Summary
Denne protokol beskriver en generel strategi for at regenerere kommercielle klædt guld microelectrodes udstyret til en etiket-gratis celle analyzer sigter besparelse på de høje løbende omkostninger ofmicrochip-baserede assays. Regenereringsprocessen omfatter trypsin fordøjelse, skylning med ethanol og vand og en spinning skridt, som giver mulighed for gentagen brug af mikrochips.
Abstract
Etiket-gratis celle-baserede assay er fordelagtige for biokemisk undersøgelse på grund af det ikke kræver anvendelse af forsøgsdyr. På grund af dens evne til at yde mere dynamiske oplysninger om celler under fysiologiske tilstande end klassisk biokemiske assays, tiltrækker denne etiket-free real-time celle analyse baseret på princippet om elektrisk impedans mere opmærksomhed i løbet af sidste årti. Dens praktiske udnyttelse kan dog begrænset på grund af relativt dyre udgifter til måling af, hvor dyrt forbrugsmaterialer engangs guld mikrochips bruges til celle analysator. I denne protokol, har vi udviklet en generel strategi for at regenerere klædt guld microelectrodes udstyret til en kommerciel etiket-gratis celle analyzer. Regenereringsprocessen omfatter trypsin fordøjelse, skylning med ethanol og vand og en spinning trin. Den foreslåede metode er testet og vist sig at være effektiv for regenerering og gentagen brug af kommercielle elektroniske plader mindst tre gange, som vil hjælpe forskerne med at spare på de høje løbende omkostninger af real-time celle assays.
Introduction
På grund af dens effektive og mindre arbejdskrævende eksperimenterende proces, har etiket-gratis celle-baseret teknologi oplevet hurtige vækst i det sidste årti for såvel analytisk som screening formål, såsom i aspekt af proteomics1,2 , drug delivery3, etc.4,5 sammenlignet med traditionelle biokemiske metoder med henblik på celle analyse, etiket-free real-time celle assay med prototypen udviklet af Giaever og kolleger tidligere6 er baseret på princippet om registrering af elektrisk signal ændringer på overfladen af cellen-attached mikrochips, som tillader en kontinuerlig måling af cellevækst eller migration i en kvantitativ måde. Efter denne strategi, en real-time celle elektroniske sensing (RT-CES) system ved hjælp af elektrisk impedans-baseret detektion princippet blev indført7,8 og mere for nylig et kommercielt real-time celle analyzer (RTCA) blev lanceret for laboratoriet forskning9.
Kommercielle real-time celle analyzer primært læser celler evoked signaler af elektrisk impedans, der skyldes de fysiologiske ændringer af rugede celler herunder celleproliferation, migration, levedygtighed, morfologi og fastholdelse på den overfladen af mikrochips10,11. Elektriske signaler konverteres yderligere af analyzer til en dimensionsløs parameter med navnet celle indeks (CI) til at vurdere celle status. Ændringen af impedans af mikrochips afspejler hovedsagelig den lokale ionisk miljø overdækket celler i grænsefladen elektrode/løsning. Derfor, den analytiske ydeevne af celle analyzer er stærkt afhængig af core sensing enhed, den engangs mikrochips (dvs., såkaldt elektronisk plader, fx, 96/16/8-godt), som er lavet af klædt guld microelectrodes lithographically udskrives i bunden af inkubation brønde. De guld microelectrodes samles i en cirkel-on-line format (figur 1) og dækker det meste af arealet af inkubation wells, som giver mulighed for dynamisk og følsomme påvisning af tilknyttede celler3,12,13 ,14. CI vil øge for flere overfladedækning af celler på chippen og falde når cellerne er udsat for en giftstoffet resulterer i apoptose. Selvom real-time celle analyzer har ofte været brugt til at bestemme cytotoksicitet11 og neurotoksicitet15 og giver flere kinetic oplysninger end klassisk slutpunkter metode, er engangs elektronisk plader de dyreste forbrugsvarer.
