Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تجديد ميكروليكتروديس الذهب صفت مجهزة لهو محلل خلية في الوقت الحقيقي

Published: March 12, 2018 doi: 10.3791/56250
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 3, 1, 4
1School of Public Health, Nanjing Medical University, 2School of Pharmacy, Nanjing Medical University, 3State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing Tech University, 4Department of Medical Oncology, Jiangsu Cancer Hospital, Jiangsu Institute of Cancer Research, The Affiliated Cancer Hospital of Nanjing Medical University
* These authors contributed equally

Summary

ويصف هذا البروتوكول وضع استراتيجية عامة لتجديد التجارية ميكروليكتروديس الذهب صفت مجهزة لهو محلل خلية خالية من التسمية تهدف إلى إنقاذ على فحوصات أوفميكروتشيب-على أساس تكاليف تشغيل عالية. وتشمل عملية التجديد الهضم التربسين، الشطف مع الإيثانول والمياه، وخطوة لغزل، الذي يتيح للاستخدام المتكرر للرقائق.

Abstract

تحليل يستند إلى الخلية خالية من التسمية مفيد لدراسة الكيمياء الحيوية نظراً لأنها لا تتطلب استخدام الحيوانات التجريبية. نظراً لقدرته على توفير معلومات أكثر دينامية حول الخلايا تحت ظروف فسيولوجية من فحوصات الكيمياء الحيوية الكلاسيكية، هذا الإنزيم الخلية خالية من التسمية في الوقت الحقيقي على أساس مبدأ مقاومة كهربائية هو جذب المزيد من الاهتمام في الماضي العقد. ومع ذلك، قد يكون استخدامها العملي محدودة بسبب تكلفة باهظة الثمن نسبيا للقياس، والتي تستخدم لمحلل الخلية مكلفة الرقائق الذهب المتاح للاستهلاك. في هذا البروتوكول، قمنا بتطوير استراتيجية عامة لتجديد ميكروليكتروديس الذهب صفت مجهزة لهو محلل خلية خالية من العلامة تجارية. وتشمل عملية التجديد الهضم التربسين، الشطف مع الإيثانول والمياه، وخطوة لغزل. الطريقة المقترحة قد تم اختبارها وأظهرت أن تكون فعالة للتجدد والاستخدام المتكرر للوحات الإلكترونية التجارية ثلاث مرات على الأقل، التي ستساعد الباحثين حفظ على التكلفة العالية لفحوصات الخلية في الوقت الحقيقي.

Introduction

نظراً لأن كفاءة وأقل عملية تجريبية ذات العمالة الكثيفة، خالية من تسمية الخلية المستندة إلى التكنولوجيا شهدت نمواً سريعاً على مدى العقد الماضي لأغراض تحليلية، فضلا عن الفحص كما هو الحال في الجانب المتعلق بالبروتينات1،2 ، المخدرات تسليم3، إلخ4،5 مقارنة مع أساليب الكيمياء الحيوية التقليدية تهدف إلى تحليل الخلية، فحص الخلية خالية من التسمية في الوقت الحقيقي مع النموذج الأولى وضعتها جيفيير وزملاء العمل السابق6 يرتكز على مبدأ تسجيل التغييرات إشارة كهربائية على سطح الرقائق الدقيقة المرفقة بالخلية، التي تسمح بقياس مستمر لنمو الخلايا أو الهجرة بطريقة كمية. وفي أعقاب هذه الاستراتيجية، أطلق خلية في الوقت الحقيقي إلكترونية الاستشعار عن نظام (RT-مؤتمر الإحصائيين الأوروبيين) باستخدام مبدأ الكشف على أساس مقاومة كهربائية تم إدخال7،8 وهو محلل تجاري خلية في الوقت الحقيقي (RTCA) في الآونة الأخيرة لمختبر البحوث9.

محلل الخلية في الوقت الحقيقي التجاري أساسا يقرأ إشارات مقولة الخلايا لمقاومة الكهربائية، التي تنتج عن التغيرات الفسيولوجية للخلايا المحتضنة بما في ذلك انتشار الخلايا، والهجرة والبقاء، ومورفولوجيا والتقيد سطح الرقائق الدقيقة10،11. كذلك يتم تحويل هذه الإشارات الكهربائية بالمحلل إلى معلمة هو اسم فهرس الخلية (CI) لتقييم حالة الخلية. تغيير المقاومة من الرقائق الدقيقة أساسا يعكس البيئة الأيونية المحلية الخلايا المغطاة في واجهة القطب/الحل. ولذلك، الأداء التحليلي لمحلل الخلية تعتمد اعتماداً كبيرا على وحدة الاستشعار الأساسية، المتاح من الرقائق الدقيقة (أي، ما يسمى لوحات إلكترونية، مثلاً، 96/16/8-جيدا)، التي تصنع من صفت ميكروليكتروديس الذهب طباعة ليثوجرافيكالي في الجزء السفلي من الآبار الحضانة. ميكروليكتروديس الذهب التجمع في شكل خط في الدائرة (الشكل 1)، وتغطي معظم مساحة السطح من الآبار الحضانة، التي تسمح بالكشف عن الخلايا المرفقة3،12،13 حيوية وحساسة ،14. كاريتاس الدولية سوف تزيد في حالة المزيد من التغطية السطحية للخلايا على الرقاقة، وينخفض عندما تتعرض الخلايا لأنها سامة أسفر عن المبرمج. على الرغم من أن محلل الخلية في الوقت الحقيقي قد استخدمت غالباً لتحديد سيتوتوكسيسيتي11 والسمية العصبية15 وتوفير معلومات الحركية أكثر من أسلوب النهاية الكلاسيكية، لوحات إلكترونية يمكن التخلص منها هي تكلفة الاستهلاكية.

