Summary
Здесь мы представляем, мониторинг в реальном времени миграции клеток в assay ранозаживляющее, с использованием обедненного TIP60 MCF10A эпителиальных клеток молочной железы. Осуществление методы визуализации живой клетки в нашем протокол позволяет нам анализировать и визуализировать одной ячейки движения в режиме реального времени и во времени.
Abstract
Ранозаживляющее assay является эффективным и один из самых экономичных способов для изучения миграции клеток в пробирке. Условно изображения взяты в начале и в конце эксперимента с помощью микроскопа фазово контрастной и миграции способности клеток оцениваются путем закрытия раны. Однако движение клеток динамичное явление, и обычный метод не позволяет для отслеживания движения одной ячейки. Для улучшения текущих анализов, ранозаживляющее, мы используем методы визуализации клеток для мониторинга миграции клеток в режиме реального времени. Этот метод позволяет нам определить коэффициент миграции клеток, основанный на ячейке, системы слежения и обеспечивает более четкое различие между клеток миграции и пролиферации клеток. Здесь мы демонстрируем использования изображений живой клетки в ранозаживляющим анализов для изучения миграции различных способностей эпителиальных клеток молочной железы под влиянием присутствия TIP60. Как клетки моторики весьма динамичен, наш метод обеспечивает более понимание процессов заживления чем снимок закрытия РАН с традиционные методы визуализации используется для заживления ран анализов.
Introduction
ВИЧ-ТАТ интерактивная белков 60 кДа (TIP60) является лизин Ацетилтрансфераза, который может acetylate гистона и -гистоны1,2. Его функции находятся будет иметь последствия в нескольких сигнальных путей, включая транскрипции, ремонт повреждения ДНК и апоптоз1,3,4,5,6, 7 , 8. Кроме того, TIP60 часто downregulated в рака и его Даунрегуляция коррелируется с метастазами рака и бедных выживание ставки,9,10,11,12 13,14. Метастазы опухоли является основной причиной смерти, связанных с раком. Это многоэтапный процесс, и первый шаг метастазов включает миграции и вторжение опухолевых клеток в прилегающих тканей15,16. Для того, чтобы сделать это, опухолевые клетки сначала необходимо отсоединить от массы первичной опухоли, либо в форме коллективно вторжение ячейку листа или как отдельный единичных клеток17. В ходе этого процесса опухолевые клетки часто проходят эпителиальных мезенхимальных перехода (EMT), что привело к изменениям в морфологии и ячейки адгезии возможности17,18.
Были разработаны несколько методы для изучения миграции и вторжения способность опухолевых клеток в пробирке. Среди них-заживление assay является наиболее эффективным и экономичным19. Во-первых этот метод предполагает создание искусственного разрыв на вырожденная монослое клеток, таким образом позволяя клетки мигрировать и разрыва. Во-вторых может быть захвачен изображения пробелы в начале и в конце эксперимента. Наконец сравнение разрыва используется для определения скорости миграции клеток. Микроскопом фазово контрастной обычно используется для захвата изображения для обычных анализов, ранозаживляющим. Еще одно преимущество-заживление пробирного является, что он частично напоминает в естественных условиях миграции опухолевых клеток. Аналогично в естественных условиях метастазов опухоли клеток миграции в заживление анализы показывает коллективного миграцию эпителия листов и миграции отдельностоящий одиночных клеток.
Однако миграции клеток, как известно, быть динамичным, и существует необходимость в документе движение клеток в режиме реального времени. Например обычные ранозаживляющим пробирного не позволяют исследователем для анализа движения одной ячейки. С другой стороны клетки культивировали для заживления ран анализов зачастую голодали сыворотки ингибировать пролиферацию клеток. Это делается для исключает возможность разрыва вследствие пролиферации клеток. Тем не менее будет по-прежнему существовать некоторые распространения и гибель клеток и фазово контрастной снимки, сделанные до и после эксперимента не в состоянии провести различие между ними.