Indtil nu har der været nogen tilgængelige metoder til regenerering af den elektroniske plade, som er sandsynligvis skyldes, at barske regenerering betingelser, såsom piranha løsning eller eddikesyre er involveret16,17, 18, som kan ændre den elektriske status af guld mikrochips. En mild og effektiv metode til at fjerne de vedhængende celler og andre stoffer fra overfladen af guld chips vil derfor være ønskeligt for elektroniske plade regenereringsprocessen. Vi har for nylig udviklet en protokol med henblik på regenerering af engangstændere elektronisk plader ved hjælp af ikke-korroderende reagenser og regenereret chips var karakteriseret ved elektrokemiske samt optisk metoder19. Ved hjælp af let tilgængelige og moderat laboratoriereagenser herunder trypsin og ethanol, har vi etableret en generel metode for at regenerere den kommercielle elektroniske plade uden bivirkninger, som er anvendt med succes til at regenerere de to hovedtyper af elektroniske plade (både 16 og L8) bruges til RTCA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: generelt regenereringsprocessen omfatter trypsin fordøjelse og føres skridt med ethanol og vand. Fordøjelsestid ændres afhængig af antallet af celler, der bruges, og typen og antallet af celler, der bruges kan variere afhængigt af de eksperimentelle formål. Det anbefales at tjekke den regenererede mikrochips ved hjælp af optiske og elektrokemiske metoder til at optimere regenerering betingelser. Under eksperimentet, opløselige og uopløselige kemikalier kan være involveret, og her disse to typiske tilfælde af regenerering procedurer er detaljerede.
1. forberedelse af regenerering løsninger
Bemærk: Forberede og håndtere alle løsninger under sterile forhold.
- Forberede frisk 0,25% (g/v) trypsin løsning. Trypsin kan købes eller frisklavet som følger.
- Opløse 0,25 g af trypsin i 100 mL af pH 7,4 fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
- Opløsningen omrøres indtil trypsin er fuldt opløst på 4 oC. røre løsning ved lav hastighed pasning til at undgå enhver boble-dannelse.
- Opløsningen filtreres med et 0,22 µm filter i biosikkerhed hætte.
- Forberede 75% ethanol med absolut ethanol. Hæld 75 mL absolut ethanol i en målekolbe og tilsættes deioniseret vand, indtil volumen når 100 mL. Udføre yderligere sterilisation, hvis det er nødvendigt.
2. inkubation og spredning af A549 celler i elektroniske plader
Bemærk: Elektronisk plade typer 16 og L8 er begge lavet af klædt guld microelectrodes lithographically udskrives nederst på inkubation brønde. Elektronisk plade 16 har 16 wells, mens elektroniske plade L8 har 8 boringer. Brønde af elektroniske plade 16 er runde mens brønde af elektroniske plade L8 er afrundede rektangler. Hver elektronisk plade 8 er godt omkring 830 µL og hver elektronisk plade 16 er nå omkring 270 µL.
- A549 cellekultur
- Kultur A549 celler i Roswell Park Memorial Institute-1640 medium (RPMI-1640) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% Penicillin-streptomycin i cellekultur parabol.
- Passage cellerne, da cellen tæthed når ~ 75% og derefter vaske det vedhængende cellelag med 1 × PBS og trypsinize med 0,25% trypsin løsning for 1 min på 37 oC. Centrifuge celler på 179 × g for 5 min at fjerne trypsin. Resuspend celler i 10 mL medium for yderligere kultur eller andre eksperimenter.
Bemærk: Løsning af celler genopslemmes i medium er her udpeget som celle suspension buffer. - Tag 10 µL og tælle celle antallet ved hjælp af en hemocytometer. Brug RPMI-1640 medium til yderligere fortyndes celle suspension buffer for at forberede eksperimenterne 30.000-80.000 celler/mL celle suspension buffer.
-
Spredning/cytotoksicitet eksperiment og dataopsamling
- Tilføje 50 µL (150 µL for elektroniske plade L8) celle medium til hver inkubation godt af elektroniske plade 16 og forlade det for 30 min i biosikkerhed hætte for ækvilibrering. Manuelt indsætte den elektroniske plade 16 i real-time celle analyzer i CO2 inkubator på 37 oC.
