Summary
Zebra balığı retina dejenerasyonu/rejenerasyon omurgalılarda mekanizmaları incelemek için popüler bir hayvan modelidir. Bu iletişim kuralı yerelleştirilmiş yaralanma dış retina iç retina en az hasar ile kesintiye neden yöntemi açıklanır. Daha sonra in vivo retina morfoloji ve Müller glia yanıt retina yeniden oluşturma işlemi boyunca izliyoruz.
Abstract
Teleost ve memeliler arasında büyüleyici bir fark teleost retina retina neurogenesis ve yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra ciddi hasar için ömür boyu potansiyelidir. Zebra balığı rejenerasyon yollar soruşturma memelilerde retina dejeneratif hastalıkları tedavisi için yenilikçi stratejiler geliştirmek için yeni anlayışlar getirebilir. Burada, biz Fokal lezyon yetişkin Zebra balığı dış retinada için indüksiyon yoluyla 532 nm diode lazer odaklı. Yerelleştirilmiş bir yaralanma retina dejenerasyonu ve hasar alan, doğrudan rejenerasyon sırasında gerçekleşecek biyolojik süreçlerin soruşturma sağlar. Non-invaziv optik Koherens tomografi (OCT) kullanarak, biz were güçlü-e doğru bozuk alan ve monitör sonraki rejenerasyon konumunu tanımlamak içinde vivo. Gerçekten de, OCT görüntüleme histolojik analizler ile daha önce yalnızca bilgi veren Zebra balığı retina, yüksek çözünürlüklü, kesitsel görüntüler üretir. Gerçek zamanlı OCT verilerden onaylamak için histolojik kesitler gerçekleştirilen ve retina yaralanma indüksiyon sonra rejeneratif yanıt immünhistokimya tarafından araştırıldı.
Introduction
Vizyon muhtemelen insanın en temel anlamda ve onun bozulma bir yüksek sosyo-ekonomik etkisi vardır. Sanayileşmiş dünyada retina dejeneratif hastalıkları görme kaybı ve körlük arasında1yetişkin nüfusun çoğunluğu için hesap. Retinitis pigmentosa (RP) körlüğü yaklaşık 1.5 milyon kişi dünya çapında2,3etkileyen 60 ve 20 yaşları arasındaki kişilerde en sık devralınan nedenidir. Kalıtsal retina bozuklukları dejenerasyonu retina pigment epiteli ve daha sonra gliosis tarafından takip ve iç nöronlar4remodeling ilerici kaybı photoreceptors (PRs) tarafından karakterize heterojen bir ailedir. Hastalığın seyrini genellikle çubuklar, loş ışık ve renk görme ve görme keskinliği5için gerekli olan, koniler akromatik vizyon için sorumlu olan ile başlayan iki PR hücre tipleri, artımlı kaybı açıklanabilir. RP neden için yeterli bir tek gen kusurdur. Defa 130'dan fazla 45'in üzerinde genlerdeki mutasyonlar hastalığı6ile ilişkili bulunmuştur. Bu değişen hastalığı fenotipleri yol açar ve gen tedavisi olmayan genelleştirilebilir bir neden ve böylece karmaşık bir tedavi yaklaşımı. Bu nedenle, hastalıklar kör olarak retina dejenerasyonlar tedavisinde yeni genel tedavi yaklaşımları geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır.
Retina dejenerasyonu kez PR kaybı içerir; Bu nedenle, PR hücre ölümü dejeneratif süreçleri retina7özelliğidir. Zaten PR hücre ölümü Müller glia hücre (MC)8harekete geçirmek ve nükleer silahların yayılmasına karşı uyarır gösterilmiştir. MCs, omurgalı retina büyük gliyal hücre tipinde bir kez kabul "yapıştırıcı" başka bir şey olmak arasında retina sinir hücreleri. Son yıllarda, birçok çalışma daha fazla sadece yapısal9çekmek gibi MCs hareket göstermiştir. Farklı fonksiyonları arasında MCs da neurogenesis içinde katılmak ve10onarmak. Nitekim, karşılık diffusible faktörler degenerating retina, MCs önemli ölçüde gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) ifade artırın. Bu nedenle, retina hasarı ve dejenerasyon11ikincil bir tepki olarak MC harekete geçirmek için bir işaret olarak GFAP'nin etiketleme kullanılabilir.
Son zamanlarda, Zebra balığı (Danio rerio) retinal dejenerasyon ikna etmek için bir lazer kullanarak odak yaralanma bir roman uyarlaması geliştirdik. Odak yaralanma hücre yaralı siteye geçiş ve retina rejenerasyon12sırasında gerçekleşen olayların hassas zamanlama gibi bazı biyolojik süreçlerin eğitimi için avantajlıdır. Ayrıca, Zebra balığı onun görsel sistem ve bu diğer omurgalıların arasındaki benzerlikleri nedeniyle görsel araştırma önemli hale gelmiştir. İnsan ve teleost retinae brüt morfolojik ve histolojik özellikleri bazı farklılıklar görüntüler. Buna göre insan ve Zebra balığı retinae retina projeksiyon nöronlar, ganglion hücrelerinin en içteki içinde ikamet ederken nerede ışık algılama photoreceptors en dış katmanı işgal aynı katmanlı model düzenlenen aynı büyük hücre sınıfları içerir nöronal katmanı, lens proksimal. Retina interneurons, amacrine, bipolar ve yatay hücreler, photoreceptor ve ganglion hücre katmanları13arasında yerelleştirilmesine. Ayrıca, Zebra balığı retina koni egemen olduğu ve bu nedenle daha, örneğin, çalışılmış kemirgen retina insan retina için yakın olduğunu. Büyüleyici bir fark teleost ve memeliler arasında balık retina ve retina yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra hasar kalıcı neurogenesis vardır. Zebra balığı, MCs dedifferentiate ve rejenerasyon yaralı retina14,15dakika sonra arabuluculuk. Tavuk, MCs aynı zamanda hücre döngüsü yeniden girmek için ve dedifferentiate için bazı kapasitesine sahiptir. Retina yaralanma yetişkin balık MCs Dede ve kök hücre belirli özellikleri kabul, hasarlı retina dokusu ile göç ve yeni nöronlar16üretmek. Gen ifadesi memeli MCs profil oluşturma retina ataları beklenmeyen benzerlikler ortaya ve MCs içsel Nörojenik potansiyelini tavuk, kemirgen ve insan bile retina için kanıt17büyüyor. Yine de, neden kuşlar ve memeliler rejeneratif yanıtta düşük güçlü yanıt olarak balık ile karşılaştırıldığında henüz anlaşılamamıştır. Bu nedenle, Zebra balığı endojen tamir mekanizmaları anlama stratejileri uyarıcı retina rejenerasyon memeliler ve insanlar için önerebilir miyim? MCs retina dejenerasyonu olan hastaların tedavisi için endojen onarım mekanizması bir tedavi aracı olarak istihdam bizim toplum için olağanüstü bir etkisi olurdu.
Burada, biz göze ait araştırma dejenerasyon/rejenerasyon modelinde istihdam için gerekli adımları sağlar. Biz ilk neurosensory retina görüntüleme yaralanma site ve son olarak görüntülenmesi bitişik MCs katılımı gelişen olayların ardından üzerinde odak hasar inducing üzerinde duruldu. Genel iletişim kuralı gerçekleştirmek nispeten kolay ve çok çeşitli retina daha sonra değerlendirmek için olanaklar açar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
tüm deneylerin hayvanlar kullanım Ophthalmic ve vizyon araştırma vizyon ve Oftalmoloji (ARVO) Araştırmaları Derneği için beyannameyi yapıştırılır ve hükümet yetkilileri ilgili düzenlemelerin saygı.
1. hayvanlar
- TgBAC korumak (gfap:gfap-GFP) Zebra balığı 167 (AB) zorlanma yaşları 6-9 ay içinde su sıcaklığını 26.5 ° C ile standart koşullar altında ve 14/10 h açık/koyu döngüsü 18 arasında.
- Hayvan bakımı yönergeleri hayvan deneyleri için ilgili kurumların hükümet yetkilileri tarafından onaylandıktan sonra izleyin.
2. Tersine çevrilebilir sistemik anestezi
- hazırla tricaine tozu 97,9 ml su tankı ve Tris 1 m 2.1 mL 400 mg eriterek tarafından etil 3-aminobenzoate methanesulfonate tuz (tricaine) stok çözüm tamponlu tuz (TBS). PH 7,0 1 M Tris (pH 9) ve mağaza içinde bir ay karanlık ilâ 4 ° C'de uyum.
Not: Tricaine gibi doğal yaşam koşulları hayvanın suda hazırlanmalı, tercihen orijinal tank su kullanılmalıdır. - Tank su içinde hisse senedi çözüm 1:25 sulandırmak ve hemen kullanın.
- 10 cm Petri kabına kadar hareketsiz hale ve dış uyaranlara karşı (yaklaşık 2-5 dk, ağırlık ve yaş bağlı olarak) yanıt vermeyen 50 mL anestezi çözeltisi içeren Zebra balığı yerleştirin.
- Transfer her balık el ile lazer tedavisi ( şekil 1A) için bir özel silikon pim tutucu.
DİKKAT! Balık tank için 10 dakikaya kadar sadece dışında imzalat kalabilir. - Anestezi tedavi ve/veya görüntüleme sonra tersine çevirmek için Zebra balığı su tankı içeren kapsayıcısına getirin.
- Kurtarma desteklemek için bir akışı taze tank su üzerinde solungaçları Zebra balığı suyun içinde ileri geri hareket ettirerek oluşturun.
3. Lazer odak yaralanma Retina üzerinde
Not: A 532 nm diode lazer Zebra balığı retina üzerinde odak hafif hasar oluşturmak için kullanılır. Lazer deneysel up yetişkin Zebra balığı tekrarlanabilir bir odak retina yaralanma kurulması sağlar.
- Lazer çıkış gücü kadar ayarla: 70 mW; hava çapı: 50 µm; darbe süresi: 100 Bayan
dikkat! Uygun kişisel koruma ve bölgesinin kalbinde etiketleme lazer ışık kullanımı gerektirir. - 1-2 damla % 2 hydroxypropylmethylcellulose topikal tedavi öncesi gözünde uygulayabilir ve lazer hedefleyen ışın retina üzerinde odaklanmaya 2.0 mm fundus lazer lens kullanabilirsiniz.
DİKKAT! hydroxypropylmethylcellulose damla viskoz ve solungaçları üzerinde giderse nefes sorunlara neden olabilir. - Yer dört lazer noktalar görme sinirine soldaki çevresinde göz ve doğru tedavi edilmezse göz iç kontrol kullanın.
4. Vivo Retina morfolojisi Imaging
- gün 0, Zebra balığı retina doğrudan lazer indüksiyon sonra anesteziden canlandırıcı olmadan görselleştirmek. Tüm diğer zaman puan, istihdam genel anestezi (Bölüm 2 bkz: geri dönüşümlü sistemik anestezi). Özel yapım silikon pim tutucu ( şekil 1 B, B.1) üzerinde immobilize Zebra balığı yerleştirin. En iyi görüntü elde etmek
- kesmek Zebra balığı göz sığdırmak için piyasada bulunan hidrojel Kontakt lens (Ø 5.2 mm, r = 2.70 mm, Merkezi kalınlık = 0.4 mm =) aracılığıyla bir delik yumruk. Objektif içbükey yüzeyi methylcellulose ile doldurmak ve kornea yerleştirin.
- 78 D temassız slit lamba camı OCT sistemiyle teçhiz.
- Kızılötesi (IR) görüntünün IR içinde odak + OCT modu (fundus göz görselleştirmek ve IR almak şekil 2A) resimleri tıklayarak " edinme " düğmesini ( şekil 2B yerelleştirmek için) Lazer sistemiyle retina lekeler ' s yazılım.
- Visualize IR + OCT retina katmanlarda üç boyutlu bir bölümünü modu ve tıklatarak resimleri almak " edinme " düğmesini ( şekil 2B). Dış nükleer tabaka (yalnız) yaralanma şiddeti gözlemlemek (bkz. Bölüm 3: lazer odak yaralanma retina üzerinde) bu görüntüler.
- Tedavi ve/veya görüntüleme tank su içeren bir kap içinde Zebra balığı yerleştirdikten sonra anestezi tersine çevirmek için.
- Kurtarma desteklemek için bir akışı taze tank su üzerinde solungaçları Zebra balığı suyun içinde ileri geri hareket ettirerek oluşturun.
- Retina morfolojisi benzer vivo içinde görüntüleme gerçekleştirmek 1 gün, 3, 7, 14 ve hafta 6.
5. Hematoksilen & Eozin (H & E) Staining
- batma içine soğuk (4 ° C) tarafından Zebra balığı ötenazi anestezi çözüm için en az 10 dk ve anlatabilirsin buzda gözleri hemen tarafından anlamına gelir küçük eğri forseps.
- Fosfat tamponlu tuz (PBS) 20 h için 4 ° C'de % 4 paraformaldehyde (PFA) bütün gözünde düzeltin ve sonra kademeli alkol serisi örneklerinde kurutmak (Ksilen %100 5 min iki kez için etanol %100 5 min iki kez için etanol %96 3 dk iki kez ve etanol %70 3 mi n bir kez).
DİKKAT! İngiltere'de yılın gözler, burun ve üst solunum yolu izlemek için rahatsız edici olabilir. İngiltere'de yılın olduğu bilinen bir insan kanserojen ve şüpheli bir üreme tehlike. - Parafin içinde örnekleri katıştır, optik sinir başı düzeyde 5 µm bölümleri kesilmiş ve cam slaytlarda mount.
- % 0.1 asit Hematoksilen çözüm 5 min için deparaffinized bölümlerle leke ve hidroklorik asit karışımı slaytları daldırma sonra iki kez distile su içindeki slaytları daldırma (250 mL HCl % 25 2 mL distile su) ve amonyak (2 mL % 25 amonyak 250 ml karışımı distile su). Musluk suyu en az 10 dakika süreyle tarafından boyama Hematoksilen gelişimi sonra Eozin G sulu çözüm %0,5 3 dk bölümlerle leke
- Akrilik Reçine montaj orta susuz slaytları mount ve slaytları ışık mikroskobu altında dikkat.
6. İmmünhistokimya MC harekete geçirmek için
- antijen alma arabelleği (Tris-EDTA + %0,05 non-iyonik deterjan, pH 9.0) için uygun bir vapur veya bir mikrodalga fırında 10-15 dk 3 dk deparaffinized bölümlerde ısı ve yıkama üç kez TBS ile 5 için Min her.
- Bir silikon bölümlerle kalem ve 100 µL eklemek daire, oda sıcaklığında 1 h. için çözüm (TBS + %10 keçi normal serum + %1 sığır serum albümin, pH 7,6) engelleme
- Leke anti-gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) tavşan poliklonal antikor ve anti-glutamin sentetaz (GS) fare Monoklonal antikor, 1: 200 seyreltme (örnek başına 40 µL) her ikisi de. Slayt 4 ° C'de oksijen odasında gecede kuluçkaya. Üç kez TBS + % 0.1 ile yıkama ara 20 5 min için.
- Bitiş görselleştirme ile uygun ikincil antikorlar. Bu iletişim kuralı bir keçi Anti-tavşan IgG H kullanılan & GFAP'nin ve bir keçi Anti-fare IgG H L yeşil ikincil antikor & L parlak kırmızı GS, 1 h için oda sıcaklığında 1:500 seyreltme her ikisi için
- Slaytlar ile montaj orta DAPI içeren dağ ve floresan mikroskop altında slaytlar gözlemlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gerçek zamanlı OCT: MCs rol retina tamir amacıyla, biz iyi arasındadır bölgenin Zebra balığı retina hasar inducing bir lazer yaralanma modeli kullanılır. Hasar sitenin içinde vivo OCT yaralanma (şekil 3) takip 60 dakika içinde ilk kez (0 gün) aracılığıyla görüntüsü. Balık gözü optik için telafi etmek için özel yapım bir kontakt lens kornea üzerinde yerleştirildi. Hemen sonra lazer tedavisi, diffüz bir yansıtıcı hiper sinyal dış retina (oklar) Lokalize. Retina Pigmentli epitel (RPE) dış Pleksiform tabaka (OPL) için genişletilmiş. Benzer bir sinyal de 1 gün algılanabilir. 3 gün sonra bu yaygın sinyal daha düzenli ve yoğun oldu. Sürekli dış nükleer tabaka (yalnız) photoreceptor katmanın uzanan görülmüş. İlk hafta (7 gün), ortalama lezyon boyutu önemli bir azalma olduğunu ve sadece küçük bir yansıtıcı hiper sinyal algılandı. En son zaman noktası (hafta 6) soruşturma kadar 14 günden başlayarak, lazer noktalar artık IR ve OCT Albümdeki görünür edildi.
Histolojik değerlendirme retina dejenerasyonu/rejenerasyon: ölçüde ve Kinetik retina dejenerasyonu/rejenerasyon, H araştırmak için & E boyama sonra hasar indüksiyon (gün 0, 1, 3, 7, 14 farklı zaman noktalarda istihdam yapıldı. ve hafta 6) (şekil 4). Üç balık üç gözlü üzerinde deneyler yapıldı. Ancak, bu yazının amacı yöntem göstermektir hiçbir istatistiksel analiz gerçekleştirildi. İç nükleer tabaka (INL) ince değişiklikleri ve dit lazer tedavi aşağıdaki 60 dakika içinde görülen hemen sonrası lazer (Örneğin, hafif ödemi dit) ve hücreler arası uzayda azaltılmış: INL olabilir. Dejenerasyon lazer yaralanma indüksiyon sonra 6 hafta boyunca izledi. Morfolojik değişiklikler sürekli PRs dağınıklığı ve yalnız ve subretinal uzay boşluğuna oluşumu ile 1 gün sonra gözlendi. Gerçekten, çekirdek içinde 1-7 gün arasında hasar alanında dit kaybı oldu. Maksimum PR kaybı 3 günde bulundu. 14 gün sonra 6 haftalık başlayarak, dış retina yeniden normal morfolojisi kurmuştu.
Gliyal katılımı sırasında retina dejenerasyonu/rejenerasyon: MC aktivasyon (günü 0, 3, 14) farklı zaman noktalarda değerlendirmek için retina dejenerasyonu indüksiyon, gliyal hücreye veri işaretleyicilerini GS için immunohistokimyasal analizleri gerçekleştirilen ve GFAP'nin (şekil 5). Deneyler tekrar üç gözlü kantitatif analiz olmadan üç balık üzerinde yapıldı. GS ekstraselüler Glutamat düzeyini kontrol önemli bir rol oynar ve sadece MC soma ve onun işlemler19,20ifade edilebilir kabul edilir. GFAP'nin upregulated yaşlanma ve retina hasar veya vurguladı sırasında var. MC son ayaklarda yerelleştirilmiştir ve21işler. Zayıf GFAP'nin ifade de etiketleme diğer gliyal hücre tipleri, Örneğin, astrocytes yaralanmamış kumandalı retina iç kısmında bulundu. PR dış segmentleri autofluorescence da dit sinyal sağlanan ama bu açıkça ayırt edici olabilir. 3. gün sonrası yaralanma upregulated GFAP'nin sinyaldi. Böylece, yalnızca içinde retina dit yaralanma sitedeki GFAP'nin pozitif MCs gösterdi gün 3 lazer tedavisinden sonra analizleri gerçekleştirilen. 14 günden rejenerasyon büyük ölçüde tamamlandı ve GFAP'nin sinyal downregulated temel düzeye hasar alan oldu. GFAP'nin farklı olarak GS ifade düzeyini önemli bir değişiklik vardı. Ancak, GS yaralanma yerinde yerelleştirilmiş bir downregülasyon olabilirdi.
Şekil 1: Kurulum için lazer yaralanma Zebra balığı retina ve OCT analiz takip indüksiyon. (A) lazer sistemi tedavi öncesi tanzimi. (A.1) Zebra balığı silikon pim tutucu fundus Kontakt lens yerde hemen önce uygulanması lazer ışını ile yerleştirilir. (B) görüntüleme önce OCT sistemin düzenlenmesi. (B.1) Zebra balığı yer 78D slit lamba camı hasar sitelerinin algılanmasını önce önce Ekim yoluyla Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Kurulum IR ve OCT görüntüleri elde etme için. (A) görüntüleme sırasında yazılım penceresinin ekran görüntüsü. IR ve OCT modları tasvir edilmektedir. (B) görüntüleri elde etmek için kullanılan panel genel bakış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: IR (solda) ve OCT (sağda) görüntüleri aynı retinada yaralı ve yaralı sitelerin farklı zamanda göz puan (gün 0, 1, 3, 7, 14 ve hafta 6) lazer kaynaklı retina dejenerasyonu sonra. IR görüntülerde vardır retina bölümü analiz yeşil bir kutu gösterir ve yeşil hat OCT görüntülerin retina üzerinde gösterir. Okları gösterir siteler Ekim ölçek çubuğu yansıtıcı hiper sinyalleri olarak belirlenen lazer noktalar 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: H & E yaralı ve kontralateral yaralanmamış boyama Zebra balığı göz farklı zamanda puan (gün 0, 1, 3, 7, 14 ve hafta 6) lazer kaynaklı retina dejenerasyonu sonra. GC, ganglion hücre katmanı; INL, iç nükleer tabaka; DİT, dış nükleer tabaka. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: MC harekete geçirmek tespiti immunohistokimyasal. GFAP'nin (yeşil) ve GS (kırmızı) lazer kaynaklı retina dejenerasyonu sonra puan (gün 0, 3, 14) yaralı ve yaralı Zebra balığı retinada farklı zamanda boyama. PR o autofluorescence nedeniyle dit içinde yeşil sinyalidiruter kesimi. Hücre çekirdeği ile DAPI (mavi) lekeli. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebra balığı retina rejenerasyon/dejenerasyon Sitotoksin aracılı hücre ölüm22, mekanik yaralanma23ve termal yaralanma24gibi farklı yaklaşımlarla incelemeye gittim. Zebra balığı retina hasar için 532 nm diode lazer çalıştırmaya başladık. Böylece, bizim modeli birçok avantaj sunar. Örneğin, biz hızla PRs katmanındaki özellikle dış retina lokalize yaralanma iyi tanımlanmış bir alan oluşturdu. Ayrıca, bu deneysel kurulum Bruch'ın membran choroidal neovaskülarizasyon ikna etmek için zarar tarafından diğer biyolojik süreçler, örneğin, çalışmaya hasar büyük alanları üretmek için değiştirilebilir. En az teminat hasar ve rejeneratif yanıt zamanlama tam ve tekrarlanarak modülasyonlu.
Zaman içinde phenotypical değişiklikleri takip etmek, Heidelberg Spectralis sistemi ve Heidelberg göz Explorer yazılım istihdam. Böylece, fundus IR görüntüleme içinde Zebra balığı özellikle yararlı bulundu. Lazer nokta ve çevresi arasında düşük kontrast gösteren fundus autofluorescence (AF), hasarlı siteleri tarafından IR görüntüleme yerelleştirmek daha kolay olur. Bu bize değişiklikleri algılamak için ve yenilenme vivo, hangi AF modu ile mümkün olmazdı izlemek için izin verir. Daha önce raporlanmış25, OCT Zebra balığı retina dejeneratif/yeniden üretim süreçlerinde izlemek için kullanılabilir. Bizim modelinde retina lazer yaralanma dit (şekil 3), hiper-yansıtıcı bir grupta olarak memeliler26yılında bildirilmiştir için benzer olduğu tespit edilmiştir. Gün 14 tamamen kayboldu kadar yeniden oluşturma işlemi sırasında yansıtıcı hiper sinyal azalmıştır.
OCT görüntüleri lazer lezyonları (şekil 4) içinde görülen morfolojik değişiklikler ile ilişkili. Diffüz yansıtıcı hiper sinyal OCT görüntüler (0 gün) 1 saat içinde lazer tedavi aşağıdaki euthanized Zebra balığı INL görüldüğü sonrası lazer değişiklikleri temsil eder. İyi arasındadır ve ince yansıtıcı hiper sinyali algılandı gün 3 çubuk kaybı nedeniyle dit kavite oluşumunda karşılık gelir. Günü 14, her iki Ekim başlayan ve histolojik analizler onaylamak dış retina yeniden normal morfolojisi kurmuştu.
Bu da çalışmanın, biz Ayrıca retina yeniden oluşturma işlemi sırasında (şekil 5) MC yanıt değerlendirildi. Birçok grup zaten MCs, özellikle, gliyal hücrelerini harekete geçirmek bir ilk rejeneratif yanıt-e doğru zarar olarak araştırdık. Daha ayrıntılı olarak, patofizyolojik MC harekete geçirmek MCs kök hücre özellikleri, retina27hasarlı bölgeleri entegre edilebilir yeni işleyen hücre tipleri endojen bir kaynak sağlayarak benimsemeye neden olabilir tavsiye ettiler. Beklendiği gibi GFAP'nin upregulation tarafından belirtildiği gibi retina lazer yaralanma MC harekete geçirmek uyarılmış buldum. Gerçekten de, artan GFAP'nin ifade son derece 3 gün sonrası yaralanma algılandı ve hasar alan sınırlı idi. 14 günden başlayarak, rejenerasyon büyük ölçüde tamamlandı ve GFAP'nin sinyal downregulated hasar alan temel kademede için oldu. Böylece, MCs yaralanma sonrasında retina yeniden yapılanma ve potansiyel olarak yeniden oluşturma işlemi, etkin bir rol oynamak göstermiştir.
Sonuç olarak, lazer kaynaklı retina dejenerasyonu/rejenerasyon model Zebra balığı retina hızlı ve odak zarar üretmek için çok yönlü bir araçtır ve aşağıdaki rejenerasyon görselleştirildiği yanında non-invaziv OCT düşsel. Ayrıca, lazer-retina dejenerasyonu MC etkinleştirme tarafından eşlik ediyor ve bunu takip eden gliosis yenilenme ters göstermek başardık. Ancak, ilgili hücre türleri (Örneğin, microglia, makrofajlar) ve yollar ayrıntılı bir soruşturma yapılması gerekir. Kritik değişiklikler, özellikle daha iyi rejeneratif işlemi (Örneğin, özgün INL konumlarında PRs katmanındaki özellikle dış retina içine göç) sırasında nasıl davranıyorlar anlamak için MCs izlenmesine yaşayan gerekli olabilir ve onların farklılaşma doğru PR hücreleri. Alternatif olarak, hafif hasar paradigmalar yaygın ve tutarlı kaybı çubuk ve koni PRs28ikna etmek için kullanılabilir. Ancak, açıklanan modelin avantajı nerede bir yerel Hofstede oluşan bozucu photoreceptors ve aktif MCs eğitim görebilirsiniz bir daha tanımlı yaralanma alandır.
Genel olarak, model duyusal retinanın dejeneratif/yeniden üretim süreçlerinde daha iyi anlamak için yardımcı olacaktır ve bu gelişmeler memeli sistemi ile karşılaştırma etkinleştirmek inanıyoruz. Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin etkisi ve neuroactive maddelerin etkilerini incelemek için de kullanılabilir. Gelecekte, degenerating insan görsel sistemi değiştirmek için bu sonuçlar kullanmak mümkün olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Martin Zinkernagel, MD, PhD ve Miriam Reisenhofer, doktora Federica Bisignani ve model onun mükemmel teknik yardım için kurulması, onun bilimsel giriş için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
References
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Berson, E. L. Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).
- Strettoi, E. A Survey of Retinal Remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 494 (2015).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications. Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).
- Pierce, E. A. Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations. BioEssays. 23, 605-618 (2001).
- Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury. Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).
- Newman, E., Reichenbach, A. The Müller cell: a functional element of the retina. Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).
- Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates. Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).
- Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats. Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).
- DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
- Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina. Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).
- Xia, X., Ahmad, I. Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia. Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).
- Riepe, R. E., Norenburg, M. D. Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina. Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).
- Derouiche, A., Rauen, T. Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance. J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).
- Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).
- Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).
- Cameron, D. A., Carney, L. H. Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly. J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev Biol. 6, 36 (2006).
- Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
- Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits. Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).
- Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. (2), 223-234 (2008).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J Vis Exp. (80), e51017 (2013).
