Summary
Nous présentons ici la surveillance en temps réel de la migration cellulaire dans un essai de cicatrisation avec les cellules épithéliales mammaires appauvri TIP60 MCF10A. La mise en œuvre de techniques d’imagerie de cellules vivantes dans notre protocole nous permet d’analyser et de visualiser les unicellulaires mouvement en temps réel et au fil du temps.
Abstract
L’essai de cicatrisation est efficace et l’un des moyens plus économiques pour l’étude de migration cellulaire in vitro. Classiquement, les images sont prises au début et la fin d’une expérience à l’aide d’un microscope à contraste de phase, et les capacités de migration des cellules sont évaluées par la fermeture des plaies. Cependant, le mouvement cellulaire est un phénomène dynamique, et une méthode conventionnelle ne permet pas pour le suivi de mouvement de cellule unique. Afin d’améliorer les tests de cicatrisation actuellement, nous utilisons les techniques d’imagerie de cellules vivantes pour surveiller la migration cellulaire en temps réel. Cette méthode permet de déterminer le taux de migration cellulaire basé sur une cellule, système de suivi et fournit une meilleure distinction entre la migration cellulaire et la prolifération cellulaire. Ici, nous montrent l’utilisation de l’imagerie de cellules vivantes dans des essais de cicatrisation pour étudier les capacités différentes de migration des cellules épithéliales mammaires, influencées par la présence de TIP60. Motilité cellulaire est très dynamique, notre méthode fournit plus d’idées dans les processus de cicatrisation qu’un instantané de la fermeture de la plaie avec les techniques d’imagerie traditionnels utilisés pour les essais de cicatrisation.
Introduction
VIH-Tat-interactive protéine de 60 kDa (TIP60) est une acétyltransférase de lysine qui peut acetylate histone et protéines non histones1,2. Ses fonctions sont trouvent à avoir des incidences sur les multiples voies de signalisation, y compris la transcription, la réparation de lésions de l’ADN et apoptose1,3,4,5,6, 7 , 8. en outre, TIP60 est souvent diminuée dans les cancers et sa diminution est corrélée avec métastases cancéreuses et faible taux de survie taux9,10,11,12, 13,14. Métastase tumorale est la principale cause de décès liés au cancer. C’est un processus en plusieurs étapes, et la première étape des métastases implique la migration et l’invasion des cellules tumorales dans les tissus adjacents15,16. Pour ce faire, les cellules tumorales, tout d’abord, doivent se détacher de la masse de la tumeur primitive, soit sous la forme d’une feuille de cellule collectivement envahisseurs ou comme détaché monocellules17. Pendant ce processus, les cellules tumorales connaissent souvent épithéliales de transition mésenchymateuse (EMT), entraînant des changements dans la morphologie et la cellule adhérence capacité17,18.
Quelques techniques ont été développées pour étudier la migration et la capacité d’invasion de la tumeur des cellules in vitro. Parmi eux, l’essai de cicatrisation est le plus efficace et économique19. Tout d’abord, cette méthode implique la création d’un fossé artificiel sur une monocouche confluente de cellules, permettant ainsi aux cellules de migrer et de combler l’écart. Deuxièmement, les images des lacunes peuvent être capturés au début et à la fin de l’expérience. Enfin, une comparaison des écarts est utilisée pour déterminer la vitesse de la migration cellulaire. Un microscope à contraste de phase est généralement utilisé pour capturer des images pour des dosages classiques de cicatrisation. Un autre avantage de l’essai de la cicatrisation, c’est qu’il ressemble en partie en vivo migration des cellules tumorales. De même pour in vivo de métastases tumorales, la migration cellulaire lors d’essais de cicatrisation montre tant la migration collective des feuilles épithéliales et la migration des cellules simples jumelés.
Toutefois, la migration cellulaire est connue pour être dynamique, et il est nécessaire de documenter le mouvement des cellules en temps réel. Par exemple, un test conventionnel de cicatrisation ne permet pas un chercheur analyser les mouvements de la cellule unique. En revanche, les cellules cultivées pour des dosages de cicatrisation sont souvent privées de sérum pour inhiber la prolifération cellulaire. Ceci est fait pour écarter la possibilité d’écarts en raison de la prolifération cellulaire. Néanmoins, il y aura toujours quelques prolifération et mort cellulaire et des images à contraste de phase prises avant et après l’expérience sont incapables de différencier entre eux.
La technique d’imagerie de cellules vivantes aborde cette limitation des essais classiques de cicatrisation. En utilisant un microscope de vivre-imagerie combiné avec un incubateur à CO2 et le contrôle de température approprié, chercheurs peuvent de mesurer la taille de l’espace et son taux de fermeture au fil du temps tout en retraçant les mouvements de migration activement les cellules situées à l’extrémité de la avant envahissante. Par conséquent, la mise en œuvre de cellules vivantes d’imagerie pour surveiller la migration cellulaire ne fournira pas seulement la meilleure visualisation de la migration cellulaire, mais permettra également la possibilité de faire la différence entre la migration cellulaire et la prolifération cellulaire, permettant ainsi une plus fiabilité de l’analyse de la migration cellulaire.
Dans cette étude, les cellules épithéliales mammaires MCF10A servaient à démontrer la combinaison de la cicatrisation, dosage et vivre-cellule d’imagerie afin d’étudier le rôle de TIP60 dans la migration cellulaire. L’appauvrissement de la couche de TIP60 résulte en capacités d’augmentation de la migration dans les cellules MCF10A.
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Protocol
1. préparation
- Préparer le milieu de culture MCF10A : moyen d’Eagle modifié (DMEM de Dulbecco) / F12 (1:1) avec 5 % de cheval sérum, 20 ng/mL facteur de croissance épithélial, hydrocortisone 0,5 mg/mL, 100 ng/mL de toxine de choléra et 10 µg/mL d’insuline.
- Préparer un milieu sans sérum : DMEM/F12 (1:1) avec 20 ng/mL facteur de croissance épithélial, hydrocortisone 0,5 mg/mL, la toxine cholérique 100 ng/mL et 10 µg/mL d’insuline.
- Utilisez la séquence de siARN suivants :
siControl :
Avant : 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
Revers : 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
siTIP60 :
Avant : 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
Revers : 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3' - Utilisez des récipients de culture cellulaire de 10 cm et plaques 24 puits.
2. transitoire épuisement des siARN TIP60 utilisant
- Jour 1, aliquote 15 µL de réactif de transfection (p. ex., Lipofectamine RNAiMAX) et 2 mL de milieu de sérum (p. ex., Opti-MEM) a réduit et mélangent avec 10 µL de chaque siARN (stock de 10 µM), respectivement.
- Incuber le mélange à température ambiante pendant 20 min.
- Graines de cellules6 MCF10A 1 x 10 avec 3 mL de milieu de culture dans un plat de 10 cm. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Ajouter le mélange de siARN goutte à goutte dans le plat de 10 cm.
- Secouez le plat pour faire en sorte que les cellules sont également distribués avant de le mettre dans l’incubateur à 37 ° C.
- Après 6 h d’incubation, remplacer le support contenant des siARN avec 8 mL de milieu de culture frais.
- Jour 2, préparer une autre fournée de siARN mélanges et les incuber à température ambiante pendant 20 min.
- Aspirer à 8 mL de milieu de culture ajouté au jour 1 et le remplacer par 3 mL de milieu de culture frais.
- Ajouter le deuxième lot de mélange de siARN aux plats goutte à goutte. Secouez la vaisselle pour faire en sorte que les réactifs sont entièrement mélangés avant de les mettre dans l’incubateur.
- Après 6 h, remplacer le support contenant des siARN avec 8 mL de milieu de culture frais.
3. semences cellules pour le dosage de cicatrisation
- Le jour 3, jetez le milieu et laver les cellules une fois avec 2 mL de tampon phosphate salin (PBS). Jeter le tampon PBS.
- Trypsinize les siControl et les cellules traitées siTIP60 en ajoutant 1 mL de 1 x tampon de trypsine-EDTA à la plaque. Remettre dans l’incubateur pendant 20 min.
- Ajouter 4 mL de milieu de culture complet pour chaque plaque, remettre les cellules en suspension de pipetage et transférez-les sur un tube de 15 mL.
- Centrifuger à 200 g pendant 5 min et retirer le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules avec 5 mL de milieu sans sérum et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Préparer une suspension de cellules de 6 x 105 cellules/mL pour les siControl et siTIP60 ; veiller à ce que les cellules soient bien mélangés. Ajouter 500 µL de la suspension cellulaire à un puits d’une plaque 24 puits pour assurer 100 % de confluence. Graines de 5 à 6 puits chaque pour siControl et siTIP60.
- Secouez légèrement la plaque en arrière et puis à côté d’assurer la répartition homogène. Éviter un mouvement circulaire. Laisser la plaque dans l’incubateur pendant 24 h.
- Récolter les cellules restantes pour vérifier l’efficacité défiant de TIP60. Pour ce faire, centrifuger la suspension de cellules restantes à 200 g pendant 5 min et retirer le surnageant.
- Isoler l’ARN à l’aide d’un commercial réactif, suivant le protocole du fabricant et passez à la PCR quantitative en temps réel pour évaluer l’efficacité défiant.
4. créer la plaie
- Vérifier sous un microscope à contraste de phase pour s’assurer que les cellules sont pleinement attachés. Observer des cellules au microscope (4 X, 10 X et 20 X grossissement) pour s’assurer que les cellules sont pleinement attachés qu’une monocouche confluente de cellules a formé.
Remarque : les cellules siControl attachent généralement mieux que les cellules siTIP60. C’est prévu, car l’appauvrissement de la couche de TIP60 rend les cellules plus mésenchymateuse type20. Ici, un microscope à contraste de phase normale benchtop lumière blanche est utilisé. - Pour générer la plaie, délicatement gratter une ligne droite à travers le centre du puits avec une pointe de pipette de 200 µL ; la longueur de la plaie générée est la même que le diamètre du puits. Répétez cette étape pour tous les puits restants. Utiliser un nouvel embout de la pipette pour chaque puits.
- Laver délicatement à l’aide de chaque puits 5 fois sans sérum moyen pour enlever les cellules individuelles.
- Ajouter 1 mL de milieu sans sérum dans chaque puits et passez à l’imagerie de cellules vivantes.
5. installation de l’imagerie de cellules vivantes
- Allumez le microscope et le contrôle de la température au moins 1 h avant la mise en place de cellules vivantes d’imagerie afin de s’assurer que la température dans la chambre atteint 37 ° C.
- Allumez l’alimentation de gaz de dioxyde de carbone (CO2) avant de commencer l’imagerie de cellules vivantes. Régler le CO2 concentration à 5 %.
- Placez la plaque 24 puits sur la scène du microscope, puis sélectionnez l’objectif avec un grossissement de X 10 pour l’imagerie. Diriger la lumière émise pour les oculaires au lieu de la caméra et ajuster le focus pour localiser la plaie et les cellules autour de lui.
Remarque : dans ce cas, la lumière blanche avec contraste de phase a été utilisée. - Utiliser un système d’observation de cellules vivantes pour marquer la position de la plaie dans chaque puits.
Remarque : La scène automatisée le système d’imagerie de cellules vivantes permet d’acquisition d’images à postes multiples. Les images sont prises sur chaque position marquée une fois chaque intervalle. - Mettre en place la condition temporelle : intervalle de 1 h et la durée de 72 h ; Selon ce paramètre, le système prendra photos à chaque emplacement marqué toutes les heures pendant 72 h. mise en place n’importe quel intervalle de temps souhaité et la période de surveillance.
NOTE : Ici, une durée de 72 heures est préférable car ces cellules commencent à mourir après 72 h dans un milieu sans sérum.
6. suivi de mouvement unicellulaires
- Exporter les données après 72 h. exporter les données sous forme d’images au format JPEG, tant que les vidéos au format AVI.
NOTE : Ceci est important parce que les logiciels ImageJ peut reconnaître seulement les vidéos au format AVI. Les vitesses de migration cellulaires différentes entre les cellules siTIP60 et siControl peuvent être clairement observés dans la vidéo. - Ouvrir la vidéo AVI dans le logiciel ImageJ.
- Ouvrez le plugin MTrackJ (le plugin doit être téléchargé et installé séparément) : Plugins > MtrackJ.
- Ajouter une piste pour les cellules individuelles choisie de la vidéo en cliquant sur l’onglet « Ajouter » dans la barre d’outils MtrackJ. Choisissez une cellule à l’extrémité du front invasive et une cellule qui peut migrer sur ses propres (migration de cellules individuelles). Suivre le mouvement des cellules choisies sur la vidéo et de remonter à l’aide de MtrackJ.
- Mesurez la distance du mouvement en cliquant sur l’onglet « mesure » sur la barre d’outils.
NOTE : Ici, presque aucune cellule de la siControl s’installe comme des cellules individuelles, rend difficile de mesurer le mouvement des cellules individuelles, tandis que le nombre des cellules siTIP60 se déplacèrent en cellules individuelles. Cependant, la circulation des cellules situées à l’avant envahissante peut encore être tracée et calculée dans les cellules des siControl et siTIP60. - Enregistrer la vidéo avec les pistes au format AVI.
7. la quantification de la capacité de Migration cellulaire
- Pour la quantification, sélectionnez les images à h « n », où « n » se réfère à la validant lorsque les cellules du siTIP60 ou du siControl ont complètement fermé la plaie et à 0 h.
NOTE : Ici, 48 h a été choisi, car les blessures dans les cellules siTIP60 ont été presque complètement fermés. - Quantifier la pourcentage migration à l’aide de ImageJ selon la formule suivante : (zone de plaie à 0 h - de plaie à « n » h) / zone de plaie à 0 h x 100.
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Representative Results
Schéma général du test de Migration cellulaire axée sur l’imagerie de cellules vivantes
Figure 1 a est un schéma du présent protocole. MCF10A cellules transfectées avec siControl a montré une morphologie épithéliale typique. Après l’épuisement des TIP60, MCF10A cellules étaient plus mésenchymateuses par rapport aux cellules témoins (Figure 1 b).
Examen de l’efficacité défiant TIP60
La figure 2 illustre l’efficacité défiant TIP60. Le niveau d’expression TIP60 fortement diminué après un traitement siTIP60. Outre TIP60, les expressions de plusieurs protéines liées à la migration de cellules ont été également examinés20. Par exemple, l’expression de la molécule d’adhérence épithéliale (EpCAM), qui est un marqueur épithélial, a diminué, alors que les manifestations de la fibronectine (FN1) et SNAIL2 (SNAI2), qui sont les deux pilotes de l’EMT, ont augmenté à appauvrissement de la couche de TIP60. Ces données suggèrent que les niveaux de TIP60 dans les cellules de MCF10A utilisés pour l’imagerie de cellules vivantes étaient suffisamment réduits.
Appauvrissement de la couche de TIP60 modifie la dynamique de la Migration cellulaire
La figure 3 montre les vidéos prises pour les cellules siControl et siTIP60. Les vidéos montrent clairement une migration cellulaire plus rapide des siTIP60 par rapport à siControl. En dehors de cela, dans la dynamique de la migration cellulaire entre les cellules siControl et siTIP60 a observé une différence aussi (c.-à-d., les cellules de siControl déplacés sous forme de tableau, tandis que plus de mouvement unicellulaire a été observée dans les cellules de siTIP60).
Augmentation de la Migration cellulaire après TIP60 Knockdown
La figure 4 montre la quantification de la migration cellulaire des cellules siControl et siTIP60. Le pourcentage de cellules migrés a augmenté significativement après l’épuisement des TIP60.
TIP60 Épuisement change le modèle de la Migration cellulaire
La figure 5 montre les vidéos mouvement de cellule unique de suivi. La plupart des cellules siControl migré collectivement dans le cadre des feuilles de la cellule et seulement deux cellules ont montré unicellulaires migration, tandis que la plupart des cellules siTIP60 single-cell migration. Les changements dans la configuration de la migration cellulaire indiquent que les cellules avec TIP60 appauvri ont un phénotype plus mésenchymateux.
Figure 1 : présentation expérimentale et images représentatives. (A) schéma du protocole. (B) des images représentatives de MCF10A cellules transfectées avec siControl ou siTIP60. MCF10A cellules présentent une morphologie plus mésenchymateuse après l’épuisement des TIP60. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : TIP60 était efficacement épuisée après transfection siTIP60. La PCR quantitative en temps réel a été utilisée pour vérifier le niveau d’expression de TIP60, EpCAM, FN1et SNAI2. L’ARN total a été isolé en utilisant le réactif de Trizol suivant le protocole de la manufacture. 2 µg d’ARN total de chaque échantillon était utilisée pour fabriquer des ADNc. Les résultats sont représentés comme le pli-changement. Actine a été utilisée comme témoin interne. Barre d’erreur indique l’écart d’au moins 3 expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : vidéos d’imagerie de cellules vivantes des cellules siControl et siTIP60 montrent des profils différents de mouvement cellulaire. L’intervalle de temps a été établi à 1 h et la durée était de 72 h. La vidéo a été prise à l’aide d’une observation de cellules vivantes de Zeiss. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ces vidéos.
Figure 4 : Quantification du pourcentage de la migration cellulaire. (A) les images représentatives ont été extraites des vidéos d’imagerie de cellules vivantes. Photos prises à 0 h et 48 h ont été utilisés. (B) le dosage du pourcentage de la migration cellulaire sous 48 h a été effectué à l’aide de logiciels ImageJ selon la formule suivante : (zone de plaie à 0 h - de plaie à « n » h) / zone de plaie à 0 h x 100. La barre d’erreur indique l’écart d’au moins trois expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : vidéos d’imagerie de cellules vivantes afficher le suivi de mouvement monocellulaires. Les lignes de couleur montrent la voie migratoire de chaque cellule unique isolé sélectionnée. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ces vidéos.
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Discussion
On sait que dans le processus de migration cellulaire, les cellules peuvent soit déplacer sous forme de feuilles adhérentes ; des grappes ; ou seul, isolés des cellules. Le mode et la dynamique de l’invasion des cellules peuvent varier d’une affection à l’autre, et le phénotype peut changer en quelques heures. L’analyse de cicatrisation traditionnelle est basée sur snapshot images tirées d’un microscope avec un intervalle de temps, par exemple 12 ou 24 h. Il est donc difficile de saisir la dynamique de la fermeture de la plaie et le modèle des mouvements de la cellule.
En revanche, des systèmes d’imagerie de cellules vivantes surveillent la migration cellulaire sur un intervalle beaucoup plus court (30 min ou 1 h) et à la même position exacte, qui n’est pas faisable pour des images prises manuellement. Le système est automatisé, et seulement les chercheurs doivent exporter les données à la fin des expériences. Cela rend possible de suivre le modèle du mouvement cellulaire et le processus de fermeture de la plaie en temps réel. Dans cette étude, l’incorporation d’un système d’imagerie quantitative de cellules vivantes dans des essais de cicatrisation permet la capture de mouvement dynamique cellulaire, ainsi que le processus de fermeture de la plaie en contrôle ou cellules TIP60 appauvris. De la vidéo prise à l’aide d’un système d’imagerie de cellules vivantes, la plupart des cellules siControl s’installe en une couche adhérente, tandis que les cellules TIP60 appauvri déplacé comme des cellules individuelles isolées (Figure 3 et Figure 5).
La prolifération cellulaire et l’apoptose pourraient compliquer l’étude de la migration cellulaire dans un essai de cicatrisation. Par conséquent, l’analyse de cicatrisation est réalisée dans un milieu sans sérum pour minimiser les conséquences de la prolifération cellulaire. En outre, la précipitation de TIP60 a été optimisée afin de réduire son impact sur la survie des cellules. Toutefois, il est impossible d’éliminer les influences de la prolifération cellulaire et l’apoptose dans des essais de cicatrisation. Les captures instantanées peuvent seulement fermeture capture enroulé à un certain point de temps, il est impossible de distinguer si la fermeture de la plaie était due à la migration cellulaire ou la prolifération des cellules. Imagerie de cellules vivantes surveille la dynamique de la migration cellulaire et suit le mouvement de cellules individuelles, ce qui permet aux chercheurs de distinguer la migration cellulaire de la prolifération cellulaire et l’apoptose. Dans cette étude, suivi de la cellule unique a révélé le chemin de migration des cellules simples isolés à l’état de siTIP60, tandis que les cellules siControl déplacés principalement sous forme de feuilles. Le système d’imagerie de cellules vivantes capturées aussi une augmentation de la migration cellulaire collective (c.-à-d., les cellules migrent comme un groupe homogène) dans les cellules de siTIP60 par rapport aux cellules siControl. D’après les vidéos, MCF10A siTIP60 a montré plus de mouvements unicellulaires et plus rapide migration de cellules épithéliales feuilles par rapport à siControl (Figure 5).
Divers paramètres utilisés dans le présent protocole doivent être optimisées pour éviter une panne expérimentale. Tout d’abord, le nombre de décès de cellule après transfection transitoire devrait être inférieure à 10 % afin de minimiser l’effet sur la migration cellulaire. Dans ce cas, l’épuisement des TIP60 peut réduire la survie des cellules ; par conséquent, les chercheurs devraient être au courant de ce phénotype potentiel, comme il peut compliquer la migration cellulaire. Pour éviter ce problème, les chercheurs devraient optimiser le nombre de cellules et de la quantité de siARN utilisé pour épuiser leur gène cible. Pour MCF10A, 1 x 106 cellules avec 20 nM siTIP60 était la condition optimisée dans cette étude. En second lieu, les cellules MCF10A sont souvent en cluster et difficiles à dénombrer. Erreurs dans le comptage des cellules peuvent entraîner une différence significative dans le nombre de cellules initiales dans des conditions différentes, et cela pourrait être une variable confusionnelle lors d’essais de cicatrisation. Pour éviter ce problème, trypsinize MCF10A cellules pendant au moins 20 min. Ajouter milieu complet pour arrêter la trypsinisation et mélanger en pipettant également monter et descendre de 20 fois pour disperser des touffes et pour le rendre plus facile de compter. En troisième lieu, les cellules sont habituellement dans le centre du puits après être tête de série à la plaque 24 puits. Remettre en suspension les cellules après le semis pour assurer une répartition égale. Secouez la plaque en arrière et de gauche à droite avant de le mettre dans l’incubateur. Quatrièmement, l’appauvrissement de la couche de TIP60 rend la cellule plus mésenchymateuses et donc plus difficiles à joindre. Dans ce cas, laisser la plaque dans l’incubateur pour une plus longue période de temps. Après 24 h, les cellules sont généralement attachés. Si les cellules ne sont pas correctement attachés, les chercheurs pouvaient utiliser le milieu de culture complet pour l’ensemencement de la cellule et remplacez-le par un milieu sans sérum, lorsque les cellules sont pleinement attachés. Ces cellules sont généralement attachés après 12 h dans un milieu complet. Cinquièmement, au bord de la plaie ne peut pas être lisse. Augmenter la vitesse de gratter pour créer des contours adoucis. Sixièmement, la plaie peut être trop grande pour visualiser à travers la caméra du microscope. Utiliser des pointes de pipette 200 µL avec moins de force pour générer de la plaie. Alternativement, une aiguille peut servir à générer une petite lacune. Septièmement, quelques cellules qui sont détachent au cours de l’éraflure peuvent recoller la plaie en raison des lavages insuffisantes. Laver les puits avec un milieu sans sérum au lieu de PBS au moins 5 fois. Huitièmement, les cellules peuvent commencer à se détacher de la plaque après quelques lavages. Toutefois, le nombre de lavages ne saurait être transigé afin de s’assurer que les cellules individuelles re-n’attachent pas sur la plaie. Dans ce cas, les chercheurs peuvent laver les cellules doucement 3 fois et laisser la plaque à l’intérieur de l’incubateur pour une durée maximale de 1 h à laisser les cellules s’installent avant de passer au reste de la lave. Neuvième, le microscope peut perdre le focus, et les images peuvent devenir floues à mi-chemin à travers l’expérience. Un changement de température dans le microscope peut être la raison, que la température a un effet mineur sur la distance de la scène ajusté. Les chercheurs doivent s’allumer le microscope et contrôle de la température au moins 1 h avant de commencer l’expérience pour s’assurer que l’incubateur est réchauffé avant d’ajuster le focus sur les cellules.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Nous remercions les membres du laboratoire JAI pour discussion utile et observations. S.J. a été pris en charge par des subventions de la National Research Foundation Singapour et le Singapour du ministère de l’éducation dans ses centres de recherche de l’initiative d’Excellence pour le Cancer Science Institute de Singapour (R-713-006-014-271), le National Medical Conseil de la recherche (CBRG-NIG ; BNIG11nov001 et CS-IRG ; R-713-000-162-511), le Fonds de recherche universitaire du ministère de l’éducation (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 Oct -04). Y.Z., G.S.C. et C.Y.T. ont été pris en charge par une bourse d’études supérieures décernée par l’Institut de Science Cancer de Singapour, National University of Singapore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
References
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
- Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53. J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).
- Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage. Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).
- Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. Cellular functions of TIP60. Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).
- Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT. Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).
- Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity. Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).
- Sykes, S. M., et al. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction. Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).
- Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis. Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).
- Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival. J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).
- Gorrini, C., et al. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response. Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).
- Jha, S., et al. Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway. Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).
- Kim, J. H., et al. Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes. Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).
- Sakuraba, K., et al. Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer. Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).
- Subbaiah, V. K., et al. E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60. Oncogene. , (2015).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Zhang, Y., et al. TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program. J Mol Cell Biol. , (2016).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