وحتى الآن، كانت هناك لا الأساليب المتاحة لتجديد اللوحة الإلكترونية، التي ربما يرجع ذلك إلى حقيقة أن شروط تجديد قاسية، مثل حمض الخليك أو حل البيرانا هي17تشارك16،، 18، وقد تغير الوضع الكهربائية للرقائق الذهبية. ولذلك، سوف يكون أسلوب معتدل وتتسم بالكفاءة لإزالة الخلايا ملتصقة وغيرها من المواد من سطح رقائق الذهب مرغوب فيه لعملية تجديد اللوحة الإلكترونية. وقد وضعنا مؤخرا بروتوكول يهدف إلى تجديد لوحات الإلكترونية المتاح باستخدام كواشف غير قابلة للتآكل ورقائق المجددة اتسمت الطرق الكهروكيميائية فضلا عن البصري19. باستخدام الكواشف المختبرية متوفرة بسهولة ومعتدلة بما في ذلك التربسين والايثانول، وقد أنشأنا طريقة عامة لتجديد اللوحة الإلكترونية التجارية دون الآثار السلبية، التي يتم تطبيقها بنجاح على تجديد هما النوعان الرئيسيان لوحة إلكترونية (16 و L8) المستخدمة ل RTCA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: بشكل عام، عملية التجديد يشمل الهضم التربسين والشطف خطوة مع الإيثانول والمياه. وقت الهضم تتغير وفقا لعدد الخلايا المستخدمة ونوع وعدد من الخلايا المستخدمة قد تختلف تبعاً لأغراض تجريبية. وينصح للتحقق من الرقائق المجددة استخدام أساليب البصرية والكهروكيميائيه لتحسين شروط التجديد. أثناء التجربة، قد ينطوي الأمر على المواد الكيميائية القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان، ومن هنا ترد تفاصيل هاتين الحالتين نموذجية لإجراءات التجديد.

1-إعداد حلول التجديد

ملاحظة: إعداد والتعامل مع جميع الحلول تحت ظروف معقمة.

  1. إعداد حل التربسين 0.25% (g/v) جديدة. التربسين يمكن شراؤها أو طازج كما يلي.
    1. حل ز 0.25 من التربسين في 100 مل من الأس الهيدروجيني 7.4 مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
    2. إثارة الحل حتى التربسين تماما يذوب في 4 سيقلب جيم الحل بسرعة منخفضة مع الحرص على تجنب أي تشكيل فقاعة.
    3. تصفية الحل مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر في هود السلامة الأحيائية.
  2. تحضير الإيثانول 75% استخدام الإيثانول المطلقة. صب الإيثانول المطلقة 75 مل دورق حجمي وإضافة المياه حتى يصل الحجم 100 مل. إجراء التعقيم المزيد إذا لزم الأمر.

2-الحضانة وانتشار خلايا A549 في لوحات إلكترونية

ملاحظة: اللوحة الإلكترونية أنواع 16 و L8 سواء مصنوعة من ميكروليكتروديس الذهب صفت ليثوجرافيكالي المطبوعة في الجزء السفلي من الآبار حضانة. اللوحة الإلكترونية 16 لديه 16 بئرا بينما اللوحة الإلكترونية L8 8 آبار. آبار اللوحة الإلكترونية 16 جولة بينما آبار اللوحة الإلكترونية L8 المستطيلات مستدير الزوايا. كذلك هو حجم كل لوحة إلكترونية 8 ميليلتر حوالي 830 وكل لوحة إلكترونية 16 أيضا حوالي 270 ميليلتر.

