Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

חידוש ערוכים Microelectrodes זהב מצויד מנתח תא בזמן אמת

Published: March 12, 2018 doi: 10.3791/56250
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 3, 1, 4
1School of Public Health, Nanjing Medical University, 2School of Pharmacy, Nanjing Medical University, 3State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing Tech University, 4Department of Medical Oncology, Jiangsu Cancer Hospital, Jiangsu Institute of Cancer Research, The Affiliated Cancer Hospital of Nanjing Medical University
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה כללית להתחדש מסחרי microelectrodes זהב ערוכים מצויד מנתח תא ללא תווית שמטרתה שמירה על גבוהה זורמים עלויות מבוססות ofmicrochip מבחני. תהליך התחדשות כולל עיכול טריפסין, שטיפה עם אתנול ומים צעד ספינינג, המאפשרת שימוש חוזר ונשנה של שבבים.

Abstract

וזמינותו ללא תווית מבוססת תא הוא יתרון עבור מחקר ביוכימי בגלל זה אינו דורש השימוש של חיות ניסוי. בשל יכולתה לספק מידע דינמיות יותר על התאים בתנאים פיזיולוגיים מאשר מבחני הביוכימי הקלאסית, זו assay תא ללא תווית בזמן אמת בהתבסס על העיקרון עכבה חשמלית מושך יותר תשומת לב במהלך האחרון עשור. עם זאת, ניצול מעשי שלה עלולה להיות מוגבלת בשל העלות יקרה יחסית המדידה, שבו יקר בשבבים זהב חד פעמיים מתכלים משמשים במנתח התא. ב פרוטוקול זה, פיתחנו אסטרטגיה כללית להתחדש ערוכים microelectrodes זהב מצויד מנתח תא מסחרי ללא תווית. תהליך התחדשות כולל עיכול טריפסין, שטיפה עם אתנול ומים צעד ספינינג. השיטה המוצעת שנבדק ונמצא הוכח להיות יעיל עבור התחדשות ו חוזרות השימוש המסחרי לוחות אלקטרוניים לפחות שלוש פעמים, וזה יעזור חוקרים לשמור על ריצה העלות הגבוהה של מבחני תא בזמן אמת.

Introduction

בשל שלה יעיל ופחות עתירי עבודה התהליך ניסיוני, ללא תווית תא טכנולוגיה מבוססת חוותה צמיחה מהירה בעשור האחרון למטרות אנליטית, כמו גם הקרנת כגון בהיבט של פרוטאומיקס1,2 , סמים משלוח3, ועוד4,5 Compared עם שיטות מסורתיות הביוכימי מכוונות ניתוח תא, התא ללא תווית בזמן אמת assay עם האבטיפוס שפותחה על ידי Giaever ועמיתיו בעבר6 מבוסס על העיקרון של הקלטה אות חשמלי שינויים על פני השטח של התא-attached מיקרוצ'יפ, המתירים מדידה רציפה של צמיחת תאים או ההעברה באופן כמותי. בעקבות אסטרטגיה זו, הושק תא בזמן אמת אלקטרונית חש (RT-CES) המערכת באמצעות עקרון זיהוי מבוסס עכבה חשמלית היה הציג7,8 ולאחרונה מנתח מסחרי תא בזמן אמת (rtca) מחקר מעבדה9.

במנתח תא בזמן אמת מסחרי בעיקר קורא אותות התאים עורר של עכבה חשמלית, אשר הם תוצאה של השינויים הפיזיולוגיים של תאי הדגירה כולל התפשטות תאים, הגירה, הכדאיות, מורפולוגיה, הדבקות על פני השטח של סחר חופשי10,11. אותות חשמליים כאלה מומרים עוד יותר על ידי מנתח פרמטר שהוא בשם תא אינדקס (CI) כדי להעריך את מצב תא. השינוי של עכבה של סחר חופשי משקף בעיקר הסביבה המקומית יונית בתאי מכוסה ב הממשק אלקטרודה/פתרון. לכן, ביצועי אנליטי במנתח תא מסתמכת במידה רבה על יחידת חישה הליבה, הפיוזים חד פעמיות (קרי, לוחות אלקטרוניים כביכול, למשל, 96/16/8-ובכן), אשר עשויים ערוכים microelectrodes זהב lithographically הדפיס בחלק התחתון של דגירה בארות. Microelectrodes זהב להרכיב בתבנית עיגול-ב-line (איור 1), מכסה את רוב פני השטח הבארות דגירה, המאפשרים זיהוי דינאמי ורגיש של תאים המצורפת3,12,13 ,14. המודיע להגדיל במקרה של כיסוי השטח יותר של תאים על השבב, או להקטין את כאשר תאים נחשפים toxicant וכתוצאה מכך אפופטוזיס. למרות במנתח תא בזמן אמת שימש לעתים קרובות כדי לקבוע cytotoxicity11 ו neurotoxicity15 ולספק מידע קינטי יותר מאשר השיטה הקלאסית נקודות קצה, הלוחות האלקטרוניים חד פעמיות הן מהבדים מתכלים.