- Lancere real-time celle analyzer operation program på computeren. På dens standard eksperimentere mønster opsætningsside, Vælg "Eksperimentere model" og navngive den kørende assay.
- Vælg de tilsvarende brønde, der er inkluderet i eksperimentet og indtaste oplysninger som celle type, antal og narkotika navne i redigeringsfelterne på sit Layout. På sin tidsplan-siden, tilføje de eksperimenterende trin, og vælg derefter den køretid (f.eks. 12, 24 eller 48 h) for hvert trin og interval af real-time data erhvervelse.
Bemærk: Her, interval på trin 1 og 2 er 1 min og 15 min bagefter. - Gem filen og klik på "Start" knappen for at måle baggrund impedansen af medierne på sin celle indeks side; de resulterende data bliver automatisk trukket fra. På sin side i godt graf kan alle godt kurver besøges. På sine Plot side, tilføje brønde og grafen for tid-celle indeks vil være viste.
- Celle spredning eksperiment, for det første ved at klikke på "Pause"-knappen for at afbryde programmet. Derefter tage ud elektronisk pladen og tilføje 100 µL A549 celle suspension buffer pr. brønd ved stuetemperatur. Forlade pladen i 30 min i biosikkerhed hood at lade cellerne bilægge til bunden af inkubation brønde.
- Manuelt indsætte den elektroniske plade i real-time celle analyzer station. Klik på knappen "Start" for at fortsætte eksperimentet.
Bemærk: På siden Plot analysatoren løbende registrerer celle indeksværdier eller kurver i hele eksperimentet. - Når eksperimentet er afsluttet, Indtast Plot side og åbne filen eksperiment. Derefter vælge alle de testede inkubation brønde og de resulterende celle indeks kurver, som kan være gennemsnit eller normaliseret for sidste gang før tilføjelse pharmaceutical narkotika eller ændre medium for at reducere variationer mellem assays. På siden dataanalyse kan EC50 eller IC50 beregnes
3. regenerering af elektroniske plader
Bemærk: For hver føres trin løsning i den elektroniske plade var blandet grundigt (5 - 10 gange) ved hjælp af en pipette.
-
Sag 1: For cytotoksicitet evaluering af anti -kræft narkotika
- Seed A549 celler på den elektroniske plade som beskrevet i afsnit 2.
- Opløse anti-cancer lægemiddel doxorubicin hydrochlorid (DOX) i celle medium først. Langsomt tilføje DOX til cellerne (endelig koncentration af DOX er 30 µg/mL) ved hjælp af en pipette. Optage CI, som beskrevet i afsnit 2.
Bemærk: Den elektroniske plade anvendes blev regenereret umiddelbart efter at forsøget var afsluttet. I dette tilfælde, da DOX er et opløseligt kemiske, regenerering af elektroniske pladen efter protokollen er relativt let at håndtere og ingen yderligere skridt er nødvendige. -
Regenerering
- Tage ud elektronisk pladen som indeholder celler fra real-time celle analyzer station. Brugte elektroniske pladen anbringes i en steril biosikkerhed hood ved stuetemperatur og bland næringssubstratet grundigt ved hjælp af en pipette. Der afpipetteres ud alle medium.
- Skyl de elektroniske plader med 200 µL deioniseret vand nemlig 3 gange ved stuetemperatur.
- Fordøje de resterende celler på de elektroniske plader med 0,25% frisklavet trypsin for 1-2 h (200 µL/brønd) i en inkubator på 37 oC. Når fordøjelsen er afsluttet, bland inkubation løsning 5 - 10 gange med en pipette og pipette ud alle løsning i biosikkerhed hood ved stuetemperatur.
- Skyl de elektroniske plader med 200 µL ethanol og 200 µL vand, henholdsvis, som følger: deioniseret vand 2 gange, 100% ethanol 2 gange; 75% ethanol 2 gange; deioniseret vand 2 gange. Vend elektroniske pladen på en steril gaze eller silkepapir at dekanteres det resterende vand ved stuetemperatur.
- Ultraviolet sterilisere folier elektroniske pladen for 1-2 h i biosikkerhed hood ved stuetemperatur.
Bemærk: Fordoble mængden af alle løsninger til regenerering af elektroniske plade L8.
-
Case 2: medicinafgivelse ved hjælp af mesoporøse materiale.
- Bruge rod-lignende mesoporøse silica materialer med en gennemsnitlig porestørrelse af 5.6 nm som drug delivery matricer, som tidligere rapporteret20.
Bemærk: Her, de elektroniske plade var ansat til at overvåge stof-release effekten på celler.- Tilføj mesoporøse materialer til inkubation løsning af hver brønd i de elektroniske plader. Som silica materialer ikke er opløselige og bundfald i den elektroniske plade, skyl pladen som følger:
- Udfør trin 3.1.3.1-3.1.3.3, som beskrevet for tilfældet 1.
- Skyl mikrochips med 200 µL deioniseret vand en gang i biosikkerhed hood ved stuetemperatur.
- Skyl mikrochips med 200 µL absolut ethanol 2 gange ved stuetemperatur.
- Skyl mikrochips med 200 µL 75% ethanol engang ved stuetemperatur.
- Tilsæt 250 µL af 75% ethanol i hver brønd og forsegle den elektroniske plade med forsegling filmen ved stuetemperatur.
- Spin på 114 x g i 2 min. og tømme den elektroniske plade. Vend elektroniske pladen på en steril gaze eller silkepapir at dekanteres det resterende vand ved stuetemperatur.
- Gentag trin 3.2.5-3.2.7 en gang.
- Ultraviolet sterilisere folier elektroniske pladen for 1-2 h i biosikkerhed hood ved stuetemperatur.
Bemærk: Fordoble mængden af alle løsning når skylning L8 elektroniske plader.
- Bruge rod-lignende mesoporøse silica materialer med en gennemsnitlig porestørrelse af 5.6 nm som drug delivery matricer, som tidligere rapporteret20.
4. vurdering af regenerering effekt
-
Optiske egenskaber af folier elektroniske pladen
- Brug en stål skeen for at omhyggeligt demontere den nederste del af inkubation godt af friske og regenereret elektroniske plade, der indeholder klædt guld microelectrodes. Iført en plastik handske, omhyggeligt udslette den mikrochip-holdige del fra den elektroniske plade ved hjælp af stål skeen.
- Placere begge dele på midten af glas objektglas og indsamle de resulterende Raman spektre af Raman mikroskop udstyret med en CCD-detektor21.
Bemærk: Spektrometeret var udstyret med en 633 nm laser og spektre blev indspillet med et interval på 30 s laser eksponering ved en bølgelængde i rækken af 500-3500 cm-1. De optiske billeder blev indhentet af en Raman mikroskop ved hjælp af en 10 x eye linse og 50 x mål. Figur 1A og figur 1 c blev også fremstillet med den installerede Raman mikroskop apparatur. - For at vurdere levedygtigheden af tilknyttede celler efter anti-cancer lægemiddel optagelse på den friske og regenereret laser elektroniske plader, bruge en Konfokal scanning mikroskop for at overvåge den spontane fluorescens af DOX molekyler absorberet af A549.
- For at registrere den spontane fluorescens af absorberet DOX af celler (frisk og regenereret elektroniske plader med A549 celler), brug olie en 63 X objektive og 485 nm som excitation bølgelængde.
-
Elektrokemiske opførsel af folier elektroder
Bemærk: Manuel fjernelse af en kommerciel elektronisk plade er svært og ikke ideel til vurdering af overflade elektriske status som kontrolleret, regenerering effektiviteten af protokollen blev evalueret ved hjælp af normale guld/glasagtig carbon elektrode (GCE) som en test platform, som elektrokemiske impedans spektroskopi (EIS) blev udført. Diameteren af Au elektrode og GCE er 3 mm. elektrokemiske data blev indhentet af en elektrokemisk analyzer med en tre-elektrode system og impedans målinger blev udført ved hjælp af en vekselstrøm (AC) signal af 10 mV amplitude på en brede frekvensområde på 100 kHz til 0,01 Hz.- Før målingen, polsk Au elektrode og GCE til en spejl-lignende overflade med en aluminiumoxid gylle på en pudseklud, efterfulgt af sonikering i vand for at fjerne eventuelle partikler.