Тепловизионная техника клеток устраняет это ограничение обычных анализов, ранозаживляющим. С помощью микроскопа жить изображений в сочетании с CO2 инкубатора и контроля соответствующей температуры, исследователи могут измерять размер интервала и ее показатель закрытия с течением времени, в то время как отслеживание движения активно переход клеток расположен на советы инвазивные фронт. Следовательно осуществление-клеток imaging для мониторинга миграции клеток не только обеспечивают лучшую визуализацию миграции клеток, но будет также предусмотрена возможность различать клеток миграции и пролиферации клеток, обеспечивая тем самым более надежный анализ миграции клеток.
В этом исследовании MCF10A эпителиальных клеток молочной железы были использованы продемонстрировать сочетание ранозаживляющим пробирного и изображений для изучения роли TIP60 в ячейке миграции клеток. Истощение TIP60 приводит к способности рост миграции в MCF10A клетках.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка
- Подготовка MCF10A питательной среды: Дульбекко изменение средних орла (DMEM) / F12 (1:1) с 5% лошадь сыворотки, 20 нг/мл эпителиального фактора роста, гидрокортизон 0.5 мг/мл, 100 нг/мл холеры токсин и 10 мкг/мл инсулина.
- Подготовить сыворотки бесплатно средний: DMEM/F12 (1:1) с 20 нг/мл эпителиального фактора роста, гидрокортизон 0.5 мг/мл, 100 нг/мл холеры токсин и 10 мкг/мл инсулина.
- Используйте следующую последовательность siRNA:
siControl:
Вперед: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
Реверс: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
siTIP60:
Вперед: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
Реверс: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3' - Использование 10-см клетки культуры блюда и 24-ну плиты.
2. Переходное истощение TIP60 с использованием малых интерферирующих РНК
- День 1 аликвота 15 мкл Реагента трансфекции (например, Lipofectamine RNAiMAX) и 2 мл сокращение сыворотке среднего (например, Opti-MEM) и смешайте их с 10 мкл каждого интерферирующей РНК (акции 10 мкм), соответственно.
- Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Семена, 1 x 10-6 MCF10A клетки вместе с 3 мл питательной среды в 10 см блюдо. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева.
- Добавьте смесь siRNA по капле на 10 см блюдо.
- Встряхните блюдо, чтобы обеспечить, что клетки, равномерно распределенных до сдачи его в инкубаторе 37 ° C.
- После 6 часов инкубации замените малых интерферирующих РНК содержащих среднего 8 мл свежей питательной среды.
- На 2 день подготовить еще одну партию siRNA смесей и инкубировать их при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Аспирационная, 8 мл культуры среднего добавлен на 1 день и заменить его с 3 мл свежей питательной среды.
- Добавьте вторую партию siRNA смесь блюд по капле. Встряхните блюда для обеспечения что реагенты смешиваются полностью до сдачи их в инкубаторе.
- После 6 часов замените малых интерферирующих РНК содержащих среднего 8 мл свежей питательной среды.
3. Семена клетки для Assay заживление ран
- На 3 день отказаться от среднего и вымыть клетки один раз с 2 мл фосфат амортизированное saline (PBS) буфера. Удалить в буфер PBS.
- Trypsinize siControl и siTIP60-лечение клетки, добавив 1 мл 1 x трипсина ЭДТА буфера к пластине. Положил его обратно в инкубаторе для 20 мин.
- Добавьте 4 мл полной питательной среды для каждой пластины, Ресуспензируйте клетки, закупорить и передавать их на 15 мл.
- Центрифуга на 200 г на 5 мин и удалить супернатант.
- Вновь приостановить клетки с 5 мл сыворотки свободной среды и подсчитать количество ячеек с помощью Горяева.
- Готовят суспензию клеток 6 x 105 клеток/мл для siControl и siTIP60; Убедитесь, что клетки перемешанных. Добавьте 500 мкл суспензии клеток одной скважиной 24-ну пластины для обеспечения 100% confluency. Семена 5-6 скважин для siControl и siTIP60.
- Осторожно встряхните пластины взад и вперед, а затем стороны в сторону, чтобы обеспечить равномерное распределение. Избегайте круговое движение. Оставьте пластину в инкубаторе для 24 h.
- Урожай оставшиеся ячейки для проверки нокдаун эффективности TIP60. Чтобы сделать это, центрифуга оставшиеся суспензию клеток на 200 г на 5 мин и удалить супернатант.
- Изолировать РНК с помощью коммерческих реагента, после производителя протокол и приступить к количественной ПЦР в реальном времени для оценки эффективности нокдаун.
4. Создайте раны
- Проверить под микроскопом контраст этапа для обеспечения полностью прилагается клетки. Наблюдать за клетки под микроскопом (4 X, 10 X и 20 X увеличение) для обеспечения, что клетки полностью привязаны, что сформировалась вырожденная монослоя клеток.
Примечание: siControl клетки обычно придают лучше чем siTIP60 клетки. Ожидается, что это потому, что истощение TIP60 делает клетки более мезенхимы как20. Здесь используется обычный benchtop белый свет фазы контраста Микроскоп. - Для создания рану, аккуратно скретч прямую линию по центру скважины с кончиком пипетки 200 мкл; длина созданного раны же как диаметр скважины. Повторите этот шаг для всех оставшихся скважинах. Используйте новый наконечник пипетки для каждой скважины.
- Осторожно промыть каждый хорошо 5 раз с использованием сыворотки свободный средних удалить отдельные клетки.
- Добавить 1 мл сыворотки свободной среды в каждой скважины и провести клеток.
5. Установка клеток
- Включите микроскопом и температурного контроля по крайней мере 1 час перед настройкой-клеточной воображения, чтобы гарантировать, что температура в камере достигает 37 ° C.
- Включите подачу газа двуокиси углерода (CO2) перед началом визуализации клеток. Задайте CO2 концентрации 5%.
- Место пластину 24-хорошо на сцене микроскопа и выберите объектив с 10 крат для воображения. Прямые испускаемого света для окуляров вместо камеры и настроить фокус, чтобы найти рану и клетки вокруг него.
Примечание: В этом случае, белый свет с Фазовый контраст был использован. - Используйте систему клеток наблюдателя отметить позицию рану в каждой скважине.
Примечание: Стадии автоматизированной системы клеток позволяет для захвата изображений в нескольких позициях. Изображения взяты на все отмеченные позиции один раз каждый интервал. - Настройка состояния времени: 1 h интервала и продолжительность 72 ч; Согласно этой настройки, система будет принимать фотографии на каждом помеченную позицию каждый час в течение 72 ч. Настройка любой желаемый временной интервал и период для мониторинга.
Примечание: Здесь, в течение 72 ч лучше потому что эти клетки начинают умирает после 72 ч в среде, свободной от сыворотки.
6. отслеживать движение одной ячейки
- Экспорт данных после 72 ч. экспортировать данные как изображения в формате JPEG, так и видео в формате AVI.
Примечание: Это важно, потому что ImageJ программного обеспечения можно признать только видео в формате AVI. Скорости миграции различных клеток между siTIP60 и siControl клетки можно ясно наблюдать в видео. - Откройте видео AVI в ImageJ программного обеспечения.
- Открыть MTrackJ плагин (плагин должны быть загружены и установлены отдельно): Плагины > MtrackJ.
- Добавление дорожки для одиночных клеток, выбраны из видео, нажав на вкладку «Добавить» на панели инструментов MtrackJ. Выберите ячейку на кончике инвазивных фронта и ячейки, можно перенести на свой собственный (сингл клеточной миграции). Следовать за движением выбранной ячейки на видео и отслеживать их с помощью MtrackJ.
- Измерьте расстояние движения, нажав на вкладку «измерения» на панели инструментов.
Примечание: Здесь, почти не клетки в siControl переехал в качестве единичных клеток, что делает его трудным для измерения движения одной ячейки, в то время как многие из клеток siTIP60 переехал в качестве единичных клеток. Однако движение клеток на инвазивные передней еще можно проследить и рассчитывается в клетках siControl и siTIP60. - Сохраните видео с треков в формате AVI.
7. Количественная оценка способности миграции клеток
- Для количественной оценки выберите изображения на 0 h и изображения h «n», где «n» относится к timepoint, когда siTIP60 или siControl клетки полностью закрыли рану.
Примечание: Здесь, 48 h был выбран, как раны в siTIP60 клетках были почти полностью закрыт. - Количественно определить процент миграции с помощью ImageJ по следующей формуле: (область раны на 0 h - область раны на «n» h) / область раны на 0 h x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Генеральная схема Assay переноса жить-на основе визуализации ячеек
Рисунок 1A является схема настоящего Протокола. Transfected клеток MCF10A с siControl, показан типичный эпителиальных морфологии. После истощения TIP60 MCF10A клетки были более мезенхимальных по сравнению с контролем клеток (рис. 1B).
Изучение эффективности TIP60 нокдаун
Рисунок 2 показывает эффективность TIP60 нокдаун. TIP60 выражение уровня значительно сократилось после siTIP60 лечения. В дополнение к TIP60 выражения нескольких связанных с миграцией белков клетки были также рассмотрены20. Например, выражение эпителиальных Межмицеллярная молекула (EpCAM), который является маркер эпителия, уменьшилось, в то время как выражения фибронектина (FN1) и SNAIL2 (SNAI2), которые являются оба драйвера EMT, были увеличены на истощение TIP60. Эти данные позволяют предположить, что TIP60 в MCF10A ячеек, которые используются для клеток были достаточно сократить.
Истощение TIP60 меняет динамику миграции клеток
Рисунок 3 показывает видео, принятых для siControl и siTIP60 клетки. Видео ясно показывают быстрее миграции клеток siTIP60, по сравнению с siControl. Помимо этого разница в динамической миграции клеток между siControl и siTIP60 клетки было также отмечено (то есть, siControl клетки переехал как лист, тогда как более одной ячейки движения наблюдался в siTIP60 клетках).
Увеличение миграции клеток после TIP60 нокдаун
Рисунок 4 показывает количественная оценка миграции клеток для siControl и siTIP60 клетки. После истощения TIP60 значительно увеличилась доля миграции клеток.
TIP60 Истощение изменяет шаблон ячейки миграции
Рисунок 5 показывает видео отслеживания движения одной ячейки. Большинство из siControl клеток коллективно мигрировали в рамках ячеек листов и только две клетки показали одноклеточных миграции, в то время как большинство siTIP60 клеток показали одноклеточных миграции. Изменения в структуре миграции клеток указывают, что клетки с обедненного TIP60 имеют более мезенхимальных фенотип.
Рисунок 1: экспериментальный обзор и представитель изображений. (A) схема протокола. Transfected представитель изображений (B) MCF10A клеток с siControl или siTIP60. MCF10A клетки показывают более мезенхимальных морфология после истощения TIP60. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: TIP60 эффективно был исчерпан после siTIP60 transfection. Количественная ПЦР в реальном времени использовался для проверки уровня экспрессии FN1, TIP60, EpCAMи SNAI2. Общая РНК был изолирован с помощью Тризол реагент после изготовления протокол. 2 мкг всего РНК каждого образца была использована чтобы сделать cDNA. Результаты представлены как раз изменения. Актин использовался в качестве внутреннего контроля. Ошибка полоса указывает стандартное отклонение от по крайней мере 3 независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: изображений видео Live клеточной siControl и siTIP60 клеток показывают различные модели клеточного движения. Интервал времени был установлен до 1 ч и продолжительности было 72 ч. Видео было принято с помощью наблюдателя клеток Zeiss. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эти видео.
Рисунок 4: количественная оценка доли миграции клеток. (A) представитель изображения были получены из клеток изображений видео. Были использованы фотографии, сделанные в 0 ч и 48 ч. Количественная оценка (Б) процент миграции клеток в течение 48 часов было сделано с помощью программного обеспечения ImageJ, по следующей формуле: (область раны на 0 h - область раны на «n» h) / область раны на 0 h x 100. В баре ошибка указывает стандартное отклонение от по крайней мере три независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Live клеточной изображений видео показывают отслеживания движения одноклеточных. Цветные линии показывают мигрирующих трек каждой выбранной изолированных одной ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эти видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Известно, что в процессе миграции клеток, клеток можно либо переместить в виде адэрентных листов; свободные кластеры; или один, изолированных клеток. Режим и динамику клеток вторжения может варьироваться от одного состояния к другому, и фенотип можно изменить в пределах часов. Традиционные ранозаживляющим пробирного основана на снимок фотографии взяты из микроскопа с длительный промежуток времени, например, 12 или 24 часа. Это делает его трудно уловить динамику закрытия ран и шаблон ячейки движения.
С другой стороны жить клеточной тепловизионных систем мониторинга миграции клеток над гораздо короче интервал (30 мин или 1 час) и в точно же положении, что не представляется возможным для снимков, сделанных вручную. Система автоматизирована, и исследователи только нужно экспортировать данные в конце экспериментов. Это делает его возможным для мониторинга процесса закрытия ран в реальном времени и шаблон ячейки движения. В этом исследовании включение изображений системы количественных клеток в ранозаживляющим анализов позволяет захвата динамический клеточного движения, а также процесс закрытия ран в элементе управления или обедненного TIP60 клетки. От видео, снятых с использованием клеток тепловизионной системы большинство клеток siControl переехал в своем качестве адэрентных лист, тогда как клетки истощены TIP60 переехал в качестве изолированных единичных клеток (рис. 3 и рис. 5).
Пролиферация клеток и клеточной смерти может осложнить изучения миграции клеток в assay, ранозаживляющим. Таким образом ранозаживляющим генотипирования в сыворотке бесплатно средних и свести к минимуму эффект пролиферации клеток. Кроме того сногсшибательно TIP60 был оптимизирован для уменьшения ее воздействия на выживание клетки. Однако это невозможно для устранения влияния пролиферации клеток и клеточной гибелью в ранозаживляющим анализов. Снимки можно только закрытие захвата ранение в определенный момент времени, что делает невозможным различать ли закрытие раны из-за миграции клеток или пролиферации клеток. Клеток отслеживает динамику миграции клеток и отслеживает движения отдельных клеток, что делает его возможным для исследователей, чтобы отличить миграции клеток от пролиферации клеток и клеточной смерти. В этом исследовании одноклеточных отслеживания показал путь миграции изолированные отдельные ячейки в siTIP60 состоянии, в то время как siControl клетки главным образом переехал в виде листов. Система электронного фотографирования живой клетки также захватили увеличение миграции коллективные клетки (то есть, когда клетки переносятся как сплоченной группы) в siTIP60 клетках, по сравнению с siControl клеток. От видео MCF10A siTIP60 показали более одной ячейки движения и быстрее миграции эпителиальных клеток листов по сравнению с siControl (рис. 5).
Различные параметры, используемые в настоящем протоколе должны быть оптимизированы, чтобы избежать экспериментальной ошибки. Во-первых число умерших клеток после переходных трансфекции должно быть меньше 10% для сведения к минимуму воздействия на клетки миграции. В этом случае истощение TIP60 может уменьшить выживаемость клеток; Таким образом исследователи должны быть осведомлены о этой потенциальной фенотипа, поскольку это может осложнить миграции клеток. Чтобы избежать этой проблемы, исследователи должны оптимизировать мобильный номер и количество малых интерферирующих РНК, используемый для разрушающим их целевого гена. MCF10A 1 x 106 клеток с 20 Нм siTIP60 был оптимизирован условие в этом исследовании. Во-вторых MCF10A клетки часто кластеризованные и трудно подсчитать. Ошибки в клеток может привести к значительной разнице в число первоначальных клеток в разных условиях, и это может быть ужасно переменной в ранозаживляющим анализов. Чтобы избежать этой проблемы, trypsinize MCF10A клетки для по крайней мере 20 минут добавить полный рост среднего остановить trypsinization и смешивать, закупорить вверх и вниз 20 раз разогнать сгустки и чтобы сделать его проще для подсчета. В-третьих клетки находятся обычно в центре скважины после будучи посеяны к пластине 24-хорошо. Вновь приостановите клетки после посева обеспечить равномерное распределение. Shake пластину взад и вперед и бокового до сдачи его в инкубаторе. В-четвертых истощение TIP60 делает клетки более мезенхимальных и таким образом труднее прикрепить. Если это произойдет, оставьте пластину в инкубаторе для более длительного периода времени. После 24 часов клетки обычно прилагается. Если до сих пор не правильно присоединены клетки, исследователи могут использовать полный рост среднего для заполнения ячейки и заменить его сыворотки бесплатно среднего когда клетки полностью прилагается. Эти клетки обычно присоединены через 12 ч в полной среды. В-пятых края раны не может быть гладкой. Увеличить скорость царапин для создания гладких краев. В-шестых рана может быть слишком большой, чтобы визуализировать с помощью камеры микроскопа. Используйте 200 мкл наконечники с меньше силы для создания рану. Кроме того игла может использоваться для создания небольших разрыва. В-седьмых некоторые клетки которые отсоединены во время царапин может присоединить к раны из-за недостаточной смывки. Промойте скважин с сыворотка свободной среды вместо PBS по крайней мере 5 раз. В-восьмых клетки могут начать отсоединить от пластины после того, как несколько моет. Однако количество моек нельзя жертвовать тем, что отдельные ячейки не повторно придают рану. В этом случае исследователи может вымыть клетки мягко 3 раза и оставить пластину внутри инкубатора для максимальное время 1 ч чтобы успокоиться перед переходом к остальной части стирок клетки. В-девятых микроскоп может потерять фокус, и изображения могут стать размытым на полпути через эксперимент. Изменения температуры вокруг микроскоп может быть причиной, как температура имеет незначительное влияние на расстоянии скорректированные стадии. Исследователи должны повернуть на микроскопе и температурного контроля по крайней мере 1 час перед началом эксперимента, чтобы обеспечить, что инкубатор нагревается до фокусировки на клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим членов Джа лаборатории за их полезные обсуждения и представления замечаний. С.ж. была поддержана субсидии от национального исследовательского фонда Сингапура и Сингапуре Министерство образования под его исследовательскими центрами передового опыта инициативы рака науки Института Сингапура (R-713-006-014-271), национальной медицинской Научно-исследовательский совет (CBRG-Ниг; BNIG11nov001 и CS-IRG; R-713-000-162-511), фонд научных исследований министерство образования (МО AcRF Tier 1 T1-2012 Oct -04). ВМФ, G.S.C. и C.Y.T. были поддержаны аспирантов стипендии наградил Институт рака науки Сингапура, Национальный университет Сингапура.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
References
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
- Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53. J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).
- Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage. Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).
- Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. Cellular functions of TIP60. Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).
- Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT. Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).
- Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity. Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).
- Sykes, S. M., et al. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction. Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).
- Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis. Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).
- Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival. J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).
- Gorrini, C., et al. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response. Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).
- Jha, S., et al. Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway. Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).
- Kim, J. H., et al. Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes. Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).
- Sakuraba, K., et al. Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer. Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).
- Subbaiah, V. K., et al. E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60. Oncogene. , (2015).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Zhang, Y., et al. TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program. J Mol Cell Biol. , (2016).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
