Summary
Här presenterar vi de övervakning i realtid av cellmigration i en sårläkning-analys med hjälp av TIP60-utarmat MCF10A bröst epitelceller. Genomförandet av live-cell avbildningstekniker i vårt protokoll tillåter oss att analysera och visualisera encelliga rörelse i realtid och över tid.
Abstract
Sårläkning analysen är effektiv och en av de mest ekonomiska sätten att studera cell migration in vitro. Konventionellt, bilderna tas i början och slutet av ett experiment med ett faskontrastmikroskop och migration kapaciteterna av celler utvärderas av stängningen av sår. Men cell rörelse är en dynamisk företeelse och en konventionell metod tillåter inte för att spåra encelliga rörelse. För att förbättra nuvarande sårläkning analyser, använder vi live-cell avbildningstekniker för att övervaka cellmigration i realtid. Denna metod tillåter oss att fastställa vilken cell migration baserat på en cell tracking system och ger en tydligare åtskillnad mellan cellmigration och cellproliferation. Här visar vi användningen av live-cell imaging i sårläkning analyser att studera olika migration kapaciteterna av bröst epitelceller påverkas av närvaron av TIP60. Eftersom cellen motilitet är mycket dynamisk, ger vår metod mer insikter i processerna för sårläkning än en ögonblicksbild av sårslutning tagna med den traditionella imaging tekniker används för sårläkning analyser.
Introduction
HIV-Tat-interaktiv protein 60 kDa (TIP60) är en lysin kolinacetyltransferas som kan acetylate både Histon och icke-histonglykoprotein proteiner1,2. Dess funktioner finns för att få konsekvenser i flera signalvägar, inklusive transkription, DNA-skada reparation och apoptos1,3,4,5,6, 7 , 8. Dessutom TIP60 är ofta nedreglerade i cancer, och dess nedreglering är korrelerad med cancer metastaser och dålig överlevnad priser9,10,11,12, 13,14. Tumör metastasering är den största orsaken till cancerrelaterad död. Det är en process i flera steg, och det första steget av metastaser innebär migration och invasionen av tumörceller till angränsande vävnader15,16. För att göra det, tumörcellerna först måste lossa från primärtumör massan, antingen i form av ett kollektivt invaderande cell blad eller som fristående enstaka celler17. Under denna process genomgår tumörceller ofta epitelial mesenkymala övergång (EMT), vilket resulterar i förändringar i morfologi och cell adhesion kapacitet17,18.
Några tekniker har utvecklats för att studera migreringen och invasion förmåga av tumör celler in vitro. Bland dem är sårläkning analysen mest effektivt och ekonomiskt19. Första innebär metoden skapandet av en konstgjord gapet på en konfluenta enskiktslager av celler, vilket gör att cellerna att migrera och överbrygga klyftan. Andra kan bilder av luckorna fångas i början och slutet av experimentet. Avslutningsvis används en jämförelse av gap stängning för att fastställa vilken cellmigration. Ett faskontrastmikroskop används vanligen för att fånga bilder för konventionell sårbehandling analyser. En annan fördel med sårläkning analysen är att den delvis liknar i vivo tumör cellmigration. Likaså att i vivo tumör metastasering visar cellmigration i sårläkning analyser både kollektiva migration av epitelial ark och migration av fristående enstaka celler.
Dock cellmigration är kända för att vara dynamisk, och det finns ett behov av att dokumentera förflyttning av celler i realtid. Exempelvis tillåter en konventionell sårbehandling analysen inte forskare att analysera encelliga rörelse. Å andra är celler odlade för sårläkning analyser ofta serum-svalt att hämma cellproliferation. Detta görs för att utesluta möjligheten av gap nedläggning på grund av cellproliferation. Ändå, det kommer fortfarande finnas vissa proliferation och celldöd och faskontrast bilder tagna före och efter försöket är inte kan skilja mellan dem.