  1. A549 خلية ثقافة
    1. طبق البنسلين-ستربتوميسين في ثقافة الخلية خلايا A549 الثقافة في روزويل بارك التذكاري المعهد-1640 المتوسطة (ربمي-1640) تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، و 1%.
    2. مرور الخلايا عندما تصل كثافة الخلية ~ 75% ثم يغسل طبقة الخلايا ملتصقة مع 1 × برنامج تلفزيوني وتريبسينيزي مع الحل التربسين 0.25% لمدة 1 دقيقة في 37 سجيم الطرد المركزي الخلايا في 179 × ز لمدة 5 دقائق لإزالة التربسين. ريسوسبيند الخلايا في المتوسط 10 مل لمزيد من الثقافة أو غيرها من التجارب.
      ملاحظة: حل الخلايا حراكه في الأجل المتوسط هنا سميت المخزن المؤقت تعليق خلية.
    3. تأخذ 10 ميليلتر وحساب عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير. استخدام المتوسط RPMI 1640 إلى تمييع زيادة المخزن المؤقت تعليق خلية لإعداد المخزن المؤقت لتعليق خلية خلايا/مل 30,000-80,000 للتجارب.
  2. اكتساب التجربة وبيانات الانتشار/سيتوتوكسيسيتي
    1. إضافة 50 ميليلتر (150 ميليلتر للوحة الإلكترونية L8) خلية متوسطة لكل حضانة جيدا من اللوحة الإلكترونية 16 وإجازة 30 دقيقة في مجال السلامة الأحيائية غطاء للموازنة. إدراج لوحة إلكترونية 16 يدوياً في الخلية في الوقت الحقيقي المحلل في الحاضنة2 CO في 37 ياجيم
    2. إطلاق برنامج تشغيل محلل الخلية في الوقت الحقيقي على الكمبيوتر. في الافتراضي الخاص به تجربة نمط إعداد الصفحة، حدد "اختبار نموذج" واسم الفحص قيد التشغيل.
    3. على تخطيط الصفحة، حدد الآبار المقابلة التي ترد في التجربة وإدخال المعلومات مثل أسماء الخلية نوع وعدد والمخدرات في مربعات التحرير. في الصفحة الجدول الزمني، إضافة الخطوات التجريبية، ثم حدد إدارة الوقت (مثلاً، 12 أو 24 أو 48 ساعة) لكل خطوة والفاصل الزمني للحصول على البيانات في الوقت الحقيقي.
      ملاحظة: هنا، الفاصل زمني الخطوة 1 و 2، 1 دقيقة و 15 دقيقة بعد ذلك.
    4. قم بحفظ الملف وانقر فوق الزر "ابدأ" لقياس مقاومة الخلفية لوسائط الإعلام بشأن صفحة "فهرس خلية" بها؛ سيتم طرح البيانات الناتجة تلقائياً. على صفحة "الرسم البياني جيدا"، يمكن زيارة جميع المنحنيات جيدا. إضافة على صفحة الأرض، سوف تظهر الآبار والرسم البياني لمؤشر الوقت-الخلية.
    5. للتجربة انتشار الخلايا، انقر فوق الزر "إيقاف مؤقت" لإيقاف البرنامج أولاً. ثم إخراج اللوحة الإلكترونية وإضافة 100 ميليلتر A549 خلية تعليق المخزن المؤقت لكل بئر في درجة حرارة الغرفة. اترك اللوحة لمدة 30 دقيقة في هود السلامة الأحيائية للسماح للخلايا تترسب في القاع من الآبار حضانة.
    6. إدراج لوحة إلكترونية يدوياً في محطة محلل الخلية في الوقت الحقيقي. انقر فوق الزر "ابدأ" لمواصلة هذه التجربة.
      ملاحظة: في صفحة الأرض، المحلل باستمرار السجلات قيم "مؤشر الخلية" أو منحنيات طوال التجربة.
    7. عند الانتهاء من هذه التجربة، أدخل صفحة الأرض وفتح ملف التجربة. ثم حدد جميع الآبار حضانة مجربة ومنحنيات "مؤشر الخلية" الناتجة يمكن في المتوسط أو تطبيع للمرة الأخيرة قبل إضافة العقاقير الصيدلانية أو تغيير المتوسطة للحد من الاختلافات بين الاختبارات. تحليل البيانات في الصفحة، يمكن حساب EC50 أو IC50

3-تجديد لوحات إلكترونية

ملاحظة: كل خطوة الشطف، الحل في اللوحة الإلكترونية كانت مختلطة تماما (5-10 مرات) باستخدام ماصة.