- Aktivere Au elektrode i 0,5 M H2grad4. Få EIS data af den nøgne Au elektrode og GCE i 10 mM KCl elektrolyt opløsning indeholdende 1mM K3[Fe(CN)6] som beskrevet22.
- Forberede stock A549 celle løsning ifølge 2.1.2 og 2.1.3. Drop 10 µL cellesuspension på overfladen af Au elektrode og GCE. Inkuber Au elektrode og GCE modificeret med celler i en 37 oC inkubator for 3 h. opnå EIS data af Au elektrode og GCE modificeret med celler i 10 mM KCl elektrolyt opløsning indeholdende 1 mM K3[Fe(CN)6].
-
Regenerere elektroderne ved hjælp af protokollen og foranstaltning EIS.
- Fordyb Au elektrode og GCE modificeret med celler i 0,25% trypsin for 0,5-2 h. Skyl Au elektrode og GCE sagte med vand 4 gange. Skyl elektroder sagte med absolut ethanol 4 gange. Immerge Au elektrode og GCE i 75% ethanol for ~ 5 min. Skyl chips sagte med 75% ethanol 4 gange.
- Få EIS data af folier Au elektrode og GCE i 10 mM KCl elektrolyt opløsning indeholdende 1mM K3[Fe(CN)6].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overflade egenskaber af guld mikrochips: regeneration procedurer anvendes i denne protokol blev skitseret i figur 1. Figur 2 viser den mikroskopiske overfladen billeder af friske og regenereret elektroniske plader af optisk mikroskop. Som vist i figur 2A og fig. 2 c, mikroskopiske observationer viste, at der var stort set ingen forskel i de optiske egenskaber af mikrochip overflade mellem frisk og behandlet elektronisk plader. Bruger den spontane fluorescens af doxorubicin molekyler inkluderet i de celler, der er bekvemt for vurdering af celle status, observeret vi en lignende homogenitet af dyrkede celler på den guld mikrochips efter regenerering (figur 2B og figur 2D ). Derudover vises rugede kræftcellerne en veldefineret cellulære morfologi i elektroniske plade demonstrerer genbrugelighed af chips. Figur 3 viser Raman spektre af friske og regenereret elektroniske plader. De næsten identiske Raman peak fordelinger mellem frisk og behandlet elektronisk pladerne angivet en vellykket regenereringsprocessen guld mikrochip overflade. Raman signaler af elektroniske plader beklædt med A549 celler blev fordrejet til en vis grad, sandsynligvis på grund af interferens fra den spontane fluorescens af A549 celler.
Regenereret mikrochips til cytotoksicitet analysen ved hjælp af RTCA: Vi har også anvendt regenerering protokol for en test af celle spredning og materiale cytotoksicitet evaluering (figur 4). A549 celler af optimal tæthed var seedet på folier elektroniske pladen 16 og kinetic vækstkurver blev indspillet af real-time celle analyzer. Som vist i figur 4A, alle de resulterende vækstkurver af parallelle eksperimentelle wells viste passende konsistens, som viste, at elektroniske plade 16 overflade elektriske status bevares stærkt efter regenerering. Folier elektroniske pladen L8 blev også testet for cytotoksicitet ved hjælp af mesoporøse silica materialer, som vist i figur 4B. Sammenlignet med kontrol-eksperiment, CI mesoporøse materialer-behandlede prøver faldt til en vis grad, med angivelse af en lille cytotoksicitet af materialer. Yderligere indkapsling og frigivelse af anticancer narkotika af Dox af mesoporøse materialer forårsaget et dramatisk fald i vækstkurven for A549. Disse eksperimentelle resultater viste sammenhæng med brug af friske elektroniske plader og tidligere rapporteret arbejde19, som verificeret effektiviteten af denne foreslåede regenerering protokol.
Regenerering effektivitet vurderet af elektrokemiske metoder: Kommercielle Au elektroder og glasagtig Kulelektroder blev brugt som test platforme for evaluering af regenerering effektivitet. Figur 5 viser EIS af Au elektroder og GCE, der blev ændret med kræftceller. Det var vist, at efter inkubation af A549 celler på elektroden, blev en tydelig stigning af elektron overførsel modstand (Ret) observeret sammenlignet med nøgne elektroder. Ret var faldet betydeligt efter Au elektrode og GCE blev behandlet i henhold til protokollen i figur 5. De tilsvarende ændringer af Ret af både Au elektrode og GCE angivet en effektiv og universelle regenereringsprocessen af mikrochips vedrørende deres overflade elektriske egenskaber.
Figur 1: regenereringsprocessen af elektroniske plader. I en typisk regenerering køre, var fire hovedtrin involveret, herunder inkubere celler samt deres udstationering på overfladen af elektroniske plader efterfulgt af skylning, spinning og UV-sterilisering trin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: elektroniske plader overfladeegenskaber. (A) nye elektroniske plader (B) A549 celler var belagt på A. (C) Regenerated elektronisk plader (D) A549 celler var belagt på C. I tilfælde af celler fastgjort på guld mikrochips, blev DOX brugt. Figur 2A og figur 2 c er blevet ændret fra Xu, Z. m. fl. 19 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Raman spektre af forskellige behandlet elektronisk plader. (A) nye elektroniske plade. (B) nye elektroniske plade seedede med A549 celler. (C) regenereres elektroniske plade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: A549 celle vækstkurver på tre-tiden folier elektroniske plader. (A) parallelle vækstkurver celler seedede på elektroniske plade 16. (B) cytotoksicitet test af mesoporøse silica materialer på elektroniske plade L8 med fejllinjer (standardafvigelse, STD) af indspillede kurver af hver godt inkubation. Figur 4A er blevet ændret fra Xu, Z. m. fl. 19 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Elektrokemiske impedans spektre af forskellige ændrede guld elektroder og glasagtig Kulelektroder (GCE) i 10 mM KCl elektrolyt opløsning indeholdende 1 mM K3[Fe(CN)6]. (A) forskellige behandlet Au elektroder. (B) anderledes behandlet GCE. Figur 5A har været modificeret fromXu, Z. m. fl. 19 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Chip ansøgning | Regenerering buffer | Regenerering strategi |
| Overflade plasmon resonans (SPR) | Piranha løsning (koncentreret H2så4/30% H2O2 = 3:1, v/v)17 | Strip både analysanden og sonde baseret på stærke oxidation |
| Piezoelektriske Microcantilever sensorer (PEMS) | Glycin-HCl blanding23,24 | adskille target-sonde kompleks og fjerne analysanden |
| Saltkoncentrationer løsning (2M MgCl2 + 1,5 M Tris)25 | ||
| Gold film | 50mM KOH + 25% H2O226 | Oxideret organics |
Tabel 1: Et kort resumé af rapporterede regenerering strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi opsummerede flere tilgængelige metoder17,23,24,25,26 for regenererende mikrochips i tabel 1. Dybest set, disse metoder involveret relativt barske eksperimentelle betingelser til at opnå en fuldstændig regenerering af chips på grund af tilstedeværelsen af stærke molekyle-molekyle interaktioner som immun komplekset brugt til SPR chips. Disse barske forsøgsbetingelser kan dog være yderst skadelige for overfladeegenskaber af klædt guld mikrochips bruges i RTCA. Derfor, en mild og effektiv metode var de store overvejelser i udviklingen af strategiens præsenteres regenerering. Andre faktorer, der er lige så vigtigt er miljøhensyn, da disse engangstændere mikrochips bruges ofte sammen med målrettede kræftceller.
I denne protokol indfører vi en generel metode for regenererende kommercielle klædt guld mikrochips bruges til RTCA. Vores protokol blev udviklet baseret på trypsin-fordøjelse og skylle med ethanol og vand. Ekstra spinning trin anses for at være effektive til at fjerne de uopløselige partikler anvendt til analysen for regenereringsprocessen. Sammenlignet med de reagenser, der anvendes i tidligere rapporterede metoder, regenererende reagenser trypsin og ethanol er let tilgængelige til dagligt laboratoriebrug og disse biologiske produkter/kemikalier er lav toksicitet og anses således for at være miljøvenlig, hvilket er ønskeligt med henblik på regenerering.