Den live-cell bildteknik adresser denna begränsning av konventionella sårläkning analyser. Med live-imaging Mikroskop kombinerat med en CO2 inkubator och lämplig temperaturkontroll, forskarna kan mäta gapet storleken och graden av stängning över tiden medan spåra rörelsen av aktivt migrerar celler ligger på tips av den invasiva front. Därför genomförandet av live-cell imaging för att övervaka cellmigration ger inte bara bättre visualisering av cellmigration, men kommer också göra möjligheten att skilja mellan cellmigration och cellproliferation, vilket ger en mer tillförlitlig analys av cellmigration.
I denna studie användes MCF10A bröst epitelceller att demonstrera kombinationen av sårläkning assay och live-cell imaging för att studera rollen som TIP60 i cellmigration. Utarmning av TIP60 resulterar i ökad migration förmågor i MCF10A celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning
- Förbereda MCF10A odlingsmedium: Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) / F12 (1:1) med 5% häst serum, 20 ng/mL epitelial tillväxtfaktor, 0,5 mg/mL hydrokortison, 100 ng/mL kolera toxin och 10 µg/mL insulin.
- Förbereda serumfritt medium: DMEM/F12 (1:1) med 20 ng/mL epitelial tillväxtfaktor, 0,5 mg/mL hydrokortison, 100 ng/mL kolera toxin och 10 µg/mL insulin.
- Använd följande siRNA sekvens:
siControl:
Framåt: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
Baksida: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
siTIP60:
Framåt: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
Baksida: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3' - Använd 10-cm cell kultur rätter och 24 brunnar.
2. övergående utarmning av TIP60 med siRNA
- Dag 1, alikvotens 15 µL transfection reagens (t.ex. Lipofectamine RNAiMAX) 2 mL minskat serum medium (t.ex. Opti-MEM) och blanda dem med 10 µL av varje siRNA (10 µM lager), respektive.
- Inkubera blandningen i rumstemperatur i 20 min.
- Frö 1 x 106 MCF10A celler tillsammans med 3 mL odlingsmedium i en 10 cm skål. Räkna de celler som använder en hemocytometer.
- Lägga siRNA blandningen droppvis i 10 cm skålen.
- Skaka skålen för att säkerställa att cellerna fördelas lika innan det i 37 ° C inkubatorn.
- Efter 6 h inkubation, ersätta siRNA-innehållande medium med 8 mL färsk odlingsmedium.
- Dag 2, förbereda en annan sats av siRNA blandningar och odla dem i rumstemperatur i 20 min.
- Aspirera ut 8 mL odlingssubstrat läggas på dag 1 och ersätta det med 3 mL färsk odlingsmedium.
- Lägga till den andra omgången av siRNA blandning rätter droppe för droppe. Skaka av rätter för att säkerställa att reagenserna blandas helt innan du lägger dem i inkubatorn.
- Efter 6 h, ersätta siRNA-innehållande medium med 8 mL färsk odlingsmedium.
3. utsädet celler för sårläkning analysen
- På dag 3, kassera medium och tvätta cellerna en gång med 2 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) buffert. Kassera PBS-bufferten.
- Trypsinize de siControl och siTIP60-behandlade cellerna genom att tillsätta 1 mL 1 x trypsin-EDTA buffert till plattan. Lägga tillbaka det i inkubatorn i 20 min.
- Lägga till 4 mL komplett odlingsmedium i varje platta, Omsuspendera cellerna genom pipettering och överföra dem till en 15-mL tub.
- Centrifugera vid 200 g i 5 min och avlägsna supernatanten.
- Slamma upp cellerna med 5 mL serumfritt medium och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
- Förbered en cellsuspension på 6 x 105 celler/mL för både siControl och siTIP60; säkerställa att cellerna är väl blandad. Tillsätt 500 µL cellsuspension till en brunn 24-bra platta att säkerställa 100% konfluens. Utsäde 5 till 6 brunnar varje för siControl och siTIP60.
- Skaka försiktigt den plattan fram och tillbaka och sedan till sida-att säkerställa jämn fördelning. Undvika en cirkelrörelse. Låt plattan i inkubatorn för 24 h.
- Skörda de återstående cellerna för att kontrollera knockdown effektiviteten i TIP60. Till gör så, Centrifugera återstående cellsuspension på 200 g i 5 min och avlägsna supernatanten.
- Isolera RNA med hjälp av en kommersiell reagens, efter tillverkarens protokollet, och fortsätt att kvantitativa Realtidspcr att utvärdera knockdown effektivitet.
4. skapa såret
- Kolla under fas kontrast Mikroskop för att se till att cellerna är helt fäst. Iaktta cellerna i Mikroskop (4 X, 10 X och 20 X förstoring) se till att cellerna är helt fäst att en konfluenta enskiktslager av celler har bildats.
Obs: siControl celler vanligtvis fäster bättre än siTIP60 celler. Detta är förväntat eftersom utarmning av TIP60 gör cellerna mer mesenkymala-liknande20. Här används en normal bänkmonterade vitt ljus fas kontrast mikroskopet. - För att generera såret, försiktigt skrapa en rak linje över mitten av brunnen med en 200 µL pipettspetsen; längden på såret genereras är samma som diametern på borrhålet. Upprepa detta för alla kvarvarande brunnar. Använd en ny pipettspetsen för varje brunn.
- Försiktigt tvätta varje brunn 5 gånger med serumfritt medium att ta bort de fristående cellerna.
- Tillsätt 1 mL serumfritt medium till varje brunn och vidare till live-cell imaging.
5. inställning av Live-cell Imaging
- Slå på mikroskopet och temperaturen styra minst 1 h innan du ställer in live-cell imaging för att säkerställa att temperaturen i kammaren når 37 ° C.
- Slå på koldioxid (CO2) gasförsörjningen innan live-cell bildtagning. Ställ CO2 -koncentration till 5%.
- Placera 24-väl plattan på scenen av mikroskopet och välj målet linsen med 10 X förstoring för avbildning. Direkt utsända ljuset till okularet istället för att kameran och justera fokus för att leta upp såret och cellerna runt den.
Obs: I det här fallet, vitt ljus med faskontrast användes. - Använda ett live-cell observatör för att markera positionen för såret i varje brunn.
Obs: Automatisk scenen live-cell bildgivande systemet tillåter bild förvärv på flera positioner. En gång varje intervall tas bilder på alla markerade positioner. - Ställa in villkoret tid: 1 h intervall och 72 h varaktighet; enligt inställningen, kommer att systemet ta bilder på varje markerad position varje timme för 72 h. Ställ in någon önskat tidsintervall och period för övervakning.
Obs: Här, en varaktighet på 72 h är bäst eftersom dessa celler börjar dö efter 72 h i serumfritt medium.
6. spårning Single-cell rörelse
- Exportera data efter 72 h. exportera data både som bilder i JPEG-format och filmer i AVI-format.
Obs: Detta är viktigt eftersom ImageJ programvara kan endast känna igen videor i AVI-format. De olika cell migration hastigheterna mellan siTIP60 och siControl celler kan observeras tydligt i videon. - Öppna AVI video i programmet ImageJ.
- Öppna MTrackJ plugin (plugin måste hämtas och installeras separat): Plugins > MtrackJ.
- Lägga till ett spår för enstaka celler valt från videon genom att klicka på fliken ”Lägg till” i verktygsfältet MtrackJ. Välja en cell på spetsen av invasiva framsidan och en cell som kan migrera på egen hand (single-cell migration). Följa rörelsen av de valda cellerna på videon och spåra dem med MtrackJ.
- Mät avståndet rörlighet genom att klicka på fliken ”åtgärd” i verktygsfältet.
Obs: Här, nästan inga celler i siControl flyttade som enstaka celler, vilket gör det svårt att mäta encelliga rörelse, medan många av de siTIP60 cellerna flyttade som enstaka celler. Förflyttning av celler ligger vid invasiv fronten kan dock fortfarande spåras och beräknas i både siControl och siTIP60 celler. - Spara videon med spåren i AVI-format.
7. kvantifiering av Cell Migration förmåga
- För kvantifiering, Välj bilder vid 0 h och bilder på ”n” h, där ”n” refererar till tidpunkt när antingen siTIP60 eller siControl celler har helt stängt såret.
Obs: Här, 48 h valdes, eftersom såren i siTIP60 celler var nästan helt stängd. - Kvantifiera procent migreringen med hjälp av ImageJ med följande formel: (område av sår vid 0 h - området av såret på ”n” h) / område av sår vid 0 h x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
General schemat för Live-cell Imaging-baserade Cell Migration Assay
Figur 1A är ett schema i detta protokoll. MCF10A celler transfekterade med siControl visade typisk epitelial morfologi. Efter utarmning av TIP60 var MCF10A cellerna mer mesenkymala jämfört med kontroll celler (figur 1B).
Undersökning av TIP60 Knockdown effektivitet
Figur 2 visar TIP60 knockdown effektivitet. TIP60 uttryck sjönk betydligt efter siTIP60 behandling. Förutom TIP60 var uttryck av flera migrationsrelaterade cellproteiner också undersökta20. Till exempel uttrycket av epitelial vidhäftning molekyl (EpCAM), som är en epitelial markör, var minskade, medan uttryck av Fibronektin (FN1) och SNAIL2 (SNAI2), som är både EMT drivrutiner, ökades vid utarmning av TIP60. Dessa data tyder på att de TIP60 nivåerna i MCF10A celler används för live-cell imaging minskades tillräckligt.
Utarmning av TIP60 ändrar dynamiken i cellmigration
Figur 3 visar videor som tas för siControl och siTIP60 celler. Videor visar tydligt en snabbare cellmigration av siTIP60 jämfört med siControl. Annat än detta observerades också en skillnad i dynamiken i cellmigration mellan siControl och siTIP60 celler (dvs. siControl celler flyttade som en ark, medan mer enskild cell rörelse observerades i siTIP60 celler).
Öka i cellmigration efter TIP60 Knockdown
Figur 4 visar kvantifiering av cellmigration för siControl och siTIP60 celler. Procentandelen av migrerade celler ökade signifikant efter utarmning av TIP60.
TIP60 Utarmning ändras mönstret av cellmigration
Figur 5 visar videor spårning encelliga rörelsen. De flesta av de siControl cellerna migreras kollektivt som en del av cellen ark och endast två celler visade enskild cell migration, medan de flesta siTIP60 celler visade enskild cell migration. Förändringar i mönstret av cellmigration visar att celler med utarmat TIP60 har en mer mesenkymala fenotyp.
Figur 1: experimentell översikt och representativa bilder. (A) schemat för protokollet. (B) representativa bilder av MCF10A celler transfekterade med siControl eller siTIP60. MCF10A celler visar en mer mesenkymala morfologi efter utarmning av TIP60. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: TIP60 var effektivt utarmat efter siTIP60 transfection. Realtid kvantitativa PCR användes för att kontrollera uttrycket TIP60, EpCAM, FN1och SNAI2. Total RNA isolerades med Trizol reagens efter tillverkarens protokollet. 2 µg av den total-RNA av varje prov användes cDNA. Resultaten är representerade som en-faldig förändring. Aktin användes som intern kontroll. Felstapel anger standardavvikelsen från minst 3 oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Live-cell imaging videor av siControl och siTIP60 celler visar olika rörelsemönster cell. Tidsintervallet var inställd på 1 h och varaktighet var att 72 h. Videon togs med en Zeiss live-cell observatör. Vänligen klicka här för att ladda ner dessa videor.
Figur 4: kvantifiering av procentandelen av cellmigration. (A) representativa bilder erhölls från live-cell imaging videor. Bilder tagna vid 0 h och 48 h användes. (B) kvantifiering av procentandelen av cellmigration inom 48 h var gjort med ImageJ programvara med hjälp av följande formel: (område av sår vid 0 h - området av såret på ”n” h) / område av sår vid 0 h x 100. Felstapel anger standardavvikelsen från minst tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Live-cell imaging videor Visa spårning av encelliga rörelse. De färgade linjerna visar den flyttande spåren i varje valda isolerad cell. Vänligen klicka här för att ladda ner dessa videor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det är känt att celler håller på att cellmigration, kan antingen flytta i form av vidhäftande ark; löst kluster; eller enskild, isolerade celler. Det läget och dynamik av cell invasion kan variera från ett tillstånd till en annan, och fenotypen kan ändra inom timmar. Traditionella sårläkning analysen bygger på ögonblicksbild bilder tagna från ett Mikroskop med en lång tidsintervall, till exempel 12 eller 24 h. Detta gör det svårt att fånga dynamiken i sårslutning och mönstret av cell rörelser.
Däremot, övervaka live-cell bildsystem cellmigration över mycket kortare intervall (30 min eller 1 h) och på exakt samma position, som inte är genomförbart för bilder tagna manuellt. Systemet är automatiserat och forskare behöver bara exportera data i slutet av experimenten. Detta gör det möjligt att övervaka mönstret av cellers rörelser och processen med sårslutning i realtid. I denna studie tillåter infogandet av en kvantitativ live-cell bildsystem i sårläkning analyser för att fånga dynamiska cell rörlighet, liksom processen med sårslutning i kontroll eller TIP60-utarmat celler. Från video tagna med en live-cell bildsystem, flyttade de flesta av de siControl cellerna som en vidhäftande ark, medan TIP60-utarmat celler flyttade som isolerade enstaka celler (figur 3 och figur 5).
Celldelning och celldöd skulle komplicera studiet av cellmigration i en sårläkning-analys. Därför utförs sårläkning analysen i serumfritt medium för att minimera effekten av cellproliferation. Också, överväldigande av TIP60 har optimerats för att minska dess inverkan på cellöverlevnad. Det är dock omöjligt att eliminera påverkan av cellproliferation och celldöd i sårläkning analyser. Ögonblicksbilder kan bara fånga sår stängning vid en viss tid, vilket gör det omöjligt att urskilja huruvida sårslutning berodde på cellmigration eller cellproliferation. Live-cell imaging övervakar dynamiken i cellmigration och spårar enskild cell rörelse, vilket gör det möjligt för forskare att skilja cellmigration från cellproliferation och celldöd. I denna studie visade encelliga spårning migration sökvägen till de isolerade enstaka cellerna i siTIP60 tillstånd, medan siControl celler flyttade mestadels i form av ark. Live-cell bildgivande systemet också fångat en ökning av kollektiva cellmigration (dvs cellerna migreras som en sammanhållande grupp) i siTIP60 celler jämfört med siControl celler. Från videor, MCF10A siTIP60 visade mer encelliga rörelser och snabbare migration av epitelial cell ark jämfört med siControl (figur 5).
Olika parametrar som används i detta protokoll måste optimeras för att undvika experimentella fel. Första bör cellen dödsfallen efter övergående transfection vara mindre än 10% för att minimera effekten på cellmigration. I det här fallet kan utarmning av TIP60 minska cellöverlevnad; Därför bör forskare vara medvetna om denna potentiella fenotyp, som det kan komplicera cellmigration. För att undvika detta problem bör forskare optimera cellantal och belopp av siRNA brukade bryter ned deras målgenen. För MCF10A, 1 x 106 celler med 20 nM siTIP60 var optimerad villkoret i denna studie. Det andra är MCF10A celler ofta klustrade och svårt att räkna. Fel i blodkroppar kan leda till en betydande skillnad i inledande cell nummer över olika förhållanden, och detta kan vara en förbryllande variabel i sårläkning analyser. Undvik detta problem genom trypsinize MCF10A celler i minst 20 min. Lägg till komplett odlingsmedium att stoppa trypsinization och blanda genom att upp och ner 20 gånger att skingra klumpar och att göra det lättare att räkna med. Tredje, celler är vanligtvis i mitten av brunnen efter som dirigeras till 24-väl plattan. Slamma upp cellerna efter sådd för att garantera en jämn fördelning. Skaka plåten fram och tillbaka och från sida till sida innan du lägger in i inkubatorn. Fjärde, utarmning av TIP60 gör cellen mer mesenkymala och därmed svårare att fästa. Om detta händer, lämna plattan i inkubatorn för en längre tidsperiod. Efter 24 h, är cellerna vanligen fästade. Om cellerna är fortfarande inte ordentligt fastkopplad, kunde forskarna använda komplett odlingsmedium för cell sådd och ersätta det med serumfritt medium när cellerna är fullt anslutna. Dessa celler är oftast knutna efter 12 h i komplett medium. Kanten av såret kanske femte, inte slät. Öka hastigheten på skrapa för att skapa jämna kanter. Det sjätte kan såret vara för stor för att visualisera genom kameran i mikroskopet. Använd 200 µL pipettspetsar med mindre styrka för att generera såret. Alternativt kan en nål användas för att generera ett mindre gap. Sjunde, fäster några celler som är fristående under repa igen såret på grund av otillräcklig tvättar. Tvätta brunnarna med serumfritt medium i stället för PBS minst 5 gånger. Åttonde, kan celler börjar lossa från plåten efter några tvättar. Dock äventyras antalet tvättar inte för att säkerställa att fristående celler åter inte koppla till såret. I detta fall kan forskare tvätta cellerna försiktigt 3 gånger och lämna plattan släpper inkubatorn för en maximal tid på 1 h att låta cellerna bosätta sig innan du fortsätter med resten av tvättarna. Nionde, mikroskopet kan förlora fokus, och bilderna kan bli suddiga halvvägs genom experiment. En förändring i temperatur runt mikroskopet kan vara orsaken, eftersom temperaturen har en mindre effekt på justerade scenen avståndet. Forskare ska slå på mikroskopet och temperatur kontroll minst 1 h innan experimentet för att säkerställa att inkubatorn värms upp innan du justerar fokus på celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi tacka medlemmarna i RIF laboratoriet för sin bra diskussion och kommentarer. S.J. stöddes av bidrag från den nationella Research Foundation Singapore och Singapore undervisningsministeriet under dess forskning centrerar av Excellence initiative till Cancer Science Institute Singapore (R-713-006-014-271), National Medical Forskningsrådet (CBRG-NIG; BNIG11nov001 och CS-IRG; R-713-000-162-511), Undervisningsministeriet akademisk forskningsfonden (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 okt -04). Y.Z., G.S.C. och CYT stöddes av en doktorandutbildning stipendiet som delas ut av den Cancer Science Institute i Singapore, National University of Singapore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
References
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
- Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53. J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).
- Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage. Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).
- Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. Cellular functions of TIP60. Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).
- Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT. Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).
- Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity. Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).
- Sykes, S. M., et al. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction. Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).
- Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis. Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).
- Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival. J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).
- Gorrini, C., et al. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response. Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).
- Jha, S., et al. Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway. Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).
- Kim, J. H., et al. Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes. Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).
- Sakuraba, K., et al. Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer. Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).
- Subbaiah, V. K., et al. E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60. Oncogene. , (2015).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Zhang, Y., et al. TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program. J Mol Cell Biol. , (2016).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
