורבבים באופן מלא לפני ומכניסים אותם לתוך החממה.
- לאחר 6 שעות, החלף המדיום המכיל siRNA 8 מ של טרי בינוני תרבות.
3. זרע תאים עבור וזמינותו ריפוי פצע
- יום 3, למחוק את המדיום ולשטוף את התאים פעם אחת עם 2 מ"ל באגירה פוספט מאגר (PBS) מלוחים. לבטל את המאגר PBS.
- Trypsinize את siControl ואת התאים siTIP60 שטופלו על-ידי הוספת 1 מ"ל של 1 x טריפסין-EDTA מאגר לצלחת. תכניס אותו בחזרה החממה במשך 20 דקות.
- להוסיף 4 מיליליטר בינוני תרבות שלמה כל צלחת, resuspend את התאים על ידי pipetting, וכן להעביר אותם ל צינור 15-mL.
- צנטריפוגה-200 גרם במשך 5 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.
- מחדש להשעות את התאים עם 5 מיליליטר בינונית ללא סרום ולספור את התאים באמצעות hemocytometer.
- להתכונן תא השעיה של 6 x 105 תאים למ"ל siControl והן siTIP60; ודא כי התאים נמצאים מעורבב היטב. להוסיף 500 µL של התליה תא אחד טוב של צלחת 24-טוב כדי להבטיח 100% confluency. זרע בארות 5 עד 6 כל עבור siControl ו- siTIP60.
- לנער בעדינות את צלחת הלוך ולאחר מכן מצד לצד כדי להבטיח הפצה אפילו. הימנע תנועה מעגלית. השאירו את הצלחת החממה במשך 24 שעות ביממה.
- לקצור את התאים הנותרים כדי לבדוק את יעילות תמונות ציפורים TIP60. כדי לעשות זאת, centrifuge התליה תא הנותרים-200 גרם במשך 5 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.
- לבודד RNA באמצעות תגובה כימית מסחרי, הפרוטוקול של היצרן, והמשך PCR כמותי בזמן אמת כדי להעריך את היעילות תמונות ציפורים.
4. ליצור את הפצע
- בדוק במיקרוסקופ ניגוד שלב על מנת להבטיח כי התאים מחוברים באופן מלא. לבחון את התאים במיקרוסקופ (4 X 10 X, 20 X הגדלה) כדי להבטיח התאים מחוברים באופן מלא טפט confluent של תאים הקימה.
הערה: תאים siControl לצרף בדרך כלל טוב יותר תאים siTIP60. זה צפוי כי דלדול של TIP60 גורם לתאים mesenchymal כמו עוד20. כאן, נעשה שימוש במיקרוסקופ ניגוד benchtop רגילה שלב אור לבן. - כדי להפיק את הפצע, לגרד בעדינות בקו ישר על פני המרכז של הבאר עם טיפ פיפטה 200 µL; האורך של הפצע שנוצר הוא בדיוק כמו הקוטר של הבאר. חזור על שלב זה עבור כל בארות הנותרים. השתמש טיפ פיפטה חדש עבור כל טוב.
- בעדינות לשטוף כל טוב 5 פעמים שימוש ללא סרום בינוני כדי להסיר תאים מנותקת.
- להוסיף 1 מ"ל של מדיום ללא סרום כל טוב והמשך הדמיה לחיות תאים.
5. כיוונון של הדמיה לחיות תאים
- הפעלת המיקרוסקופ, בקרת טמפרטורה לפחות שעה לפני הגדרת לחיות תאים הדמיה כדי לוודא הטמפרטורה בתא יגיע 37 מעלות צלזיוס.
- הפעל את אספקת גז פחמן דו-חמצני (CO2) לפני שמתחילים את הדמיה לחיות תאים. הגדר CO2 ריכוז 5%.
- למקם את הצלחת 24-טוב על הבמה של המיקרוסקופ ובחר את העדשה המטרה עם 10 X הגדלה עבור הדמיה. לכוון האור הנפלט עיניות במקום המצלמה והתאימו את המוקד כדי לאתר את הפצע והתאים סביבו.
הערה: במקרה זה, אור לבן עם ניגודיות שלב שימש. - להשתמש במערכת הצופה לחיות תאים כדי לסמן את המיקום של הפצע כל טוב.
הערה: השלב אוטומטיות של מערכת הדמיה לחיות תאים מאפשרת ייבוא תמונות מרובות ומעמדות. תמונות נלקחים על המיקום מסומן כל פעם בכל פרק זמן. - להגדיר את התנאי זמן: 1 h מרווח הזמן ואת משך 72 h; על פי הגדרה זו, המערכת תיקח תמונות במיקום מסומנים כל כל שעה במשך 72 ה להגדיר את מרווח הזמן הרצויים ותקופת לניטור.
הערה: כאן, משך זמן של 72 h הוא הטוב ביותר כי תאים אלה יתחילו למות לאחר 72 h במדיום נטול סרום.
6. מעקב אחר תנועה תא בודד
- יצא את הנתונים לאחר ה 72 לייצא את הנתונים כמו תמונות בתבנית JPEG וכן קטעי וידאו בפורמט AVI.
הערה: זה חשוב כי התוכנה ImageJ רק יכול לזהות קטעי וידאו בפורמט AVI. המהירויות נדידת תאים שונים בין תאים siTIP60 ו- siControl יכול להיות שנצפו בבירור את הוידאו. - פתח את וידאו AVI בתוכנה ImageJ.
- פתח את התוסף MTrackJ (התוסף בטח יורדו ויותקנו בנפרד): תוספים > MtrackJ.
- הוסף מסלול תאים בודדים שנבחרו מן הווידאו על-ידי לחיצה על הכרטיסיה 'הוסף' בסרגל הכלים MtrackJ. בחר תא בקצה הקדמי פולשנית תא יכול להעביר בכוחות עצמו (תא בודד העברה). לעקוב אחר התנועה של התאים שבחרת על הוידאו ולאתר אותם באמצעות MtrackJ.
- למדוד את המרחק של התנועה על-ידי לחיצה על הכרטיסיה "מדידה" בסרגל הכלים.
הערה: כאן, כמעט לא התאים siControl עבר כמו תאים בודדים, עושה את זה קשה למדוד את תנועת מתא בודד, ואילו רבים מן התאים siTIP60 מתנועעות כמו תאים בודדים. עם זאת, התנועה של תאים הממוקמים בחזיתו פולשנית יכול עדיין להיות במעקב ומחושבים בתאים הן siControl והן siTIP60. - לשמור את הווידאו עם שירים בפורמט AVI.
7. כימות של יכולת העברה תא
- על כימות, בחר תמונות ב- 0 h תמונות ב- h "n", איפה "n" מפנה timepoint כאשר תאים siTIP60 או siControl לחלוטין לסגור את הפצע.
הערה: כאן, 48 שעות נבחר, כמו הפצעים בתאים siTIP60 נסגרו כמעט לחלוטין. - לכמת את ההעברה אחוז שימוש ImageJ באמצעות הנוסחה הבאה: (אזור הפצע-0 h - אזור הפצע ב h "n") / אזור הפצע ב- h 0 x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
גנרל סכימה של תא מבוססת הדמיה לחיות תאים ההעברה Assay
איור 1A הוא סכימה של פרוטוקול זה. MCF10A תאים transfected עם siControl הראו מורפולוגיה אפיתל טיפוסי. לאחר דלדול של TIP60, תאים MCF10A היו mesenchymal יותר בהשוואה לתאי בקרה (איור 1B).
בחינת יעילות תמונות ציפורים TIP60
איור 2 מציג את היעילות תמונות ציפורים TIP60. רמת הביטוי של TIP60 ירדה משמעותית לאחר טיפול siTIP60. בנוסף TIP60, הביטויים של חלבונים הקשורים בהעברה תא במספר היו גם בחן20. לדוגמה, הביטוי של מולקולה אדהזיה אפיתל (EpCAM), המהווה סמן אפיתל, היה ירד, ואילו הביטויים של Fibronectin (FN1), SNAIL2 (SNAI2), אשר הם שני מנהלי ההתקנים החובשים, היו גדל על דלדול של TIP60. נתונים אלו מראים כי רמות TIP60 בתאים MCF10A המשמש הדמיה לחיות תאים הצטמצם במידה מספקת.
דלדול של TIP60 משנה את הדינמיקה של נדידת תאים
איור 3 מראה קטעי וידאו שצולמו על תאים siControl ו- siTIP60. קטעי וידאו מראים בבירור העברה לתא מהיר של siTIP60 לעומת siControl. מלבד זאת, הבדל הדינמיקה של נדידת תאים בין תאים siControl ו- siTIP60 נצפתה גם (קרי, siControl תאים עברה כמו סדין, ואילו תנועת תא בודד יותר נצפתה בתאים siTIP60).
לודיג נדידת תאים לאחר TIP60 נוקאאוט
איור 4 מראה כימות של נדידת תאים עבור תאים siControl ו- siTIP60. אחוז תאים שהועברו גדל באופן משמעותי לאחר דלדול של TIP60.
TIP60 דלדול משנה את הדפוס של נדידת תאים
איור 5 מציג קטעי וידאו מעקב תא בודד התנועה. רוב התאים siControl מועברים באופן קולקטיבי כחלק תא גליונות והעברה רק שני תאים הראה מתא בודד, ואילו רוב התאים siTIP60 הראה ההעברה תא בודד. השינויים בתבנית של נדידת תאים מציינים שיש תאים עם TIP60 מדולדל פנוטיפ יותר mesenchymal.
איור 1: ניסיוני סקירה ותמונות נציג. סכימה (A) של הפרוטוקול. (B) להחליפן בתמונות של תאים MCF10A transfected עם siControl או siTIP60. MCF10A תאים מראים על מורפולוגיה יותר mesenchymal לאחר דלדול של TIP60. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: TIP60 הייתה דלה ביעילות לאחר תרביות תאים siTIP60. PCR כמותי בזמן אמת שימש כדי לבדוק את רמת הביטוי של TIP60, EpCAM, FN1ו SNAI2. הרנ א סה כ היה מבודד באמצעות ריאגנט Trizol הייצור של הפרוטוקול. 2 µg של RNA הכולל של כל מדגם שימש כדי להפוך cDNA. התוצאות מיוצגים בשם הקיפול-השינוי. אקטין שימש של בקרה פנימית. שגיאה בר מציין את סטיית התקן של פחות 3 ניסויים עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: סרטי הדמיה לחיות תאים של תאי siControl ו- siTIP60 להציג דפוסים שונים של תנועת התא. מרווח הזמן היה מוגדר 1 h, משך הזמן היה 72 h. הסרטון צולם באמצעות משקיף לחיות תאים Zeiss. אנא לחץ כאן כדי להוריד קטעי וידאו אלה.
איור 4: כימות של האחוז של נדידת תאים. (א) להחליפן בתמונות, התקבלו סרטי הדמיה לחיות תאים. תמונות שצולמו 0 h ו- 48 h שימשו. (B) כימות של האחוז של נדידת תאים בתוך 48 שעות נעשה שימוש בתוכנת ImageJ באמצעות הנוסחה הבאה: (אזור הפצע-0 h - אזור הפצע ב h "n") / אזור הפצע ב- h 0 x 100. שורת שגיאה מציינת את סטיית התקן של פחות שלושה ניסויים עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: סרטי הדמיה לחיות תאים להציג את המעקב אחר תנועת התא היחיד. הקווים הצבעוניים הצג מסלול הנדידה של כל תא בודד שנבחר מבודד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קטעי וידאו אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זה ידוע כי בתהליך נדידת תאים, התאים יכול ולהעביר בצורה של חסיד גיליונות; אשכולות חופשי; או תאים בודדים, מבודדים. מצב ואת הדינמיקה של הפלישה תא יכול להשתנות ממצב אחד למשנהו, ולשנות פנוטיפ בתוך שעות. וזמינותו ריפוי פצע המסורתית מבוססת על תמונה תמונות שנלקחו מיקרוסקופ עם מרווח זמן, כגון 12 או 24 שעות. זה מקשה ללכוד את הדינמיקה של סגירת הפצע ואת התבנית של התא תנועות.
מצד שני, מערכות הדמיה לחיות תאים לפקח על נדידת תאים מעל הרבה למרווח זמן קצר יותר (30 דקות או 1 h) ובבית באותה התנוחה, וזה לא ריאלי עבור תמונות שצולמו באופן ידני. המערכת היא אוטומטית, חוקרים רק צריך לייצא את הנתונים בסוף הניסויים. זה מאפשר לעקוב אחר התבנית של תנועת התא ואת התהליך של סגירת הפצע בזמן אמת. במחקר זה, מאפשר שיתוף של מערכת הדמיה לחיות תאים כמותיים מבחני ריפוי פצע לכידתו של תנועת התא דינמי, כמו גם את תהליך סגירת הפצע שליטה או מדולדל TIP60 תאים. מ וידאו שצולמו באמצעות מערכת הדמיה של תאים חיים, רוב התאים siControl עבר כמו גיליון חסיד, ואילו תאים מדולדל TIP60 מתנועעות כמו תאים בודדים מבודדת (איור 3 ואיור 5).
התפשטות תאים ומוות תא עלול לסבך את המחקר של נדידת תאים ב וזמינותו ריפוי פצע. לכן, וזמינותו ריפוי פצע מתבצע ללא סרום בינוני כדי לצמצם את ההשפעה של התפשטות תאים. כמו כן, נוקאאוט של TIP60 היה מותאם כדי לצמצם את ההשפעה על הישרדות cell. עם זאת, אי אפשר לחסל את ההשפעות של התפשטות תאים, מוות של תאים במבחני ריפוי פצע. הצילומים יכולים רק הסגר לכידת פצע בנקודה מסוימת בזמן, שהופך אותו בלתי. אפשרי להבחין בין אם סגירת הפצע היה עקב נדידת תאים או התפשטות תאים. הדמיה לחיות תאים מנטרת את הדינמיקה של נדידת תאים ועוקבת תנועה תא בודד, באפשרם חוקרים לבידול נדידת תאים התפשטות תאים, מוות של תאים. במחקר זה, מעקב תא בודד חשף את נתיב הנדידה של תאי יחידה מבודדת בתנאי siTIP60, בעוד siControl תאים עברה בעיקר בצורה של גליונות. מערכת הדמיה לחיות תאים נתפס גם עלייה נדידת תאים קולקטיבית (קרי, התאים היגרו כקבוצה מלוכדת) בתאים siTIP60 בהשוואה לתאים siControl. מהסרטים, MCF10A siTIP60 הראו יותר מתא בודד תנועות והעברה מהירה יותר של תאים אפיתל גיליונות בהשוואה siControl (איור 5).
פרמטרים שונים בשימוש פרוטוקול זה צריך להיות מותאם כדי למנוע כשל ניסיוני. ראשית, מספר מקרי המוות תא לאחר תקנים ארעי צריך להיות פחות מ- 10% כדי למזער את ההשפעה על נדידת תאים. במקרה זה, דלדול של TIP60 עשויה להפחית את הישרדות cell; לפיכך, חוקרים צריכים להיות מודעים של פנוטיפ פוטנציאלית זו, כמו זה עלול לסבך את נדידת תאים. כדי להימנע מבעיה זו, החוקרים צריכים לייעל את המספר והכמות של siRNA נהגתי לרוקן את ג'ין היעד שלהם. MCF10A, עונה 1 פרק 106 תאים עם 20 ננומטר siTIP60 היה התנאי ממוטבת במחקר זה. שנית, תאים MCF10A לעיתים קרובות לספור מקובצים באשכולות וקשה. שגיאות תא ספירת עלול להוביל הבדל משמעותי במספרים תא הראשונית על פני מצבים שונים, וזה יכול להיות מבלבלים משתנה בתהליך מבחני ריפוי פצע. כדי להימנע מבעיה זו, trypsinize MCF10A תאים עבור פחות 20 דק. הוסף מדיום הגידול מלאה כדי לעצור את trypsinization ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה 20 פעמים כדי לפזר כגיהנום וכדי להקל לספור. שלישית, תאים בדרך כלל במרכז היטב לאחר להיות נזרע לצלחת 24-. טוב. מחדש להשעות את התאים לאחר זריעה כדי להבטיח ריפודי כתופיים. לנער את הצלחת אחורה וקדימה, לצד לפני לשים אותו לתוך החממה. רביעית, דלדול של TIP60 הופך את התא mesenchymal יותר ויותר וכך לצרף. אם זה קורה, להשאיר את הצלחת בחממה לתקופה ארוכה יותר של זמן. לאחר 24 שעות, התאים מחוברים בדרך כלל. אם התאים מחוברים עדיין לא כראוי, חוקרים יכולים להשתמש מדיום הגידול מלאה עבור תא זריעה ולהחליף אותו עם בינונית ללא סרום כאשר התאים מחוברים באופן מלא. תאים אלה מחוברים בדרך כלל לאחר 12 שעות במדיום מלאה. חמישית, קצה הפצע עלול לא להיות חלקה. מגבירים את המהירות של גירוד כדי ליצור קצוות חלקים. שישית, הפצע יכול להיות גדול מדי בכדי להמחיש באמצעות המצלמה של המיקרוסקופ. השתמש בעצות 200 של פיפטה µL עם פחות כוח כדי להפיק את הפצע. לחלופין, מחט יכול לשמש כדי ליצור פער קטן יותר. השביעית, כמה תאים זה מנותק במהלך מגרד מחדש עשויה לצרף הפצע בשל שוטף לא מספיקות. לשטוף את בארות בינונית ללא סרום במקום PBS לפחות 5 פעמים. ח' תאים עשוי להתחיל להתנתק מהצלחת לאחר כמה שוטף. עם זאת, מספר שוטף אי אפשר להתפשר על מנת להבטיח כי תאים מנותקת לא מחדש לצרף הפצע. במקרה זה, חוקרים יכול לשטוף את התאים בעדינות 3 פעמים ולהשאיר את הצלחת בתוך החממה במשך זמן מרבי של h 1 לתת את התאים להתיישב לפני שתמשיך את שאר שוטף. התשיעי המיקרוסקופ עלול לאבד פוקוס, התמונות עלול להיות מטושטשת באמצע הדרך דרך הניסוי. שינוי הטמפרטורה סביב המיקרוסקופ עשוי להיות הסיבה, כמו טמפרטורה יש השפעה קטנה על המרחק הבמה מנוכי עונתיות. החוקרים צריכים להפעיל את המיקרוסקופ, בקרת טמפרטורה לפחות שעה לפני תחילת הניסוי כדי להבטיח כי החממה הוא להתחמם לפני התאמת המיקוד על תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים חברי המעבדה Jha דיון מועיל וההערות שלהם. סניף נתמך על ידי מענקים קרן מחקר נבחרת סינגפור, סינגפור משרד החינוך תחת שלו מרכזי מחקר ביוזמת מצוינות סרטן המדע מכון של סינגפור (R-713-006-014-271), נבחרת רפואי מועצת המחקר (CBRG-כוש; BNIG11nov001 ו CS-IRG; R-713-000-162-511), קרן מחקר אקדמי משרד החינוך (T1 AcRF Tier 1 מו-2012 Oct -04). Y.Z., G.S.C. ו- C.Y.T. נתמכו על ידי מלגת תואר שני הוענק על ידי סרטן המדע מכון של סינגפור, באוניברסיטה הלאומית של סינגפור.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
References
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
- Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53. J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).
- Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage. Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).
- Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. Cellular functions of TIP60. Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).
- Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT. Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).
- Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity. Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).
- Sykes, S. M., et al. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction. Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).
- Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis. Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).
- Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival. J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).
- Gorrini, C., et al. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response. Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).
- Jha, S., et al. Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway. Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).
- Kim, J. H., et al. Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes. Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).
- Sakuraba, K., et al. Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer. Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).
- Subbaiah, V. K., et al. E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60. Oncogene. , (2015).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Zhang, Y., et al. TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program. J Mol Cell Biol. , (2016).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