I denne protokol er det afgørende skridt trypsin fordøjelsen at sikre regenerering, guld mikrochips. Optimering af trypsinization, herunder koncentration og tid, bør den første prioritet at opnå regenerering. Udover den fordøjelsestid, der er rationaliseret i vores tidligere rapport19, er en god vurdering for optimeringsprocessen simpelthen at kontrollere egenskaberne overflade ved hjælp af et optisk mikroskop.
En anden bekymring er håndtering af mikrochips under regenererende proces. Som en pipette bruges ofte i eksperimenterne, bør opmærksomhed betales af personale til at undgå at ridse tip på overfladen af mikrochips. Derudover er det gavnligt at pre sterilisere tips, gaze og skeen at sikre regenerering effektivitet. Sidst men ikke mindst, regenereringsprocessen skal udføres på en biosikkerhed hood at undgå kontaminering.
Det skal bemærkes, at de føres processer i regenerering protokol er manuelt udført, som vil uundgåeligt medføre bias på grund af forskellige personale. For at overvinde denne begrænsning, kunne automatisk eller halvautomatisk udstyr til skylning formål være brugerdefinerede designet, i betragtning af de modulære elektroniske plader anvendes. Derudover er regenerering protokol blevet testet for at være effektiv for celle-baserede assays. Men i nærværelse af stærkt molekylære interaktioner, såsom antigen-antistof dannelse på grænsefladen af chips, foreslåede regenerering betingelser kan være begrænset til en stor udstrækning og relativt stærk buffer betingelser bør overvejes.
Generelt, den nuværende regenerering protokol er blevet testet for at tillade den gentagne brug af kommercielle guld mikrochips, samt andre ledende elektroder som Au og glasagtig Kulelektroder. Vi forventer, at anvendelsen af denne protokol vil spare på de høje løbende omkostninger af real-time chip-baserede celle assays. I det lange løb mikrochip-baserede assays bliver mere ofte benyttes til proteom og cellulære analyse og den foreslåede protokol i denne undersøgelse kan tilbyde mulighed for regenerering, i hvilke automatisk eller halvautomatisk udstyr for skylning kunne være designet og anvendes i tilfælde af akkumulerede engangs chips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Arbejdet var støttet af National Natural Science Foundation of China (U1703118), et projekt finansieret af prioriterede akademiske Program udvikling af Jiangsu videregående institutioner (PAPD), Jiangsu Shuangchuang Program, åbne midler fra staten nøgle Laboratorium for kemo/Biosensing og kemometri (2016015) og det nationale laboratorium af Biomacromolecules (2017kf05) og Jiangsu Specially-Appointed Professor projekt, Kina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Stock reagents | reconstitution | Concentration used | Storage |
| Apo-transferrin | 10 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| N-acetyl cysteine | 5 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Sodium selenite | 2.5 mg/mL in H2O | 1:25,000 | -20°C |
| Collagen IV | 200 μg/mL in PBS | 1:100 | -80°C |
| TGF-b2 | 20 μg/mL in PBS | 1:10,000 | -20°C |
| IL-34 | 100 μg/mL in PBS | 1:1,000 | -80°C |
| Ovine wool cholesterol | 1.5 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparan sulfate | 1 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Oleic acid/Gondoic acid | Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparin | 50 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| Solutions | Recipe | Comments | |
| Perfusion Buffer | 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) | Use when ice-cold | |
| Douncing Buffer | 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ | Use when ice-cold | |
| Panning Buffer | 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite | Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. | |
| Collagen IV Coating | MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 | Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 | |
| TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid | Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
References
- Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
- Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
- Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
- Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
- Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
- Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
- Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
- Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
- Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
- Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792 (2011).
- Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748 (2014).
- Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
- Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
- Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
- Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
- Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
- Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
- Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
- Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
- McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
- Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
- Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).