עד עכשיו, היו אין שיטות זמינות לרגנרציה של צלחת אלקטרונית, שהוא כנראה בשל העובדה כי תנאים קשים התחדשות, כגון פיראניה פתרון או חומצה אצטית הם מעורבים16,17, 18, אשר עשוי לשנות המצב חשמלי של סחר חופשי זהב. לכן, שיטה קלה ויעילה להסרת התאים חסיד וחומרים אחרים מפני השטח של שבבי זהב יהיה רצוי עבור תהליך התחדשות צלחת אלקטרונית. לאחרונה פיתחנו פרוטוקול מכוון לרגנרציה של חד פעמיים צלחות אלקטרונית באמצעות מתכלה ריאגנטים, האסימונים regenerated התאפיינו שיטות אלקטרוכימיות, כמו גם אופטי19. באמצעות ריאגנטים המעבדה זמינות ולא מתון כולל טריפסין, אתנול, הקמנו שיטה כללית להתחדש לוח אלקטרוני מסחרי ללא תופעות לוואי, אשר מיושמת בהצלחה לחדש את שני סוגים עיקריים צלחת אלקטרונית (16 והן L8) משמש rtca ב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: באופן כללי, התחדשות תהליך כולל לעיכול טריפסין, בשלב השטיפה עם אתנול ומים. זמן עיכול משתנה על פי מספר התאים בשימוש, סוג ומספר תאים בשימוש עשויות להשתנות בהתאם למטרות ניסוי. מומלץ לבדוק את הפיוזים מחדש באמצעות שיטות אלקטרוכימיות אופטי כדי למטב את התנאים התחדשות. במהלך הניסוי, עשויים להיות מעורבים כימיקלים מסיסים ובחלקם לא מסיסים, כאן אלה בשני מקרים טיפוסיים של התחדשות נהלים מפורטים.

1. הכנת התחדשות פתרונות

הערה: להכין, להתמודד עם כל הפתרונות תחת תנאים סטריליים.

  1. להתכונן 0.25% (g/v) טריים טריפסין פתרון. ניתן לרכוש טריפסין או להתמחויות כדלקמן.
    1. להמיס 0.25 g של טריפסין ב- 100 מ של תמיסת באגירה פוספט pH 7.4 (PBS).
    2. מערבבים את הפתרון עד טריפסין מפורקת לחלוטין בבית 4 oC. מערבבים את הפתרון במהירות נמוכה מקפיד להימנע כל היווצרות בועה.
    3. לסנן את הפתרון עם מסנן מיקרומטר 0.22 בשכונה אבטחה.
  2. להכין 75% אתנול באמצעות אתנול מוחלטת. שופכים 75 מ"ל אתנול מוחלטת לתוך בקבוקון הנפחי ומוסיפים מים יונים עד האחסון מגיע 100 מ. לבצע עיקור נוספות במידת הצורך.

2. דגירה והתפשטות תאים A549 לוחות אלקטרוניים

הערה: סוגי אלקטרונית צלחת 16 ואת L8 שניהם עשויים ערוכים microelectrodes זהב lithographically מודפס בחלק התחתון של דגירה בארות. צלחת אלקטרונית 16 יש 16 בארות בעוד אלקטרונית צלחת L8 יש 8 בארות. הבארות של צלחת אלקטרונית 16 עגולים בעוד הבארות צלחת אלקטרונית L8 הם מלבנים מעוגלים. הנפח של כל צלחת אלקטרונית 8 הוא µL בערך 830 והיא כל צלחת אלקטרונית 16 טוב µL 270 בערך.

  1. תרבית תאים A549
    1. התרבות התאים A549 ממוריאל פארק רוזוול המכון-1640 בינוני (RPMI-1640) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין בתרבות תא מגישים.
    2. המעבר את התאים צפיפות התאים מגיע ל ~ 75% ולאחר מכן לשטוף את שכבת תאים חסיד עם 1 × PBS, trypsinize עם פתרון טריפסין 0.25% 1 דקות ב- 37 oג צנטריפוגה התאים ב 179 g × במשך 5 דקות כדי להסיר טריפסין. Resuspend התאים בינוני 10 מ"ל לתרבות נוסף או ניסויים אחרים.
      הערה: הפתרון של תאים resuspended בטווח הבינוני כאן מיועדת כמו המאגר ההשעיה התא.
    3. להוציא את 10 µL, לספור את מספר הנייד באמצעות של hemocytometer. השתמש המדיום RPMI-1640 לדלל יותר המאגר התליה תא כדי להתכונן 30,000-80,000 תאים למ"ל תא ההשעיה מאגר הניסויים.
  2. רכישת הניסוי והנתונים התפשטות/cytotoxicity
    1. להוסיף 50 µL (150 µL לצלחת אלקטרונית L8) תא בינוני אינקובציית כל טוב צלחת אלקטרונית 16 ולהשאיר אותו למשך 30 דקות באבטחה הוד עבור equilibration. להוסיף באופן ידני לוח אלקטרוני 16 במנתח תא בזמן אמת בחממה2 CO-37 oC.
    2. להפעיל את תוכנית מבצע מנתח תא בזמן אמת על המחשב. על המחדל שלו להתנסות דף הגדרות תבנית, בחר "ניסוי דגם" ותנו שם פועל וזמינותו.
    3. בדף שלה פריסה ', בחר הבארות המתאימים כלולים הניסוי ולהזין את המידע כמו התא: סמים, מספר וסוג שמות בתיבות עריכה. בדף ' לוח הזמנים שלה, להוסיף את השלבים ניסיוני ולאחר מכן בחר הזמן רץ (כגון: 12, 24, או 48 שעות) של כל שלב, מרווח של רכישת נתוני זמן-אמת.
      הערה: כאן, מרווח הזמן של שלב 1 ו-2 הינם 1 דקות 15 דקות לאחר מכן.
    4. שמור את הקובץ ולחץ על לחצן "התחל" כדי למדוד את הרקע אימפדנס של המדיה על דף אינדקס התא שלה; הנתונים שיתקבלו להיות מופחתים באופן אוטומטי. בדף שלה טוב הגרף, ניתן לבקר כל עקומות היטב. עמוד העלילה שלה, להוסיף בבארות גרף זמן-תא אינדקס להיות הראה.
    5. לניסוי התפשטות תאים, ראשית לחץ על לחצן 'השהה' כדי להשהות את התוכנית. לאחר מכן להוציא את הצלחת אלקטרונית, להוסיף 100 µL A549 תא ההשעיה מאגר לכל טוב בטמפרטורת החדר. להשאיר את הצלחת למשך 30 דקות בשכונה אבטחה כדי לאפשר את התאים ליישב לתחתית של דגירה בארות.
    6. הוספה ידנית את הצלחת אלקטרונית בתחנה מנתח תא בזמן אמת. לחץ על לחצן "התחל" כדי להמשיך את הניסוי.
      הערה: בדף ' עלילה ', מנתח ברציפות רשומות ערכי אינדקס התא או עקומות לאורך כל הניסוי.
    7. בתום הניסוי, היכנסו לדף מגרש ופתח את הקובץ הניסוי. ולאחר מכן בחר כל הבארות הדגירה שנבדקו ועיקולים אינדקס התא שנוצר, שניתן בממוצע או מנורמל בפעם האחרונה לפני הוספת תרופות או שינוי בינוני כדי להפחית וריאציות בין מבחני. בדף ' ניתוח נתונים ', EC50 או IC50 יכול להיות מחושב

3. התחדשות של לוחות אלקטרוניים

הערה: עבור כל שלב השטיפה, הפתרון בצלחת אלקטרונית היה מעורב באופן יסודי (5 - 10 פעמים) באמצעות פיפטה של.

  1. מקרה 1: עבור הערכה cytotoxicity של אנטי -תרופת סרטן
    1. זרעי A549 תאים בצלחת אלקטרונית כמפורט בסעיף 2.
    2. יש להמיס הידרוכלוריד דוקסורוביצין תרופה נגד סרטן (DOX) במדיום תא קודם. לאט לאט להוסיף DOX התאים (ריכוז DOX האחרון הוא µg 30/mL) באמצעות פיפטה של. שיא המודיע כמתואר בסעיף 2.
      הערה: לוח אלקטרוני המשמש היה מחדש מיד לאחר הניסוי היה שלם. במקרה זה, כפי DOX הוא כימיקל מסיסים, לרגנרציה של צלחת אלקטרונית בעקבות הפרוטוקול קל יחסית לטפל, אין בצעדים נוספים הדרושים.
    3. התחדשות
      1. להוציא לצלחת אלקטרוני המכיל תאים מתחנת מנתח תא בזמן אמת. שמים את הצלחת אלקטרוניים בשימוש בשכונה אבטחה סטרילי בטמפרטורת החדר ומערבבים בינוני תרבות ביסודיות באמצעות פיפטה. פיפטה החוצה כל המדיום.
      2. לשטוף צלחות אלקטרונית עם מים µL יונים 200 עבור 3 שעות בטמפרטורת החדר.
      3. לעכל את התאים הנותרים על לוחות אלקטרוניים עם 0.25% להתמחויות טריפסין במשך 1-2 h (200 µL טוב) בתוך אינקובטור ב 37 oC. כאשר העיכול הושלם, מערבבים את הפתרון הדגירה 5 - 10 פעמים באמצעות פיפטה פיפטה את כל הפתרון בשכונה אבטחה בטמפרטורת החדר.
      4. לשטוף צלחות אלקטרונית עם אתנול µL 200 ומים µL 200, בהתאמה, כדלקמן: יונים מים 2 פעמים, אתנול 100% 2 פעמים; 75% אתנול 2 פעמים; יונים מים פי 2. היפוך על הלוחית אלקטרונית גזה סטרילית או נייר טישו כדי decant את יתרת כמות המים בטמפרטורת החדר.
      5. אולטרה סגול לעקר את הצלחת אלקטרונית מחדש עבור 1-2 h בשכונה אבטחה בטמפרטורת החדר.
        הערה: כפול הנפח של פתרונות לכל לרגנרציה של צלחת אלקטרונית L8.
  2. מקרה 2: משלוח סמים באמצעות חומר mesoporous.
    1. להשתמש בחומרים סיליקה, כמו רוד mesoporous עם גודל נקבובית ממוצע של 5.6 nm כמו מטריצות משלוח סמים, כפי שדווחה בעבר20.
      הערה: כאן, לוח אלקטרוני הועסק לעקוב אחר השפעת סמים-שחרור על תאים.
      1. להוסיף חומרים mesoporous לתוך הפתרון דגירה של כל טוב של הלוחות האלקטרוניים. סיליקה חומרים אינם מסיסים ובחלקם precipitate בצלחת אלקטרונית, לשטוף את הצלחת כדלקמן:
    2. בצע צעדים 3.1.3.1-3.1.3.3 כמתואר עבור מקרה 1.
    3. יש לשטוף את הפיוזים במים µL יונים 200 פעם בשכונה אבטחה בטמפרטורת החדר.
    4. לשטוף את הפיוזים עם אתנול מוחלטת µL 200 פי 2 בטמפרטורת החדר.
    5. יש לשטוף את הפיוזים עם 200 µL 75% אתנול פעם בטמפרטורת החדר.
    6. מוסיפים 250 µL של 75% אתנול מכל קידוח, לאטום את הצלחת אלקטרונית עם הסרט איטום בטמפרטורת החדר.
    7. ספין-114 g x למשך 2 דקות ולרוקן את הצלחת אלקטרונית. היפוך על הלוחית אלקטרונית גזה סטרילית או נייר טישו כדי decant את יתרת כמות המים בטמפרטורת החדר.
    8. חזור על שלב 3.2.5-3.2.7 פעם.
    9. אולטרה סגול לעקר את הצלחת אלקטרונית מחדש עבור 1-2 h בשכונה אבטחה בטמפרטורת החדר.
      הערה: כפול הנפח של כל פתרון בעת שטיפה L8 לוחות אלקטרוניים.

4. הערכה של אפקט התחדשות

  1. מאפיינים אופטיים משטח regenerated צלחת אלקטרונית
    1. השימוש מפלדה כפיות לפרק בזהירות את החלק התחתון של הדגירה של טרי מחדש צלחת אלקטרוני המכיל מסודרים בשורות microelectrodes זהב... לובש כפפה פלסטיק, בזהירות לחסל את החלק המכילים שבב מהצלחת אלקטרונית באמצעות הכפית פלדה.
    2. מקום שני החלקים במרכזו של שקופיות מיקרוסקופ זכוכית ולאסוף ספקטרום ראמאן הנוצרת על ידי מיקרוסקופ ראמאן מצויד עם גלאי CCD21.
      הערה: ספקטרומטר היה מצויד עם לייזר nm 633, הספקטרום הוקלט במרווח של חשיפה ללייזר s 30 באורך-גל בטווח של 500-3500 ס מ-1. התמונות אופטי התקבלו על ידי מיקרוסקופ ראמאן באמצעות עדשת העין 10 x ויעד x 50. איור 1A ו- 1C איור התקבלו גם שימוש במנגנון ראמאן מיקרוסקופ המותקנים.
    3. כדי להעריך את הכדאיות של תאים המצורף לאחר ספיגת תרופות נגד סרטן על טריות ועל regenerated לוחות אלקטרוניים, להשתמש קונאפוקלית לייזר מיקרוסקופ סריקה כדי לפקח על ידי קרינה פלואורסצנטית ספונטנית של DOX מולקולות נקלטו על ידי A549.
      1. כדי להקליט את קרינה פלואורסצנטית ספונטנית של DOX נספג על ידי השימוש (regenerated ורענן אלקטרונית צלחות עם תאים A549), תאים 63 X שמן nm אובייקטיבית, 485 כמו הגל עירור.
  2. התנהגויות אלקטרוכימי של אלקטרודות מחדש
    הערה: כמו הסוואת ידנית של צלחת אלקטרוני מסחרי הוא לא אידיאלי להערכה של מצב חשמלי השטח כפי בדקתי וקשה, היעילות התחדשות של הפרוטוקול הוערך באמצעות אלקטרודה פחמן זהב/מזוגגות נורמלי (GCE) כמו מבחן פלטפורמה, שבו בוצעה עכבה אלקטרוכימי ספקטרוסקופיה (EIS). הקוטר של האלקטרודה Au וגם GCE הם 3 מ מ. אלקטרוכימי הנתונים התקבלו על ידי מנתח אלקטרוכימי מערכת 3-אלקטרודה מדידות עכבה בוצעו באמצעות אות חילופין (AC) של משרעת 10 mV ב תדר רחב טווח של 100 קילו-הרץ עד 0.01 הרץ.
    1. לפני המדידה, פולנית Au אלקטרודה של GCE על משטח דמוי מראה עם slurry אלומינה על בד ליטוש, ואחריו sonication במים כדי להסיר את כל החלקיקים.
    2. להפעיל את האלקטרודה Au 0.5 M H2אז4. להשיג נתונים EIS של חשופות אלקטרודה Au ו- GCE 10 מ מ אשלגן כלורי אלקטרוליט פתרון המכיל 1 מ מ K3[Fe(CN)6] כפי שמתואר22.
    3. להכין פתרון תא A549 מניות לפי 2.1.2 ו 2.1.3. ירידה 10 µL תא השעיה על-פני האלקטרודה Au ו- GCE. דגירה אלקטרודה Au ו GCE שופרת בתאים חממה 37 C oעבור 3 ה EIS להשיג נתונים של האלקטרודה Au GCE ששינה עם תאים ב- 10 מ מ אשלגן כלורי אלקטרוליט פתרון המכיל 1 מ מ K3[Fe(CN)6].
    4. להתחדש האלקטרודות באמצעות פרוטוקול מידה EIS.
      1. לטבול האלקטרודה Au ושינית GCE עם תאים ב- 0.25% טריפסין 0.5-2 ח' לשטוף את האלקטרודה Au ואת GCE בעדינות עם מים 4 פעמים. לשטוף את אלקטרודות ברכות עם אתנול מוחלטת 4 פעמים. Immerge Au אלקטרודה ולשטוף GCE 75% אתנול עבור ~ 5 דק את האסימונים ברכות עם 75% אתנול 4 פעמים.
      2. להשיג נתונים EIS regenerated אלקטרודה Au ו GCE בפתרון 10 מ מ אשלגן כלורי אלקטרוליט המכיל 1 מ מ K3[Fe(CN)6].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מאפייני משטח של סחר חופשי זהב: ההליכים התחדשות בשימוש פרוטוקול זה היו המתוארים באיור1. איור 2 מציג מיקרוסקופיים תמונות של טרי על פני השטח ואת מחדש לוחות אלקטרוניים באמצעות המיקרוסקופ האופטי. כפי שמוצג באיור 2A ו- איור 2C, מיקרוסקופיים תצפיות הצביעו על כך שאין כמעט הבדל במאפייני אופטי של השבב פני השטח בין רעננה וטיפל לוחות אלקטרוניים. שימוש של זריחה ספונטנית של מולקולות דוקסורוביצין כלול בתוך התאים נוח עבור הערכה של מצב תא, הבחנו של הומוגניות דומה של תאים בתרבית על הפיוזים זהב לאחר לרגנרציה (איור 2B ו איור דו-ממדי ). בנוסף, התאים הסרטניים מודגרות מוצגות מורפולוגיה הסלולר מוגדרים היטב לוח אלקטרוני הממחיש את שימושית של שבבי. איור 3 מראה ראמאן ספקטרום של לוחות אלקטרוניים מחדש ורענן. ההפצות שיא ראמאן כמעט זהה בין הלוחות האלקטרוניים טרי ומטופל ציינו כי תהליך התחדשות מוצלחת של המשטח שבב זהב. האותות ראמאן לוחות אלקטרוניים מכוסה A549 תאים התעוותו במידה מסוימת, כנראה בגלל ההפרעות מ זריחה ספונטנית של תאים A549.

מחדש שבבים עבור וזמינותו cytotoxicity באמצעות rtca ב: אנחנו להחיל גם על פרוטוקול התחדשות עבור מבחן של התא התפשטות והחומרים cytotoxicity הערכה (איור 4). A549 תאים של האופטימלית צפיפות היו נזרע לצלחת אלקטרונית regenerated 16, עקומות גדילה קינטי נרשמו על ידי מנתח תא בזמן אמת. כמו באיור איור 4A, כל וכתוצאה מכך עקומות גדילה של מקבילים בארות ניסיוני הראה עקביות נאותה, מה שמעיד כי המצב חשמלי משטח של צלחת אלקטרונית 16 מאוד נשמרות לאחר ההתחדשות. לוח אלקטרוני regenerated L8 נבדקה גם cytotoxicity באמצעות חומרים סיליקה mesoporous, כפי שמוצג באיור 4B. לעומת הניסוי שליטה, המודיע של דגימות שטופלו חומרים mesoporous ירד במידה מסוימת, המציין של cytotoxicity קלה של החומרים. עיטוף נוסף ושחרור של התרופה נגד סרטן Dox על ידי חומרים mesoporous נגרמת ירידה דרמטית של עקומת הגדילה של A549. אלה תוצאות הניסוי הראו עקביות באמצעות לוחות אלקטרוניים טריים, עם העבודה שדווחה בעבר19, אשר לאמת את היעילות של פרוטוקול זה התחדשות המוצע.

יעילות התחדשות מוערך על ידי שיטות אלקטרוכימיות: אלקטרודות Au מסחרי ואלקטרודות פחמן מזוגגות שימשו פלטפורמות בדיקה עבור הערכת יעילות התחדשות. איור 5 מציגה את אלקטרודות EIS של Au GCE ששונו עם תאים סרטניים. זה הוצג כי לאחר דגירה של תאים A549 על האלקטרודה, גידול ניכר של התנגדות העברת אלקטרונים (Ret) נצפתה בהשוואה לזה של אלקטרודות חשופות. רט היה ירדה משמעותית לאחר Au אלקטרודה של GCE טופלו לפי הפרוטוקול באיור5. השינויים דומה של רט של אלקטרודה Au הן ו- GCE ציינו כי תהליך התחדשות אוניברסלי ויעיל של סחר חופשי לגבי תכונותיהם חשמלי משטח.

Figure 1
איור 1: תהליך התחדשות של לוחות אלקטרוניים. בחידוש של טיפוסי לרוץ, ארבעה שלבים עיקריים היו מעורבים כולל המקננת תאים, כמו גם ניתוק שלהם על פני לוחות אלקטרוניים ואחריו את השטיפה, ספינינג, והשלבים עיקור אולטרה סגול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: מאפייני השטח לוחות אלקטרוניים. (א) החדש אלקטרונית A549 (B) תאים מצופים בא (ג) Regenerated אלקטרונית פלטות A549 (ד) תאים מצופים ב- C. במקרה של תאים המחובר בשבבים זהב, שימש DOX. איור 2A ואיור 2C שונו מ שו, צ. et al. 19 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: ספקטרום ראמאן של שונות שטופלו לוחות אלקטרוניים. צלחת אלקטרונית חדשה (א) . (B) צלחת אלקטרונית חדש נזרע עם תאים A549. (ג) מחדש צלחת אלקטרונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: עקומות גדילה של תאים A549 על לוחות אלקטרוניים regenerated שלוש פעמים. (א) עקומות גדילה מקבילים של תאים נזרע בצלחת אלקטרונית 16. (B) Cytotoxicity בדיקת חומרים סיליקה mesoporous בצלחת אלקטרונית L8 עם קווי שגיאה (סטיית תקן, סטיית תקן) של עקומות מוקלטות של דגירה כל טוב. איור 4A שונתה מ שו, צ. et al. 19 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: ספקטרום עכבה אלקטרוכימי של שונות ששינה אלקטרודות זהב ואלקטרודות פחמן מזוגגות (GCE) ב- 10 מ מ אשלגן כלורי אלקטרוליט פתרון המכיל 1 מ מ K3[Fe(CN)6]. (א) שונות שטופלו Au אלקטרודות. (B) שונה התייחסה GCE. איור 5A היה שונה fromXu, צ. et al. 19 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

יישום צ'יפ התחדשות מאגר התחדשות אסטרטגיה
פלזמון משטח תהודה (SPR) פיראניה פתרון (מרוכז H2אז4-/30% H-2O-2 = 3:1, וי/v)17 רצועת analyte והן בדיקה המבוססת על oxidization חזק
חיישנים פיזואלקטריים Microcantilever (PEMS) גליצין-HCl תערובת23,24 מביצועם המתחם היעד-בדיקה ולהסיר את analyte
ריכוז המלח גבוה פתרון (2 מ' MgCl2 + 1.5 מ' טריס)25
סרט זהב 50 מ מ KOH + 25% H2O226 אורגניקס מחומצנת

טבלה 1: סיכום קצר של התחדשות דווח על אסטרטגיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנחנו סיכם כמה משיטות17,23,24,25,26 ולשם רגנרציה בשבבים בטבלה1. בעיקרון, שיטות אלה מעורב בתנאים קשים יחסית ניסיוני כדי להשיג את התחדשות מוחלטת של שבבי עקב הנוכחות של מולקולה חזקה-מולקולה אינטראקציות כגון זו של המתחם החיסון משמש SPR צ'יפס. עם זאת, התנאים הקשים הללו ניסיוני עשוי להיות מזיקה ביותר עבור מאפייני השטח ערוכים בשבבים זהב בשימוש rtca. לכן, שיטה קלה ויעילה היו השיקולים העיקריים בהתפתחות של האסטרטגיה התחדשות שהוצגו. גורמים נוספים חשובים לא פחות הם חששות סביבתיים, מאז שבבים חד פעמיות אלה משמשים לעתים קרובות יחד עם תאים סרטניים יישוב.

ב פרוטוקול זה, נסקור שיטה כללית לשם רגנרציה מסחרי בשבבים זהב ערוכים משמש rtca. פרוטוקול שלנו פותחה בהתאם טריפסין-עיכול ושטיפה עם אתנול ומים. ספינינג נוסף צעדים נחשב כיעיל בהסרת החלקיקים לא מסיסים המשמש את הבדיקה עבור תהליך התחדשות. בהשוואה של ריאגנטים בשימוש בשיטות שדווחה בעבר, ריאגנטים טריפסין ואתנול ההתחדשות זמינים לשימוש מעבדה מדי יום, המוצרים/חומרים ביולוגיים אלה הן רעילות נמוכה, ולכן נחשבים להיות ידידותי לסביבה, אשר רצוי למטרות של התחדשות.

ב פרוטוקול זה, השלב הקריטי הוא העיכול טריפסין כדי להבטיח את הביצועים התחדשות של סחר חופשי זהב. אופטימיזציה של trypsinization, כולל ריכוז וזמן, צריכה להיות העדיפות הראשונה כדי להשיג התחדשות. מלבד הזמן לעיכול היא התהילה שלנו הדוח הקודם19, הערכה טובה עבור תהליך אופטימיזציה הוא פשוט לבדוק את מאפייני השטח באמצעות מיקרוסקופ אופטי.

חשש נוסף הוא הטיפול סחר חופשי במהלך תהליך ההתחדשות. כפי פיפטה משמש לעתים קרובות בניסויים, תשומת הלב צריך להיות משולם על ידי אנשי להימנע מגרד את הטיפ על פני השטח של סחר חופשי. יתר על כן, מומלץ מראש לעקר את עצות גזה, כפית כדי להבטיח יעילות התחדשות. ואחרון אחרון חביב, יש לנהל את תהליך ההתחדשות בשכונה אבטחה כדי למנוע כל זיהום.

יצוין, כי התהליכים השטיפה מעורב פרוטוקול התחדשות ידנית מתנהלים, אשר יגרום בהכרח הטיה עקב אנשי שונות. כדי להתגבר על מגבלה זו, ציוד אוטומטי או חצי אוטומטי עבור שטיפה למטרות יכול להיות מותאם אישית מעוצבת, בהתחשב הלוחות האלקטרוניים מודולרי בשימוש. בנוסף, פרוטוקול התחדשות נבדקו כדי להיות אפקטיבית עבור מבחני מבוססת-תא. אולם, בנוכחות אינטראקציות מולקולריים חזקים, כגון היווצרות נוגדן אנטיגן-הממשק של צ'יפס, התנאים התחדשות המוצע עשוי להיות מוגבל במידה רבה, יש לקחת בחשבון את התנאים מאגר חזקה יחסית.

בסך הכל, הפרוטוקול התחדשות הנוכחי נבדקו כדי לאפשר את השימוש החוזר ונשנה של שבבים זהב מסחרי, כמו גם אחרים אלקטרודות ניצוח כגון Au ואלקטרודות פחמן מזוגגות. אנו מצפים כי היישום של פרוטוקול זה יציל את העלות פועל גבוהה של מבחני תא מבוססי שבב בזמן אמת. בטווח הארוך, מבחני מבוססי שבב אלקטרוני הופכת יותר משמשים לעתים קרובות לניתוח פרוטיאומיה מבנית וסלולר, הפרוטוקול המוצע במחקר זה יכולים להציע אופציה עבור ההתחדשות, איזה ציוד אוטומטי או חצי אוטומטי עבור שטיפה יכול להיות מעוצב, אשר מיושמים מקרים של שבבי חד פעמיות שהצטברו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

העבודה נתמכה על ידי הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (U1703118), פרויקט במימון עדיפות אקדמי תוכנית הפיתוח של ג'יאנגסו להשכלה גבוהה מוסדות (משטרת משמר החופים), ג'יאנגסו Shuangchuang התוכנית, קרנות פתוח של המפתח המדינה מעבדה כימותרפיה/Biosensing ו כימומטריה (2016015), את נבחרת מעבדה של ובמקרו-מולקולות ביולוגיות (2017kf05), פרופסור Jiangsu Specially-Appointed פרוייקט, סין.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat: Sprague-Dawley Charles River Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) Bio-Rad Cat# MCA275R Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1  Abcam Cat# AB5076 Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67  Abcam  Cat# AB15580 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 Invitrogen Cat# 11055 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 Invitrogen Cat# A-21203 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 Invitrogen Cat# A-31573 Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining) Thermo Fisher Cat# 28313
Heparan sulfate Galen Laboratory Supplies Cat# GAG-HS01
Heparin Sigma  Cat# M3149
Peptone from milk solids Sigma Cat# P6838
TGF-β2 Peprotech Cat# 100-35B
Murine IL-34 R&D Systems Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol Avanti Polar Lipids Cat# 700000P
Collagen IV Corning  Cat# 354233
Oleic acid Cayman Chemicals  Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid Cayman Chemicals  Cat# 20606
Calcein AM dye Invitrogen Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1 Invitrogen Cat# E1169
DNaseI Worthington Cat# DPRFS
Percoll PLUS GE Healthcare Cat# 17-5445-02
Trypsin  Sigma Cat# T9935
DMEM/F12 Gibco Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin Gibco Cat# 15140-122
Glutamine Gibco Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine  Sigma Cat# A9165
Insulin Sigma Cat# 16634
Apo-transferrin  Sigma Cat# T1147
Sodium selenite Sigma Cat# S-5261
DMEM (high glucose) Gibco Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G Southern Biotech Cat# 0100-20 
Poly-D-Lysine  Sigma Cat# A-003-E
Primaria Plates  VWR Cat# 62406-456
Stock reagents  reconstitution  Concentration used Storage
Apo-transferrin 10 mg/mL in PBS  1:100 -20°C
N-acetyl cysteine 5 mg/mL in H2O  1:1,000 -20°C
Sodium selenite 2.5 mg/mL in H2O  1:25,000 -20°C
Collagen IV 200 μg/mL in PBS  1:100 -80°C
TGF-b2 20 μg/mL in PBS  1:10,000 -20°C
IL-34 100 μg/mL in PBS  1:1,000 -80°C
Ovine wool cholesterol 1.5 mg/mL in 100% ethanol  1:1,000 -20°C
Heparan sulfate 1 mg/mL in H2O 1:1,000 -20°C
Oleic acid/Gondoic acid Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol  1:1,000 -20°C
Heparin 50 mg/mL in PBS  1:100 -20°C
Solutions  Recipe  Comments
Perfusion Buffer 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Use when ice-cold
Douncing Buffer 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Use when ice-cold
Panning Buffer 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM) DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)  MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
  2. Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
  3. Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
  4. Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
  5. Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
  6. Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
  7. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  8. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
  9. Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
  10. Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
  11. Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
  12. Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
  13. Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792 (2011).
  14. Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
  15. Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748 (2014).
  16. Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
  17. Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
  18. Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
  19. Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
  20. Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
  21. Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
  22. Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
  23. Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
  24. McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
  25. Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
  26. Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).

Tags

ביוכימיה גיליון 133 ללא תווית מבוססת-תא assay התחדשות מסודרים בשורות microelectrodes זהב מנתח תא בזמן אמת טריפסין
חידוש ערוכים Microelectrodes זהב מצויד מנתח תא בזמן אמת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, Z., Song, Y., Jiang, H., Kong,… More

Xu, Z., Song, Y., Jiang, H., Kong, Y., Li, X., Chen, J., Wu, Y. Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer. J. Vis. Exp. (133), e56250, doi:10.3791/56250 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter