Summary
Zebrafish는 척추 동물의 망막 변성/중생의 메커니즘 연구 인기 동물 모델입니다. 이 프로토콜에서는 내부 망막에 최소한의 손상으로 외부 망막을 방해 하는 지역화 된 상해를 유도 하는 방법을 설명 합니다. 망막 형태학 및 망막 재생 내내 뮐러 명과 응답 이후, vivo에서 모니터링합니다.
Abstract
매혹적인 차이 teleost 및 포유류 망막 신생 및 심각한 손상 후 재생 teleost 망막의 평생 가능성은. Zebrafish에 재생 경로 조사 포유류에서 망막 퇴행 성 질환의 치료를 위한 혁신적인 전략을 개발 하는 새로운 통찰력을가지고 있습니다. 여기, 우리는 532 nm 다이오드 레이저에 의하여 성인 zebrafish에 외부 망막에 초점 병 변의 유도에 집중 했다. 지역화 된 부상 망막 변성 및 손상의 지역에서 직접 재생 하는 동안 자리를 차지할 생물 학적 프로세스를 조사 하 고 있습니다. 비-침략 적 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)를 사용 하 여, 우리는 손상 된 지역 및 모니터 후속 중생의 위치를 정의 하 수 있었다 vivo에서. 실제로, 10 월 영상만 사용할 수 있었던 이전 조직학 분석 정보를 제공 하는 제 브라 망막의 고해상도, 단면 이미지를 생성 합니다. 조직학 단면도 수행한 실시간 10 월에서 데이터를 확인, 그리고 망막 상해의 유도 후 재생 응답 immunohistochemistry에 의해 조사 되었다.
Introduction
비전 아마 인간의 가장 필수적인 의미 이며 그 장애는 높은 사회 경제 충격. 공업화 한 세계에서 망막 퇴행 성 질병 시력 손실과 실명 성인 인구1중의 대다수를 위한 계정. 망막 화 (RP)에 영향을 미치는 약 1.5 백만 사람들 전세계2,360와 20의 나가 사이 사람들에서 실명의 가장 일반적인 상속 된 원인입니다. 그것은 상속 된 망막 장애 망막 안료 상피 하 고, 그 후, gliosis의 변성 및 내부 신경4개조 (PRs) 대뇌의 진보적인 손실에 의해 특징의 다른 유형의 가족. 질병의 과정 봉, 희미 한 빛에 콘, 컬러 비전 및 시력5에 필수적인 색 비전에 대 한 책임은 일반적으로 시작 하는 두 홍보 세포 유형에의 증분 손실에 의해 설명 될 수 있다. 단일 유전자 결함은 RP를 일으킬 충분 합니다. 지금까지 45 유전자에서 130 개 이상의 돌연변이 질병6와 연결 되었습니다. 이 다양 한 질병 고기 리드 이며 유전자 치료는 비 일반화할 이유 중 하나 이렇게 복잡 한 치료 접근. 그러므로, 망막 유년에 눈부신 질병 치료에 새로운 일반적인 치료 접근을 개발 하는 긴급 한 필요가 있다.
종종 망막 변성 관련 홍보 손실; 따라서, 홍보 세포 죽음은 망막7에 퇴행 성 프로세스의 특징 이다. 그것은 이미 홍보 세포 죽음 뮐러 명과 셀 (MC) 활성화와 확산8자극 입증 되었습니다. MCs, 척 추가 있는 망막에 주요한 glial 세포 유형 망막 신경 세포 사이 아무것도 "접착제" 보다는 더 많은 것 한 번 고려 되었다. 최근 몇 년 동안, 많은 연구 MCs 단순한 구조 보다는 더 많은 지원9행동 나타났습니다. 다른 기능 중 MCs 성체에도 참여 하 고10을 복구 합니다. 실제로, 악화 망막에서 diffusible 요소에 대응, MCs 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP) 식 크게 증가. 그러므로, GFAP 라벨로 망막 상해 및 변성11응답 보조 MC 활성화에 대 한 표식으로 사용할 수 있습니다.
최근, 우리 개발 zebrafish (Danio rerio) 망막 변성을 유도 하는 레이저를 사용 하 여 초점 상해의 소설을 각 색을 했다. 초점 부상 부상된 사이트에 셀의 이동 및 망막 재생12중 사건의 정확한 타이밍 등 특정 생물 학적 과정을 공부에 대 한 유리 하다. 또한,는 zebrafish가 되고있다 시각적 연구에 중요 한 다른 척추 동물의 시각적 시스템 사이의 유사성 때문에. 인간과 teleost retinae의 심한 형태학 및 조직학 특징 몇 가지 차이점을 표시합니다. 따라서, 인간과 zebrafish retinae 망막 프로젝션 뉴런, 신경 절 세포 안쪽에 거주 하는 동안 빛 감지 대뇌 바깥쪽 레이어를 차지 같은 계층된 패턴에 같은 주요 셀 클래스 포함 신경 층, 렌즈에 인접입니다. 망막 수, amacrine, 바이 폴라, 및 가로 셀, 포토 리셉터와 신경 절 세포 층13사이 지역화합니다. 또한, zebrafish 망막은 콘 지배 하 고 따라서 보다, 예를 들어 집중적으로 공부 쥐 망막 인간의 망막에 더 가까이. 매혹적인 차이 teleost 및 포유류 물고기 망막과 망막 재생 손상 후에 지속적인 성체입니다. Zebrafish, MCs dedifferentiate를 중재 부상된 망막14,15에서 재생 됩니다. 닭, MCs는 또한 세포 주기를 다시 입력 하 고 dedifferentiate 일부 용량을가지고. 성인 물고기에 망막 상해 다음 MCs는 새로운 신경16생산을 손상 된 망막 조직을 마이그레이션할 조상 및 줄기 세포의 특정 특성을 채택. 진 식 포유류 MCs의 프로 파일링 망막 창시자, 예기치 않은 유사점 그리고 닭고기, 설치류, 심지어 인간의 망막에 MCs의 본질적인 neurogenic 잠재력에 대 한 증거는17성장 하 고 있다. 그럼에도 불구 하 고, 왜 재생 응답 조류와 포유류에 낮은 물고기에 강력한 응답 비교는 아직 이해 되지. 따라서, zebrafish에 내 생 수리 메커니즘을 이해 포유류와 인간 자극 망막 중생에 대 한 전략을 제안할 수 있습니다. 망막 변성 환자 치료를 위한 치료 도구로 MCs의 내 생 수리 메커니즘을 채용 우리 사회에 대 한 뛰어난 영향을 미칠 것 이다.
여기, 우리 안과 연구에서 변성/재생 모델을 고용 하는 데 필요한 단계를 제공 합니다. 우리는 먼저 부상 사이트, 그리고 인접 한 MCs의 마지막으로 머릿속 참여 개발 이벤트의 이미징에 다음 neurosensory 망막에서 초점 손상을 유도에 집중 했다. 일반적인 프로토콜 비교적 쉽게 수행 하 고 다양 한 망막을 나중에 평가 대 한 가능성을 엽니다.
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Protocol
모든 실험 성명 안과 및 안과 (ARVO)에 비전 연구를 위한 협회의 비전 연구에서 동물 사용에 대 한 준수 하 고 존중 하는 정부 기관의 관련된 규정.
1. 동물
- 유지 TgBAC (gfap:gfap-GFP) zebrafish 167 (AB) 스트레인 26.5 ° C의 온도와 물 표준 조건 하에서 6-9 개월 ~ 14/10 h 명암 주기 18 세.
- 정부 당국에 의해 승인 후 동물 실험에 대 한 관련 기관의 동물 보호 지침을 따릅니다.
2. 가역 전신 마 취
- 준비 물 탱크 그리고 트리 스의 1 M의 2.1 mL 97.9 ml tricaine 분말의 400 밀리 그램을 용 해 하 여 에틸 3 aminobenzoate methanesulfonate 소금 (tricaine)의 재고 솔루션 버퍼링 식 염 수 (TBS). 어둠 한 달에에서 4 ° C에서 1 M Tris (pH 9)와 저장소 pH 7.0 조정.
참고: Tricaine는 동물의 자연 생활 상태 처럼 물에 준비 되어야 한다, 원래 탱크 물 사용 하는 선호. - 재고 솔루션 1시 25분 탱크 물에 희석 하 고 즉시 사용.
- 10 cm 배양 접시 그들이 움직이지 되 고 외부 자극 (약 2-5 분, 무게와 연령에 따라)에 응답 하지 않는 때까지 마 취 솔루션 50 mL를 포함 하는 제 브라 넣습니다.
- 전송할 각 물고기 손으로 레이저 치료 ( 그림 1A)에 대 한 맞춤 실리콘 핀 홀더.
주의! 물고기 탱크를 10 분만에 외부 마 취 남아 있을 수 있습니다. - 치료 및 이미징 후 마 취를, 물 탱크를 포함 하는 컨테이너에서는 zebrafish 장소.
- Zebrafish 물에 앞뒤로 이동 하 여 만들 신선한 탱크 물의 흐름 아가미 이상으로 복구를 지원 하기 위해.
3. 망막에 초점 부상 레이저
참고: A 532 nm 다이오드 레이저는 zebrafish의 망막에 초점 빛 피해를 만드는 데 사용 됩니다. 레이저의 실험 설정 수 성인 제 브라에서 재현할 수 초점 망막 상해의 설립.
- 레이저의 출력 설정: 70 mW; 공중 직경: 50 µ m; 펄스 기간: 100 양
주의! 레이저 빛 사용 하려면 적절 한 개인 보호와 지역의 라벨. - 치료 전에 눈에 붙이기 2 %hydroxypropylmethylcellulose 1-2 방울을 적용 하 고 2.0 m m 저 레이저 렌즈를 사용 하 여 초점을 망막에 레이저를 목표로 빔.
주의! hydroxypropylmethylcellulose 방울 점성 있고 아가미에가 경우 호흡에 문제를 일으킬 수 있습니다. - 왼쪽에 시 신경 주위 장소 4 레이저 명소 눈과 눈을 오른쪽, 치료를 사용 하 여 내부 통제로.
4. Vivo에서 망막 형태학의 이미징
- 마 취에서 그들 되살리는 없이 시각화 zebrafish 망막 레이저 유도 후에 직접적으로 0 일에. 전신 마 취를 사용 하는 전혀 다른 시간 포인트 (섹션 2 참조: 가역 전신 마 취). 맞춤 실리콘 핀 홀더 ( 그림 1 B, B.1)에 고정된 zebrafish 장소.
- 최적의 이미지를 잘라 zebrafish 눈에 맞게 상용 하이드로 겔 콘택트 렌즈 (Ø 5.2 m m, r = 2.70 m m, 중심 두께 = = 0.4 m m) 구멍 펀치를 사용 하 여. 스 렌즈의 오목한 표면 작성 및 각 막 위에 놓습니다.
- 78 D 비 접촉 슬릿 램프 렌즈 OCT 시스템을 장비.
- 집중은 IR 적외선 (IR) 이미지 + 10 월 모드 ( 그림 2A)는 적외선을 눈의 저 시각화를 클릭 하 여 그림에서 " 취득 " 버튼 ( 그림 2B) 지역화 하는 레이저 시스템을 사용 하 여 망막에 반점 ' s 소프트웨어.
- 시각화 IR + 10 월 망막 층의 3 차원 섹션 모드를 클릭 하 여 사진의 찍을 하 고는 " 취득 " 버튼 ( 그림 2B). 외부 핵 층 (ONL)에서 상해의 심각도 관찰 (섹션 3 참조: 레이저 망막에 초점 부상) 이러한 이미지.
- 치료 및 이미징 zebrafish는 물 탱크를 포함 하는 컨테이너에 배치 후 마 취를.
- Zebrafish 물에 앞뒤로 이동 하 여 만들 신선한 탱크 물의 흐름 아가미 이상으로 복구를 지원 하기 위해.
- 망막 형태론의 비슷한 vivo에서 이미징을 수행 하는 하루에 1, 3, 7, 14 및 주 6.
5. 되며 & 오신 (H & E) 얼룩
- zebrafish 감기 (4 ° C)에 침수에 의해 안락사 마 취 솔루션 enucleate 및 적어도 10 분 동안 얼음에 눈 즉시으로 의미의 작은 곡선된 겸 자.
- 20 h 4 ° C에서 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 전체 눈을 해결 하 고 다음 등급된 알코올 시리즈에서 샘플을 탈수 (크 실 렌 에탄올 70%, 3 분 두 번에 대 한 에탄올 96%, 에탄올 100 %5 분 두 번, 5 분 두 번에 대 한 100 %3 미 n 한 번).
주의! PFA는 눈, 코, 그리고 상부 호흡기 트랙에 자극 수 있습니다. PFA는 알려진된 인간 발암 물질 의심된 생식 위험. - 파라핀에 샘플을 포함, 시 신경 머리의 수준에서 5 µ m 섹션을 잘라 고 유리 슬라이드에 탑재.
- 5 분 0.1% 산 되며 솔루션 deparaffinized 섹션 얼룩 및 염 산 믹스에 슬라이드를 찍기 후 두 번 증류수에에서 슬라이드를 찍어 (2 mL 25% HCl 250 ml에서 증 류 물) 및 암모니아 (250 ml에서 2 mL 25% 암모니아를 혼합 소 주 물)입니다. 적어도 10 분에 대 한 수도 물에 의해 얼룩이 지는 hematoxylin의 개발 후 오신 G 용액 0.5 %3 분에 대 한 섹션을 얼룩
- 아크릴 수 지 장착 매체에 탈수 슬라이드를 탑재 하 고 가벼운 현미경 슬라이드 관찰.
6. MC 활성화 Immunohistochemistry
- 적절 한 기선 또는 10-15 분 동안 전자 레인지에 3 분에 대 한 항 원 검색 버퍼 (트리 스-EDTA + 0.05% 비 이온 세제, pH 9.0)에서 deparaffinized 섹션을 열 및 5 TBS와 세 번 씻어 각 분.
- 원형 한 실리콘 섹션 펜 및 100 µ L를 추가 차단 솔루션 (TBS + 10% 염소 정상 혈 청 + 1% 소 혈 청 알 부 민, pH 7.6) 1 헤에 대 한 실 온에서
- 안티 폐해 fibrillary 산 성 단백질으로 얼룩 (GFAP) 토끼 polyclonal 항 체 그리고 방지 글루타민 합성으로 (GS) 마우스 단일 클론 항 체, 1: 200 희석 (샘플 당 40 µ L)에서 모두. 하룻밤에 4 ° C에서 습도 챔버 슬라이드를 품 어. TBS + 0.1%로 세 번 세척 5 분 트윈 20.
- 완료 시각화와 적절 한 2 차 항 체입니다. 이 프로토콜 사용 하는 염소-토끼 IgG H & GFAP와 염소 반대로 마우스 IgG H L 녹색 이차 항 체 & L GS, 1 헤에 대 한 실 온에서 1: 500 희석에 모두 밝은 빨간색
- DAPI를 포함 하는 설치 매체와 함께 슬라이드를 탑재 하 고 형광 현미경 슬라이드 관찰.
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Representative Results
실시간 10 월: 망막 수리에 MCs의 역할 분석, 우리 zebrafish 망막에 손상의 잘 delineated 영역 유도 레이저 부상 모델 사용. 손상의 사이트 했다 vivo에서 10 월 처음으로 (0 일) 부상 (그림 3)에 따라 60 분 이내에 의하여 몇 군데. 물고기 눈의 광학에 대 한 보상, 맞춤 콘택트 렌즈는 각 막에 배치 했다. 레이저 치료 후 즉시 확산 하이퍼 반사 신호 외부 망막 (화살표)에 지역화 되었습니다. 그것은 외부 plexiform 레이어 (OPL) 망막 안료 상피 (RPE)에서 연장. 유사한 신호는 또한 1 일에 감지. 3 일 후이 확산 신호는 더 조직 되 고 밀도 되었다. 그것은 지속적으로 외부 핵 층 (ONL) 포토 리셉터 레이어로 확장에 보였다. 첫 주 (7 일)에 따라 평균 병 변 크기에 상당한 감소와만 작은 하이퍼 반사 신호 감지 되었습니다. 최신 시간 포인트 조사 (주 6) 때까지 하루 14에서에서 출발, 레이저 명소 더 이상 IR 및 OCT 이미지에서 볼 수 있었다.
조직학 평가 망막 변성/재생의: 범위와 망막 변성/재생, H의 활동을 조사 하기 위하여 & 손상 유도 (주 0, 1, 3, 7, 14 후 다른 시간 지점에서 고용 되었다 전자 얼룩 그리고 주 6) (그림 4). 실험 3 물고기의 3 개의 눈에서 수행 했다. 그러나,이 원고의 목표는 메서드를 설명 하는 통계 분석 없이 수행 되었다. 안 핵 층 (INL)에 미묘한 변화 ONL 레이저 치료를 다음 60 분 이내 본된 즉시 후 레이저 (는 ONL예, 약간의 부 종)와 INL에 감소 된 세포 공간을 수 있습니다. 퇴보는 레이저 부상의 유도 후 6 주 뒤를 이었다. Morphologic 변경 PRs의 해체와는 ONL subretinal 공간에서 구멍 형성 1 일 후 지속적으로 관찰 되었다. 실제로, 일 1과 7 사이 피해 지역에 ONL 내 핵의 손실이 이었다. 최대 홍보 손실 3 일에 발견 되었다. 14 일에서 6 주에 시작, 외부 망막의 정상적인 형태를 다시 설립 했다.
폐해 참여 동안 망막 변성/재생: 다른 시간 점 (하루 0, 3, 14)에서 MC 활성화를 평가 하기 위해 망막 변성의 유도 따라 우리 glial 세포 마커 GS immunohistochemical 분석 수행 및 GFAP (그림 5)입니다. 실험은 정량 분석 없이 3 물고기의 3 개의 눈에 다시 수행 했다. GS extracellular 조미료의 레벨을 조절에 중요 한 역할 그리고 MC 소마와의 프로세스19,20에 독점적으로 표현 될 것으로 간주 됩니다. GFAP 노화 및 망막 손상 되거나 스트레스 때 upregulated입니다. 그것은 MC 끝 발에 지역화 및21를 처리 합니다. 약한 GFAP 식 또한 다른 glial 세포 유형, 예를 들면, 이다 라벨 쥐는 제어 망막의 안쪽 부분에서 발견 되었다. 홍보 외부 세그먼트의 autofluorescence는 ONL에 신호를 제공 하지만이 명확 하 게 구별 될 수 있습니다. GFAP 신호 upregulated 3 일 후 상해에서 했다. 따라서, 분석 수행 3 일 레이저 치료 후 망막의 ONL에 부상 사이트 내 에서만 GFAP 긍정적인 MCs를 보여주었다. 14 일에서 재생성 크게 완료 되었고 GFAP 신호는 피해 지역에서 초기 단계로 downregulated. GFAP와 달리 GS 식의 수준에 상당한 변화가 있었습니다. 그러나, 상해의 사이트에 GS의 지역화 downregulation 있었을 수 있습니다.
그림 1: zebrafish 망막 및 10 월 분석에 따라 레이저 상해의 유도 대 한 설치. (A) 치료 전 레이저 시스템의 배치. (A.1) Zebrafish 그냥 전에 레이저의 응용 프로그램 장소에 저 콘택트 렌즈와 실리콘 핀 홀더에 배치. (B) 이미징 하기 전에 OCT 시스템의 배치. 제 브라 (B.1) 10 월에 의하여 피해 사이트의 감지 하기 전에 78 D 슬릿 램프 렌즈 앞에 배치 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: IR 및 OCT 이미지 획득을 위한 설치. (A) 이미징 동안 소프트웨어 창의 스크린샷. IR 및 10 월 모드 묘사 된다. (B)는 이미지를 수집 하는 데 사용 하는 패널의 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: IR (왼쪽)과 10 월 (오른쪽) 이미지 같은 망막의 손상 및 손상 되지 않은 사이트의 서로 다른 시간에 눈 망막 변성 레이저 유도 후 (일 0, 1, 3, 7, 14, 주 6) 점. IR 이미지에서 녹색 상자는 망막의 부분 분석을 나타내고 녹색 선 망막에 OCT 이미지의 위치를 보여줍니다. 화살표 표시 사이트 10 월 눈금 막대에 하이퍼 반사 신호 감지 레이저 반점의 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: H & 전자 얼룩의 부상과 contralateral 쥐는 다른 시간에서 zebrafish 눈 망막 변성 레이저 유도 후 (일 0, 1, 3, 7, 14, 주 6) 점. GC, 신경 절 세포 층; INL, 안 핵 층; ONL, 외부 핵 층 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: MC 활성화의 Immunohistochemical 탐지. GFAP (녹색)와 GS (레드) 망막 변성 레이저 유도 후 (일 0, 3, 14)를 포인트 서로 다른 시간에 부상 하 고 손상 되지 않은 zebrafish 망막에 얼룩. 녹색 신호는 ONL에 홍보 o의 autofluorescence은uter 세그먼트입니다. 세포 핵 (파란색) DAPI와 얼룩이 있습니다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
제 브라에서 망막 재생/변성 cytotoxin 중재 세포 죽음22, 기계적 상해23, 열 상해24등 다른 방법으로 조사 되었습니다. 우리 고용 zebrafish 망막 손상 532 nm 다이오드 레이저. 따라서, 우리의 모델 몇 가지 장점을 제공합니다. 예를 들어, 우리는 급속 하 게 외부 망막, PRs 계층에서 특히에 상해의 잘 정의 된 영역을 만들었습니다. 또한,이 실험 설정 안 neovascularization를 유도 Bruch의 막 손상에 의해, 예를 들어 다른 생물 학적 과정을 공부 하는 손상의 더 큰 영역을 생산 하기 위해 수정할 수 있습니다. 최소한의 피해 이며 재생 응답의 타이밍은 정확 하 게 그리고 reproducibly 변조 될 수 있습니다.
Phenotypical 변화 시간이 지남에 따라, 우리는 하이델베르크 Spectralis 시스템 및 하이델베르크 눈 탐색기 소프트웨어 채택. 따라서, 저 IR 이미징 zebrafish에 특히 유용 하 게 발견 되었다. 저 autofluorescence (AF), 레이저 자리와 주변 지역 사이 낮은 대조를 보여주는, 달리 손상 된 사이트는 IR 이미징 하 여 쉽습니다. 변경 내용을 검색 하 고 모니터링 하 재생 vivo에서,는 AF 모드와 함께 가능 하지 않을 것 이라고 수 있습니다. 이전에 보고 된25, 10 월 zebrafish 망막 퇴행 성/재생 프로세스를 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 우리의 모델에서 망막 레이저 부상 어떤 포유류26에 보고 되었습니다 비슷한 ONL (그림 3)에 하이퍼 반사 밴드 검색 되었습니다. 재생성 하는 동안 하이퍼 반사 신호 감소 하루 14에서 완전히 사라질 때까지.
OCT 이미지 레이저 병 변 (그림 4) 이내에 본 형태학 변화와 상관 했다. 10 월 이미지 (0 일) 확산 반사 하이퍼 신호 레이저 치료 따르는 1 시간 안에 안락사 zebrafish의 INL에서 본 후 레이저 변화를 나타냅니다. 주 3에서 미묘 하 고 잘 delineated 하이퍼 반사 신호 막대 손실로 인해 ONL에 구멍 형성에 해당 합니다. 하루 14, 모두 10 월부터에서 시작 하는 조직학 분석 확인 외부 망막 다시 그것의 정상적인 형태를 설립 했다.
현재 연구에서 우리 또한 망막 재생 (그림 5) 동안 MC 응답 평가. 많은 그룹 이미 손상 초기 재생 반응으로 특히의 MCs, glial 세포의 활성화를 조사 했습니다. 좀 더 구체적으로, 그들은 제안 pathophysiological MC 활성화27망막 손상 된 영역에 통합할 수 있는 새로운 기능 세포 유형의 생 소스를 제공 하는 줄기 세포 특성을 채택 하는 MCs를 유발 수 있습니다. 예상 대로, 우리는 망막 레이저 부상 GFAP의 upregulation에 표시 된 대로 MC 활성화를 자극 발견. 실제로, 증가 GFAP 식 3 일 후 상해에서 현저 하 게 감지 하 고 피해 지역에 제한 되었다. 주 14에서에서 시작, 재생 크게 완료 되었고 GFAP 신호는 피해 지역에서 초기 단계로 downregulated. 따라서, 우리는 MCs 적극적인 역할을 망막 조직 개편, 그리고 잠재적으로 재생, 부상에 따라 증명 하고있다.
결론적으로, 레이저 유도 된 망막 변성/재생 모델은 신속 하 고 초점 zebrafish 망막 손상을 생산 하는 다양 한 도구 및 다음 재생 구상 될 수 있다 비-침략 적 10 월 영상에 의해. 또한, 레이저 망막 변성은 MC 활성화를 동반 하 고 뒤이어 gliosis 재생성 시 반전 보여줄 수 있었습니다. 그러나, 관련 된 세포 유형 (예: microglia, 대 식 세포) 및 통로의 상세한 조사를 수행 해야 합니다. 중요 한 수정 필요할 수 있습니다, 특히 그들이 재생 과정 (예를 들어, PRs 계층에서 특히 외부 망막에는 INL에 그들의 원래 위치에서 마이그레이션) 동작 하는 방법을 이해 하려면 MCs의 추적을 라이브 그리고 그들의 차별화 홍보 세포 쪽 으로입니다. 또는, 가벼운 손상 패러다임 막대와 콘 PRs28의 광범위 하 고 일관 된 감소를 유도 하기 위해 사용 될 수 있습니다. 그러나, 기술된 모델의 장점은 더 정의 된 상해 지역 어디 하나 악화 대뇌 활성화 MCs 사이 현지 상호 작용을 공부할 수 있습니다.
일반적으로, 우리는 모델 더 나은 감각 망막 퇴행 성/재생 프로세스를 이해 하는 데 도움이 됩니다 및 포유류 시스템과 이러한 발전의 비교 사용 믿습니다. 그것은 또한 타고 난 면역 시스템의 영향 및 효과 neuroactive 물질의 연구 사용 수 있습니다. 미래에, 하나를 사용 하 여 이러한 결과 악화 인간의 시각 시스템을 수정할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리가 그녀의 우수한 기술 지원에 대 한 모델 및 Federica Bisignani 설정에서 그녀의 과학적인 입력에 대 한 마틴 Zinkernagel, 메릴랜드, 박사 학위 및 Reisenhofer, 박사 미리 암 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
References
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Berson, E. L. Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).
- Strettoi, E. A Survey of Retinal Remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 494 (2015).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications. Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).
- Pierce, E. A. Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations. BioEssays. 23, 605-618 (2001).
- Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury. Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).
- Newman, E., Reichenbach, A. The Müller cell: a functional element of the retina. Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).
- Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates. Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).
- Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats. Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).
- DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
- Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina. Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).
- Xia, X., Ahmad, I. Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia. Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).
- Riepe, R. E., Norenburg, M. D. Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina. Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).
- Derouiche, A., Rauen, T. Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance. J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).
- Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).
- Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).
- Cameron, D. A., Carney, L. H. Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly. J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev Biol. 6, 36 (2006).
- Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
- Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits. Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).
- Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. (2), 223-234 (2008).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J Vis Exp. (80), e51017 (2013).