  1. القضية 1: لتقييم سيتوتوكسيسيتي مكافحة --سرطان المخدرات
    1. خلايا A549 البذور على اللوحة الإلكترونية كما هو موضح في المقطع 2.
    2. حل هيدروكلوريد ميتوتريكسات العقاقير المضادة للسرطان (دوكس) في الأجلين المتوسط والخلية الأولى. إضافة دوكس ببطء إلى الخلايا (تركيز دوكس النهائي 30 ميكروغرام/مل) باستخدام ماصة. تسجيل كاريتاس الدولية كما هو موضح في المقطع 2.
      ملاحظة: تم إعادة إنشاء اللوحة الإلكترونية المستخدمة فورا بعد اكتمال التجربة. في هذه الحالة، كما دوكس مادة كيميائية قابلة لذوبان، سهلة نسبيا للتعامل مع تجديد اللوحة الإلكترونية يتبع البروتوكول وأية خطوات إضافية مطلوبة.
    3. التجديد
      1. إخراج اللوحة الإلكترونية التي تحتوي على خلايا من محطة محلل الخلية في الوقت الحقيقي. ضع اللوحة الإلكترونية المستخدمة في غطاء السلامة البيولوجية عقيمة في درجة حرارة الغرفة ومزيج الثقافة المتوسطة استخدام ماصة دقة. "الماصة؛" بكل وسيلة.
      2. شطف لوحات إلكترونية مع 200 ميليلتر منزوع الماء 3 مرات في درجة حرارة الغرفة.
      3. هضم الخلايا المتبقية على لوحات إلكترونية مع التربسين 0.25% طازج ح 1-2 (200 ميليلتر في البئر) في حاضنة في 37 ياجيم عند اكتمال عملية الهضم، مزيج الحل حضانة 5-10 مرات باستخدام ماصة وماصة بها جميع الحل في هود السلامة الأحيائية في درجة حرارة الغرفة.
      4. شطف لوحات إلكترونية مع 200 ميليلتر الإيثانول و 200 ميليلتر المياه، على التوالي، على النحو التالي: المياه 2 مرات، الإيثانول 100% 2 مرات؛ الإيثانول 75% 2 مرات؛ منزوع الماء 2 مرات. عكس اللوحة الإلكترونية على شاش معقم أو المناديل الورقية صب الماء المتبقي في درجة حرارة الغرفة.
      5. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم لوحة إلكترونية المجددة ح 1-2 في هود السلامة الأحيائية في درجة حرارة الغرفة.
        ملاحظة: مضاعفة حجم جميع الحلول لتجديد اللوحة الإلكترونية L8.
  2. القضية 2: إيصال الأدوية باستخدام المواد ميسوبوروس.
    1. استخدام مواد ميسوبوروس قضيب مثل السليكا مع حجم مسام متوسط 5.6 شمال البحر الأبيض المتوسط كمصفوفات تسليم المخدرات، كما ذكر سابقا20.
      ملاحظة: هنا، كان يعمل لوحة إلكترونية لرصد أثر الإفراج عن المخدرات على الخلايا.
      1. إضافة المواد ميسوبوروس في الحل حضانة لكل بئر من لوحات إلكترونية. كما مواد السيليكا غير قابلة للذوبان وتسرع في اللوحة الإلكترونية، شطف اللوحة كما يلي:
    2. تنفيذ خطوات 3.1.3.1-3.1.3.3 كما هو موضح للقضية 1.
    3. شطف الرقائق مع 200 ميليلتر منزوع الماء مرة في هود السلامة الأحيائية في درجة حرارة الغرفة.
    4. شطف الرقائق مع 200 ميليلتر الإيثانول المطلقة 2 مرات في درجة حرارة الغرفة.
    5. شطف الرقائق مع 200 ميليلتر 75% إيثانول مرة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    6. إضافة 250 ميليلتر من الإيثانول 75% في كل بئر وختم اللوحة الإلكترونية مع الفيلم الختم في درجة حرارة الغرفة.
    7. وتدور في 114 س ز 2 دقيقة لإفراغ اللوحة الإلكترونية. عكس اللوحة الإلكترونية على شاش معقم أو المناديل الورقية صب الماء المتبقي في درجة حرارة الغرفة.
    8. كرر الخطوة 3.2.5-3.2.7 مرة واحدة.
    9. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم لوحة إلكترونية المجددة ح 1-2 في هود السلامة الأحيائية في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: مضاعفة حجم كل حل عند الشطف L8 لوحات إلكترونية.

4-تقييم أثر التجديد

  1. الخصائص البصرية لسطح اللوحة الإلكترونية المجددة
    1. استخدام صلب ملعقة لتفكيك الجزء السفلي من الحضانة أيضا من جديد بعناية وإعادة إنشائها بلوحة إلكترونية تحتوي على صفت ميكروليكتروديس الذهب. ارتداء قفازات بلاستيكية، بعناية تمحو الجزء الذي يحتوي على رقاقة من لوحة إلكترونية باستخدام ملعقة الصلب.
    2. وضع الأجزاء معا في وسط الشرائح مجهر الزجاج وجمع أطياف رامان الناتجة عن طريق "المجهر رامان" مجهزة اتفاقية مكافحة التصحر للكشف عن21.
      ملاحظة: والمطياف مزود بليزر 633 نانومتر والأطياف تم تسجيلها في الفترة الفاصلة من 30 s الليزر التعرض على طول موجي في حدود 500-3500 سم-1. تم الحصول على الصور الضوئية "المجهر رامان" استخدام عدسة عين 10 x و 50 س الهدف. الشكل 1 و الشكل 1A تم الحصول أيضا على استخدام جهاز "المجهر رامان" المثبتة.
    3. لتقييم جدوى الخلايا المرفقة بعد امتصاص العقاقير المضادة للسرطان الجديدة والمجددة الليزر لوحات إلكترونية، واستخدام [كنفوكل] مجهر المسح لرصد الأسفار عفوية من جزيئات دوكس تمتصه A549.
      1. لتسجيل الأسفار العفوية لاستيعاب دوكس باستخدام خلايا (الجديدة والمجددة الإلكترونية اللوحات مع خلايا A549)، النفط 63 X موضوعية و 485 نانومتر كالطول الموجي الإثارة.
  2. السلوكيات الكهروكيميائية لأقطاب المجددة
    ملاحظة: كما حتىمدى اليدوي للوحة الإلكترونية التجارية صعبة وليست مثالية لتقييم حالة الكهربائية السطحية كما دققت، تم تقييم كفاءة تجديد البروتوكول باستخدام الكربون الذهب/زجاجي عادي القطب (GCE) كاختبار منصة، الذي أجرى التحليل الطيفي المعاوقة الكهروكيميائية (EIS). أقطار مسرى الاتحاد الأفريقي والحملة العالمية للتعليم هي تم الحصول على بيانات 3 مم. الكهروكيميائية بمحلل الكهروكيميائية مع نظام القطب ثلاثة وقياسات مقاومة نفذت باستخدام إشارة تيار المتردد (AC) من 10 mV السعة في تردد واسعة النطاق من 100 كيلوهرتز إلى 0.01 هرتز.
    1. قبل القياس، البولندية القطب الاتحاد الأفريقي والحملة العالمية للتعليم إلى سطح مثل مرآة مع ملاط ألومينا على قطعة من قماش صقله، تليها سونيكيشن في الماء لإزالة أي جزيئات.
    2. تنشيط مسرى الاتحاد الأفريقي في 0.5 م ح2حتى4. الحصول على البيانات البيئية العارية القطب الاتحاد الأفريقي والحملة العالمية للتعليم في 10 ملم بوكل اﻻلكتروﻻيت محلول يحتوي على 1 مم ك3[Fe(CN)]6[ك وصف22.
    3. إعداد الحل خلية A549 الأسهم وفقا 2.1.2 و 2.1.3. إسقاط 10 ميليلتر خلية تعليق على سطح القطب الاتحاد الأفريقي والحملة العالمية للتعليم. احتضان القطب الاتحاد الأفريقي و GCE تعديل مع الخلايا في س37 ج حاضنة حاء 3 بيانات "نظام الحصول على المعلومات البيئية" القطب الاتحاد الأفريقي و GCE تعديل مع الخلايا في 10 ملم بوكل اﻻلكتروﻻيت محلول يحتوي على 1 مم ك3[Fe(CN)]6.
    4. تجديد أقطاب كهربائية باستخدام البروتوكول وتدبير نظام المعلومات البيئية.
      1. تزج مسرى الاتحاد الأفريقي وتعديل للحملة العالمية للتعليم مع الخلايا في التربسين 0.25% 0.5-2 حاء شطف القطب الاتحاد الأفريقي والحملة العالمية للتعليم بهدوء مع الماء 4 مرات. شطف الأقطاب بهدوء مع الإيثانول المطلق 4 مرات. أحاسيس القطب الاتحاد الأفريقي والحملة العالمية للتعليم في الإيثانول 75% للحد الأدنى ~ 5 شطف الرقائق بهدوء مع الإيثانول 75% 4 مرات.
      2. الحصول على البيانات البيئية المجددة القطب الاتحاد الأفريقي والحملة العالمية للتعليم في 10 ملم بوكل اﻻلكتروﻻيت محلول يحتوي على 1 مم ك3[Fe(CN)]6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

خصائص السطح من الرقائق الذهبية: تجديد الإجراءات المستخدمة في هذا البروتوكول كانت المبين في الشكل 1. ويبين الشكل 2 مجهرية سطح صور جديد وإعادة إنشاء لوحات إلكترونية بالمجهر الضوئي. كما هو مبين في الشكل 2 ألف و 2 الشكل، المجهرية أشارت الملاحظات إلى أنه يوجد تقريبا أي اختلاف في الخصائص البصرية للرقاقة السطحية بين الطازجة وتعامل لوحات إلكترونية. استخدام fluorescence عفوية من جزيئات ميتوتريكسات المدرجة في خلايا ملائمة لتقييم حالة الخلية، لاحظنا تجانس مشابهة للخلايا المستزرعة على الرقائق الذهبية بعد التجديد (الشكل 2B و الشكل 2D ). بالإضافة إلى ذلك، عرض الخلايا السرطانية المحتضنة مورفولوجيا خلوية محددة تحديداً جيدا في اللوحة الإلكترونية مما يدل على إعادة استخدام رقائق. ويبين الشكل 3 رامان أطياف اللوحات الإلكترونية الجديدة والمجددة. التوزيعات ذروة رامان تكاد تكون متطابقة بين لوحات إلكترونية جديدة والمعالجة إلى عملية تجديد ناجح على سطح رقاقة الذهب. إشارات إلكترونية لوحات مغطاة بخلايا A549 رامان مشوهة إلى حد ما، ربما بسبب التدخل من الأسفار عفوية من خلايا A549.

مجدد الرقائق للانزيم سيتوتوكسيسيتي باستخدام RTCA: نحن أيضا تطبيق البروتوكول التجديد لاختبار الخلية الانتشار ومواد التقييم سيتوتوكسيسيتي (الشكل 4). كانت تبذر خلايا A549 الكثافة المثلى على لوحة إلكترونية المجددة 16 وسجلت منحنيات النمو الحركية بمحلل الخلية في الوقت الحقيقي. كما هو موضح في الشكل 4A، جميع منحنيات النمو الناتجة موازية آبار تجريبية أظهرت التناسق الكافي، الذي أشار إلى هو الاحتفاظ بوضع لوحة إلكترونية 16 الكهربائية السطحية إلى حد كبير بعد التجديد. كما تم اختبار لوحة إلكترونية المجددة L8 سيتوتوكسيسيتي باستخدام مواد السيليكا ميسوبوروس، كما هو مبين في الشكل 4 باء. بالمقارنة مع التجربة مراقبة، CI العينات المعالجة بالمواد ميسوبوروس انخفض إلى حد ما، مما يدل سيتوتوكسيسيتي طفيفة من المواد. المزيد من التغليف والإفراج عن عقار مضاد للسرطان من دوكس ميسوبوروس مواد تسبب انخفاضا كبيرا من منحنى النمو A549. وأظهرت هذه النتائج التجريبية الاتساق مع استخدام لوحات إلكترونية جديدة وعمل سبق الإبلاغ عنها19، والتحقق من كفاءة هذا البروتوكول التجديد المقترح.

الكفاءة التجدد تقييمها بالطرق الكهروكيميائية: واستخدمت أقطاب الاتحاد الأفريقي التجاري والأقطاب الكربونية زجاجي كمنصات اختبار لتقييم كفاءة التجدد. ويبين الشكل 5 أقطاب "نظام المعلومات البيئية للاتحاد الأفريقي" والحملة العالمية للتعليم التي تم تعديلها مع الخلايا السرطانية. اتضح أن بعد الحضانة لخلايا A549 على مسرى، لوحظت زيادة واضحة إلكترون نقل المقاومة (الصندوق) بالمقارنة بأقطاب العارية. المقصود بالصندوق قد انخفض انخفاضا كبيرا بعد القطب الاتحاد الأفريقي والحملة العالمية للتعليم يعاملون وفقا للبروتوكول في الشكل 5. وأشار إلى تغييرات مماثلة للمقصود بالصندوق القطب الاتحاد الأفريقي على حد سواء، والحملة العالمية للتعليم عملية تجديد الشامل والفعال للرقائق الدقيقة فيما يتعلق بخصائصها الكهربائية السطحية.

Figure 1
رقم 1: عملية تجديد لوحات إلكترونية- في تجديد نموذجية تشغيل، شاركت أربع خطوات رئيسية بما في ذلك حضانة الخلايا وكذلك على مفرزة على السطح اللوحات الإلكترونية تليها الشطف والغزل، وخطوات التعقيم الأشعة فوق البنفسجية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الخصائص السطحية للوحات الإلكترونية- لوحات لوحات إلكترونية جديدة (أ) كانت مطلي خلايا A549 (ب) على (أ) (ج) ريجينيراتيد الإلكترونية A549 (د) تم مطلي الخلايا c. في حالة الخلايا المرفقة على الرقائق الذهبية، استخدمت دوكس. تم تعديل الشكل 2 ألف و 2 الشكل من شو، Z. et al. 19 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: يعامل أطياف رامان مختلفة لوحات إلكترونية- (أ) لوحة إلكترونية جديدة. (ب) لوحة إلكترونية جديدة المصنف مع خلايا A549. (ج) إعادة إنشاء لوحة إلكترونية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: منحنيات نمو الخلية A549 على لوحات إلكترونية المجددة ثلاث مرات- (أ) منحنيات نمو مواز لخلايا المصنف على اللوحة الإلكترونية 16. (ب) اختبار سيتوتوكسيسيتي ميسوبوروس والسليكا المواد على لوحة إلكترونية L8 مع أشرطة الخطأ (الانحراف المعياري، الأمراض المنقولة جنسياً) من منحنيات مسجل لكل حضانة جيدا. تم تعديل الشكل 4A من شو، Z. et al. 19 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5: تعديل أطياف المعاوقة الكهروكيميائية من مختلف أقطاب الذهب والأقطاب الكربونية زجاجي (GCE) في 10 ملم بوكل اﻻلكتروﻻيت محلول يحتوي على 1 مم ك3[Fe(CN)]6. (أ) معاملة مختلفة أقطاب الاتحاد الأفريقي. (ب) معاملة مختلفة الحملة العالمية للتعليم. لقد كان الشكل 5A معدلة فرومكسو، Z. et al. 19 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التطبيق رقاقة المخزن المؤقت للتجديد استراتيجية التجديد
صدى السطحية مأكل مثل الطحين (موارد البرنامج الخاصة) الحل البيرانا (تتركز ح2حتى4%30 ح2س2 = 3:1، v/v)17 قطاع التحقيق استناداً إلى أكسدة قوية وأكثر
أجهزة استشعار كهرضغطية ميكروكانتيليفير (PEMS) جليكاين-HCl خليط23،24 فصل المجمع المستهدف-التحقيق وإزالة أكثر
تركيزات عالية من الملح حل (مجكل م 22 + 1.5 م تريس)25
الفيلم الذهب كوه 50 مم + 25% ح2س226 العضوية المؤكسدة

الجدول 1: ملخص موجز لاستراتيجيات التجديد تم الإبلاغ عنها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يمكننا تلخيص عدة الأساليب المتاحة17،،من2324،25،26 لتجديد الرقائق في الجدول 1. وتشارك هذه الأساليب أساسا، نسبيا قسوة الظروف التجريبية لتحقيق التجديد الكامل للرقائق بسبب وجود تفاعلات جزيء جزيء قوية مثل مجمع المناعي تستخدم رقائق موارد البرنامج الخاصة. ومع ذلك، قد تكون هذه الظروف القاسية التجريبية ضارة جداً للخصائص السطحية لصفت الذهب الرقائق المستخدمة في RTCA. ولذلك، كان أسلوب معتدل وكفاءة الاعتبارات الرئيسية في وضع استراتيجية التجديد قدم. العوامل الأخرى التي لا تقل أهمية هي الشواغل البيئية، إذ كثيرا ما تستخدم هذه الرقائق المتاح جنبا إلى جنب مع الخلايا السرطانية المستهدفة.

في هذا البروتوكول، نقدم طريقة عامة لتجديد التجارية الرقائق الذهبية صفت المستخدمة ل RTCA. وقد وضعت لدينا بروتوكول استناداً إلى التربسين-الهضم والشطف مع الإيثانول والمياه. خطوات إضافية للغزل تعتبر فعالة في إزالة الجسيمات غير قابلة للذوبان المستخدمة لتحليل لعملية التجديد. وبالمقارنة مع الكواشف المستخدمة في أساليب سبق الإبلاغ عنها، تجديد التربسين الكواشف والايثانول متاحة للاستخدامات المختبرية يوميا وهذه المنتجات البيولوجية/المواد الكيميائية ذات سمية منخفضة، وهكذا تعتبر صديقة للبيئة، وهو مرغوب فيه لأغراض التجديد.

في هذا البروتوكول، هو الخطوة الحاسمة هضم التربسين لضمان أداء التجديد من الرقائق الذهبية. وينبغي الاستفادة المثلى تريبسينيزيشن، بما في ذلك الوقت، وتركيز الأولوية الأولى لتحقيق التجدد. بالإضافة إلى الوقت الهضم هو ترشيد في أعمالنا السابقة التقرير19، على تقييم جيد لعملية التحسين ببساطة للتحقق من الخصائص السطحية باستخدام مجهر ضوئي.

مصدر قلق آخر هو معالجة الرقائق الدقيقة أثناء عملية تجديد. كما ماصة يستخدم بشكل متكرر في التجارب، إيلاء اهتمام بالأفراد لتجنب خدش تلميح على سطح الرقائق الدقيقة. وعلاوة على ذلك، أنه مفيد لتعقيم مسبقاً نصائح وشاش وملعقة لضمان كفاءة التجدد. أخيرا وليس آخراً، ينبغي أن تجري عملية التجديد في غطاء السلامة الأحيائية لتجنب أي تلوث.

تجدر الإشارة إلى أن عمليات الشطف المشاركة في تجديد البروتوكول هي تجري يدوياً، مما سيتسبب حتما التحيز بسبب اختلاف الأفراد. للتغلب على هذا التحديد، المعدات الأوتوماتيكية أو شبه الأوتوماتيكية لأغراض الشطف يمكن أن تكون مخصصة مصممة، النظر في لوحات إلكترونية وحدات المستخدمة. وبالإضافة إلى ذلك، تم اختبار البروتوكول التجديد لتكون فعالة لفحوصات يستند إلى الخلية. ومع ذلك، حضور قوي التفاعلات الجزيئية، مثل تشكيل جسم مضاد-مستضد في الواجهة من رقائق، شروط التجديد المقترحة قد تكون محدودة إلى حد كبير وينبغي النظر في شروط العازلة قوية نسبيا.

وعموما، تم اختبار تجديد البروتوكول الحالي للسماح بالاستخدام المتكرر للرقائق الذهبية التجارية، فضلا عن سائر أقطاب إجراء مثل الاتحاد الأفريقي والأقطاب الكربونية زجاجي. ونحن نتوقع أن تطبيق هذا البروتوكول سيوفر على ارتفاع تكلفة تشغيل الخلية في الوقت الحقيقي القائم على رقاقة فحوصات. على المدى الطويل، أن تصبح أكثر كثيرا ما تستخدم الاختبارات المستندة إلى الرقائق الدقيقة لتحليل البروتين والخلوية والبروتوكول المقترح في هذه الدراسة يمكن أن تقدم خياراً للتجديد، في أي من المعدات الأوتوماتيكية أو شبه الأوتوماتيكية الشطف يمكن تم تصميمها وتطبيقها في حالات تراكم رقائق المتاح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيده العمل "الوطني العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين" (U1703118)، مشروع ممول من أولوية الأكاديمية برنامج التنمية من جيانغسو التعليم العالي المؤسسات (PAPD)، والبرنامج شوانجتشوانج جيانغسو، وصناديق مفتوحة من "مفتاح الدولة" المختبر الكيماوي/بيوسينسينج وتشيموميتريكس (2016015) و "المختبر الوطني من بيوماكروموليكوليس" (2017kf05) والمشروع البروفسور Jiangsu Specially-Appointed، الصين.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat: Sprague-Dawley Charles River Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) Bio-Rad Cat# MCA275R Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1  Abcam Cat# AB5076 Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67  Abcam  Cat# AB15580 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 Invitrogen Cat# 11055 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 Invitrogen Cat# A-21203 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 Invitrogen Cat# A-31573 Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining) Thermo Fisher Cat# 28313
Heparan sulfate Galen Laboratory Supplies Cat# GAG-HS01
Heparin Sigma  Cat# M3149
Peptone from milk solids Sigma Cat# P6838
TGF-β2 Peprotech Cat# 100-35B
Murine IL-34 R&D Systems Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol Avanti Polar Lipids Cat# 700000P
Collagen IV Corning  Cat# 354233
Oleic acid Cayman Chemicals  Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid Cayman Chemicals  Cat# 20606
Calcein AM dye Invitrogen Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1 Invitrogen Cat# E1169
DNaseI Worthington Cat# DPRFS
Percoll PLUS GE Healthcare Cat# 17-5445-02
Trypsin  Sigma Cat# T9935
DMEM/F12 Gibco Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin Gibco Cat# 15140-122
Glutamine Gibco Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine  Sigma Cat# A9165
Insulin Sigma Cat# 16634
Apo-transferrin  Sigma Cat# T1147
Sodium selenite Sigma Cat# S-5261
DMEM (high glucose) Gibco Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G Southern Biotech Cat# 0100-20 
Poly-D-Lysine  Sigma Cat# A-003-E
Primaria Plates  VWR Cat# 62406-456
Stock reagents  reconstitution  Concentration used Storage
Apo-transferrin 10 mg/mL in PBS  1:100 -20°C
N-acetyl cysteine 5 mg/mL in H2O  1:1,000 -20°C
Sodium selenite 2.5 mg/mL in H2O  1:25,000 -20°C
Collagen IV 200 μg/mL in PBS  1:100 -80°C
TGF-b2 20 μg/mL in PBS  1:10,000 -20°C
IL-34 100 μg/mL in PBS  1:1,000 -80°C
Ovine wool cholesterol 1.5 mg/mL in 100% ethanol  1:1,000 -20°C
Heparan sulfate 1 mg/mL in H2O 1:1,000 -20°C
Oleic acid/Gondoic acid Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol  1:1,000 -20°C
Heparin 50 mg/mL in PBS  1:100 -20°C
Solutions  Recipe  Comments
Perfusion Buffer 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Use when ice-cold
Douncing Buffer 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Use when ice-cold
Panning Buffer 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM) DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)  MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
  2. Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
  3. Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
  4. Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
  5. Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
  6. Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
  7. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  8. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
  9. Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
  10. Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
  11. Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
  12. Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
  13. Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792 (2011).
  14. Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
  15. Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748 (2014).
  16. Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
  17. Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
  18. Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
  19. Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
  20. Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
  21. Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
  22. Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
  23. Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
  24. McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
  25. Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
  26. Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 133، خالية من التسمية، يستند إلى الخلية المقايسة، التجديد، صفت ميكروليكتروديس الذهب، محلل الخلية في الوقت الحقيقي، التربسين
تجديد ميكروليكتروديس الذهب صفت مجهزة لهو محلل خلية في الوقت الحقيقي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, Z., Song, Y., Jiang, H., Kong,… More

Xu, Z., Song, Y., Jiang, H., Kong, Y., Li, X., Chen, J., Wu, Y. Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer. J. Vis. Exp. (133), e56250, doi:10.3791/56250 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter