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Biochemistry

सरणी गोल्ड Microelectrodes के पुनर्जनन एक वास्तविक समय सेल विश्लेषक के लिए सुसज्जित

Published: March 12, 2018 doi: 10.3791/56250
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 3, 1, 4
1School of Public Health, Nanjing Medical University, 2School of Pharmacy, Nanjing Medical University, 3State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing Tech University, 4Department of Medical Oncology, Jiangsu Cancer Hospital, Jiangsu Institute of Cancer Research, The Affiliated Cancer Hospital of Nanjing Medical University
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक सामांय रणनीति के लिए एक लेबल मुक्त सेल विश्लेषक उच्च चल लागत ofmicrochip-परख के आधार पर बचत के उद्देश्य से वाणिज्यिक सरणी सोने microelectrodes पुनर्जीवित पुनर्जंम के लिए । पुनर्जनन प्रक्रिया trypsin पाचन शामिल है, इथेनॉल और पानी के साथ धोने, और एक कताई कदम है, जो माइक्रोचिप्स के उपयोग के दोहराया सक्षम बनाता है ।

Abstract

लेबल मुक्त सेल आधारित परख क्योंकि यह प्रयोगात्मक पशुओं के उपयोग की आवश्यकता नहीं है जैव रासायनिक अध्ययन के लिए लाभप्रद है । अपने को शास्त्रीय जैव रासायनिक परख से शारीरिक स्थितियों के तहत कोशिकाओं के बारे में अधिक गतिशील जानकारी प्रदान करने की क्षमता के कारण, इस लेबल मुक्त वास्तविक समय सेल विद्युत प्रतिबाधा सिद्धांत पर आधारित परख अतीत के दौरान अधिक ध्यान आकर्षित कर रहा है दशक. हालांकि, इसकी व्यावहारिक उपयोग माप की अपेक्षाकृत महंगी लागत, जिसमें महंगा उपभोज्य डिस्पोजेबल सोने माइक्रोचिप्स सेल विश्लेषक के लिए उपयोग किया जाता है के कारण सीमित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, हम एक सामांय रणनीति विकसित की है एक वाणिज्यिक लेबल मुक्त सेल विश्लेषक के लिए सुसज्जित सरणी सोने microelectrodes पुनर्जंम । पुनर्जनन प्रक्रिया trypsin पाचन, इथेनॉल और पानी के साथ धोने, और एक कताई कदम भी शामिल है । प्रस्तावित विधि का परीक्षण किया गया है और वाणिज्यिक इलेक्ट्रॉनिक प्लेटों के पुनर्जनन और दोहराया उपयोग के लिए प्रभावी होने के लिए दिखाया गया है, जो मदद करेगा शोधकर्ताओं ने वास्तविक समय सेल परख के उच्च चल लागत पर बचाने के लिए कम से तीन बार ।

Introduction

अपने कुशल और कम श्रम गहन प्रयोगात्मक प्रक्रिया के कारण, लेबल मुक्त सेल आधारित प्रौद्योगिकी विश्लेषणात्मक के लिए पिछले एक दशक में तेजी से वृद्धि देखी गई है और साथ ही स्क्रीनिंग प्रयोजनों प्रोटियोमिक्1के पहलू में के रूप में,2 , दवा वितरण3, आदि4,5 परंपरागत जैव रासायनिक सेल विश्लेषण के उद्देश्य से तरीकों के साथ तुलना में, लेबल से मुक्त वास्तविक समय सेल परख प्रोटोटाइप के साथ Giaever और सहकर्मियों द्वारा विकसित पहले6 सेल की सतह पर बिजली के संकेत परिवर्तन-संलग्न माइक्रोचिप्स, जो एक मात्रात्मक तरीके से सेल विकास या प्रवास के एक सतत माप की अनुमति रिकॉर्डिंग के सिद्धांत पर आधारित है । इस रणनीति के बाद, एक वास्तविक समय सेल इलेक्ट्रॉनिक सेंसिंग (आरटी-CES) प्रणाली का उपयोग कर विद्युत प्रतिबाधा आधारित पता लगाने के सिद्धांत7,8 और अधिक हाल ही में एक वाणिज्यिक रीयल-टाइम सेल विश्लेषक (RTCA) शुरू किया गया था प्रयोगशाला अनुसंधान के लिए9.

वाणिज्यिक रीयल-टाइम सेल विश्लेषक मुख्य रूप से बिजली प्रतिबाधा, जो सेल प्रसार, प्रवास, व्यवहार्यता, आकृति विज्ञान, और पालन सहित मशीनी कोशिकाओं के शारीरिक परिवर्तन से परिणाम के ' कोशिकाओं पैदा संकेतों बाहर पढ़ता है माइक्रोचिप्स की सतह10,11. इस तरह के बिजली के संकेतों को आगे एक क्वांटिटी पैरामीटर सेल सूचकांक (CI) नाम में सेल स्थिति का आकलन करने के लिए विश्लेषक द्वारा परिवर्तित कर रहे हैं । माइक्रोचिप्स के प्रतिबाधा के परिवर्तन मुख्य रूप से इलेक्ट्रोड पर कवर कोशिकाओं के स्थानीय ईओण वातावरण को दर्शाता है/समाधान इंटरफ़ेस. इसलिए, सेल विश्लेषक के विश्लेषणात्मक प्रदर्शन कोर संवेदन इकाई पर भारी निर्भर करता है, डिस्पोजेबल माइक्रोचिप्स (यानी, तथाकथित इलेक्ट्रॉनिक प्लेटें, उदा, 96/16/8-ठीक है), जो सरणी सोने microelectrodes के बने होते है lithographically मशीन कुओं के नीचे मुद्रित । सोने की microelectrodes एक सर्कल में इकट्ठा-ऑन लाइन प्रारूप (चित्रा 1) और मशीन कुओं की सतह क्षेत्र के सबसे कवर, जो संलग्न कोशिकाओं के गतिशील और संवेदनशील पता लगाने के लिए अनुमति3,12,13 ,14. CI चिप पर कोशिकाओं के अधिक सतह कवरेज के मामले में वृद्धि होगी, और कम जब कोशिकाओं को एक विषैले apoptosis में जिसके परिणामस्वरूप के संपर्क में हैं । हालांकि वास्तविक समय सेल विश्लेषक अक्सर cytotoxicity11 और neurotoxicity15 निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और शास्त्रीय समापन विधि से अधिक काइनेटिक जानकारी प्रदान करते हैं, डिस्पोजेबल इलेक्ट्रॉनिक प्लेटें महंगा कर रहे हैं उपभोज्य.

अब तक, इलेक्ट्रॉनिक प्लेट, जो शायद इस तथ्य के कारण है कि कठोर पुनर्जनन की स्थिति, जैसे पिरांहा समाधान या एसिटिक एसिड16,17शामिल है के उत्थान के लिए कोई उपलब्ध तरीकों गया है, 18, जो सोने की माइक्रोचिप्स की बिजली की स्थिति को बदल सकता है । इसलिए, एक हल्के और कुशल विधि सोने के चिप्स की सतह से अनुयाई कोशिकाओं और अंय पदार्थों को दूर करने के लिए इलेक्ट्रॉनिक प्लेट पुनर्जनन प्रक्रिया के लिए वांछनीय होगा । हम हाल ही में एक डिस्पोजेबल इलेक्ट्रॉनिक प्लेटें गैर संक्षारक एजेंट और पुनर्जीवित चिप्स का उपयोग कर के पुनर्जनन के उद्देश्य से एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया है विद्युत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ऑप्टिकल तरीकों के रूप में19विशेषता । trypsin और इथेनॉल सहित आसानी से उपलब्ध है और उदारवादी प्रयोगशाला एजेंट का उपयोग करके, हम एक सामान्य विधि प्रतिकूल प्रभाव के बिना वाणिज्यिक इलेक्ट्रॉनिक प्लेट पुनर्जीवित करने के लिए स्थापित किया है, जो सफलतापूर्वक दो मुख्य प्रकार पुनर्जीवित करने के लिए लागू होता है इलेक्ट्रॉनिक प्लेट (दोनों 16 और L8) RTCA के लिए इस्तेमाल किया ।

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Protocol

नोट: सामांय में, पुनर्जनन प्रक्रिया trypsin पाचन और इथेनॉल और पानी के साथ कुल्ला कदम भी शामिल है । उपयोग किए गए कक्षों की संख्या के अनुसार पाचन समय बदलता है, और उपयोग किए गए कक्षों की संख्या और प्रकार प्रायोगिक उद्देश्यों के आधार पर अलग हो सकते हैं । यह पुनर्जीवित करने के लिए ऑप्टिकल और विद्युत तरीकों का उपयोग कर reजनरेशन की स्थिति का अनुकूलन माइक्रोचिप्स की जांच करने की सलाह दी है । प्रयोग के दौरान, घुलनशील और अघुलनशील रसायनों को शामिल किया जा सकता है, और यहां पुनर्जनन प्रक्रियाओं के इन दो विशिष्ट मामलों विस्तृत कर रहे हैं ।

1. पुनर्जनन समाधान की तैयारी

नोट: तैयार है और बाँझ शर्तों के तहत सभी समाधान संभाल ।

  1. ताज़ा 0.25% (g/v) trypsin समाधान तैयार करें । Trypsin खरीदा जा सकता है या हौसले से तैयार इस प्रकार है ।
    1. पीएच 7.4 फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के 100 मिलीलीटर में trypsin के 0.25 जी भंग ।
    2. समाधान हलचल जब तक trypsin पूरी तरह से 4 में भंग हो रहा है oC. किसी भी बुलबुला गठन से बचने के लिए देखभाल लेने कम गति पर समाधान हलचल.
    3. के साथ समाधान फ़िल्टर एक 0.22 µm फिल्टर के साथ एक सुरक्षा हूड.
  2. तैयार 75% इथेनॉल निरपेक्ष इथेनॉल का उपयोग कर । एक volumetric कुप्पी में 75 मिलीलीटर निरपेक्ष इथेनॉल डालो और जब तक मात्रा 100 मिलीलीटर तक पहुंच जाता है पानी जोड़ें । यदि आवश्यक हो तो आगे नसबंदी करें ।

2. मशीन और इलेक्ट्रॉनिक प्लेटों में A549 कोशिकाओं के प्रसार

नोट: इलेक्ट्रॉनिक प्लेट प्रकार 16 और L8 दोनों सरणी सोने microelectrodes lithographically के बने है मशीन कुओं के नीचे मुद्रित । इलेक्ट्रानिक प्लेट 16 में 16 कुएं हैं जबकि इलेक्ट्रानिक प्लेट L8 में 8 कुएं हैं । इलेक्ट्रॉनिक प्लेट १६ के कुएँ गोल हैं जबकि इलेक्ट्रॉनिक प्लेट L8 के कुएँ गोल आयत हैं. प्रत्येक इलेक्ट्रॉनिक प्लेट की मात्रा 8 अच्छी तरह से के बारे में है 830 µ l और प्रत्येक इलेक्ट्रॉनिक प्लेट 16 अच्छी तरह से के बारे में है 270 µ l

  1. A549 सेल कल्चर
    1. रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट में कल्चरल A549 सेल-१६४० मीडियम (RPMI-१६४०) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और सेल कल्चर डिश में 1% पेनिसिलिन-streptomycin के साथ पूरक है ।
    2. जब सेल घनत्व तक पहुंच कोशिकाओं ~ 75% तो 1 × पंजाबियों और trypsinize के साथ 0.25% trypsin समाधान के साथ अनुयाई सेल परत धो पर 1 मिनट के लिए 37 ओसी पर कोशिकाओं को दूर करने के लिए 5 मिनट के लिए 179 × g trypsin । आगे संस्कृति या अन्य प्रयोगों के लिए 10 मिलीलीटर माध्यम में कोशिकाओं को फिर से स्थगित ।
      नोट: मध्यम में reसस्पैंड कक्षों का समाधान यहां कक्ष निलंबन बफ़र के रूप में निर्दिष्ट किया गया है ।
    3. बाहर ले 10 µ एल और एक hemocytometer का उपयोग कर सेल संख्या गिनती । RPMI-१६४० मध्यम का उपयोग करने के लिए और प्रयोगों के लिए 30000-80000 कक्ष/एमएल सेल निलंबन बफर तैयार करने के लिए सेल निलंबन बफर को पतला करने के लिए ।
  2. प्रसार/cytotoxicity प्रयोग आणि डेटा अर्ज
    1. जोड़ें 50 µ एल (इलेक्ट्रॉनिक प्लेट L8 के लिए 150 µ एल) सेल मध्यम इलेक्ट्रॉनिक प्लेट 16 के प्रत्येक मशीन के लिए अच्छी तरह से और equilibration के लिए इस में 30 मिनट के लिए मैन्युअल रूप से इलेक्ट्रॉनिक प्लेट 16 में रीयल-टाइम सेल विश्लेषक में सह2 मशीन 37 ओसी पर डालें
    2. कंप्यूटर पर रीयल-टाइम कक्ष विश्लेषक कार्रवाई प्रोग्राम लॉंच । अपने डिफ़ॉल्ट प्रयोग पैटर्न सेटअप पृष्ठ पर, का चयन करें "प्रयोग मॉडल" और चल परख नाम ।
    3. इसके लेआउट पृष्ठ पर, प्रयोग में शामिल संगत कुओं का चयन करें और संपादन बक्सों में कक्ष प्रकार, संख्या और औषध नामों जैसी जानकारी का इनपुट दें. इसके शेड्यूल पृष्ठ पर, प्रायोगिक चरण जोड़ें, फिर रीयल-टाइम डेटा प्राप्ति के प्रत्येक चरण और अंतराल के रनिंग टाइम (उदा., 12, 24 या 48 एच) का चयन करें ।
      नोट: यहां, चरण 1 और 2 के अंतराल के बाद 1 मिनट और 15 मिनट हैं ।
    4. फ़ाइल सहेजें और अपने सेल सूचकांक पृष्ठ पर मीडिया की पृष्ठभूमि प्रतिबाधा को मापने के लिए "प्रारंभ" बटन पर क्लिक करें; परिणामी डेटा स्वचालित रूप से घटाया जाएगा । इसकी अच्छी तरह से ग्राफ पृष्ठ पर, सभी अच्छी तरह से घटता का दौरा किया जा सकता है । इसके प्लाट पेज पर कुओं को जोड़ें और टाइम-सेल इंडेक्स का ग्राफ दिखाया जाएगा ।
    5. सेल प्रसार प्रयोग के लिए, सबसे पहले कार्यक्रम को थामने के लिए "रोकें" बटन पर क्लिक करें । तो बाहर इलेक्ट्रॉनिक प्लेट ले और कमरे के तापमान पर प्रति अच्छी तरह से 100 µ एल A549 सेल निलंबन बफर जोड़ें । के लिए थाली छोड़ दो सुरक्षा डाकू में 30 मिनट के लिए चलो कोशिकाओं को मशीन कुओं के नीचे बसा ।
    6. मैन्युअल रूप से इलेक्ट्रॉनिक प्लेट रीयल-टाइम कक्ष विश्लेषक स्टेशन में सम्मिलित करें । प्रयोग जारी रखने के लिए "Start" बटन पर क्लिक करें ।
      नोट: पर प्लॉट पृष्ठ, विश्लेषक लगातार रिकॉर्ड कक्ष अनुक्रमणिका मान या घटता प्रयोग में ।
    7. जब प्रयोग पूर्ण हो जाए, तो प्लॉट पृष्ठ दर्ज करें और प्रयोग फ़ाइल खोलें । फिर सभी परीक्षण की गई मशीन कुओं और परिणामी सेल सूचकांक घटता है कि औसत या दवा दवाओं या माध्यम को बदलने के लिए परख के बीच बदलाव को कम करने से पहले पिछली बार के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता का चयन करें । डेटा विश्लेषण पृष्ठ पर, EC50 या IC50 की गणना की जा सकती है

3. इलेक्ट्रॉनिक प्लेट्स का पुनर्जनन

नोट: प्रत्येक धोने कदम के लिए, इलेक्ट्रॉनिक प्लेट में समाधान एक पिपेट का उपयोग कर (5-10 बार) अच्छी तरह से मिलाया गया था ।

  1. केस 1: एंटी कैंसर ड्रग के cytotoxicity मूल्यांकन के लिए
    1. खंड 2 में वर्णित के रूप में इलेक्ट्रॉनिक प्लेट पर बीज A549 कोशिकाओं ।
    2. सेल मीडियम में एंटी कैंसर ड्रग डॉक्सोरूबिसिन हाइडरोक्लॉराइड (DOX) को पहले भंग करें । धीरे DOX कोशिकाओं को जोड़ने (DOX के अंतिम एकाग्रता 30 µ जी/एमएल) एक पिपेट का उपयोग कर रहा है । खंड 2 में वर्णित के रूप में CI रिकॉर्ड है ।
      नोट: प्रयोग के पूरा होने के तुरंत बाद इलेक्ट्रॉनिक प्लेट का इस्तेमाल फिर से जेनरेट किया गया. इस मामले में, के रूप में DOX एक घुलनशील रासायनिक है, इलेक्ट्रॉनिक प्लेट के पुनर्जनन प्रोटोकॉल निंनलिखित अपेक्षाकृत आसान है संभाल करने के लिए और कोई अतिरिक्त कदम की जरूरत है ।
    3. उत्थान
      1. रीयल-टाइम कक्ष विश्लेषक स्टेशन से कक्षों वाली इलेक्ट्रॉनिक प्लेट बाहर ले जाएं । कमरे के तापमान और मिश्रण संस्कृति मध्यम अच्छी तरह से एक पिपेट का उपयोग कर में एक बाँझ सुरक्षा हुड में इस्तेमाल किया इलेक्ट्रॉनिक प्लेट प्लेस । सभी माध्यमों को बाहर पिपेट ।
      2. कमरे के तापमान पर 3 बार के लिए 200 µ l जल के साथ इलेक्ट्रॉनिक प्लेटों कुल्ला ।
      3. इलेक्ट्रॉनिक प्लेट्स पर शेष कोशिकाओं को पचाने के लिए 0.25% हौसले से तैयार trypsin के लिए 1-2 एच (200 µ एल/) एक मशीन में 37 ओसी पर । जब पाचन पूरा हो गया है, एक पिपेट का उपयोग कर गर्मी समाधान 5-10 बार मिश्रण और बाहर कमरे के तापमान पर पिपेट में सभी समाधान ।
      4. इलेक्ट्रॉनिक प्लेटें 200 µ एल इथेनॉल और 200 µ l पानी के साथ कुल्ला, क्रमशः, के रूप में इस प्रकार है: जल 2 बार, 100% इथेनॉल 2 बार; 75% इथेनॉल 2 बार; पानी 2 बार । एक बाँझ धुंध या टिशू पेपर पर इलेक्ट्रॉनिक प्लेट पलटना कमरे के तापमान पर शेष पानी के लिए खिचड़ी भाषा ।
      5. पराबैंगनी कमरे के तापमान पर में एक साथ 1-2 एच के लिए पुनर्जीवित इलेक्ट्रॉनिक प्लेट निष्फल ।
        नोट: इलेक्ट्रॉनिक प्लेट L8 के उत्थान के लिए सभी समाधानों की मात्रा दोगुनी हो जाती है ।
  2. केस 2: mesoporous सामग्री का उपयोग कर दवा वितरण ।
    1. दवा वितरण मैट्रिक्स के रूप में 5.6 एनएम के एक औसत ताकना आकार के साथ रॉड की तरह mesoporous सिलिका सामग्री का प्रयोग करें, के रूप में पहले20की सूचना दी ।
      नोट: यहां, इलेक्ट्रॉनिक प्लेट कोशिकाओं पर दवा जारी प्रभाव पर नजर रखने के लिए कार्यरत था ।
      1. इलेक्ट्रॉनिक प्लेटों की एक अच्छी तरह से की मशीन समाधान में mesoporous सामग्री जोड़ें । के रूप में सिलिका सामग्री घुलनशील नहीं हैं और इलेक्ट्रॉनिक प्लेट में हाला, इस प्रकार के रूप में प्लेट कुल्ला:
    2. केस 1 के लिए वर्णित के रूप में 3.1.3.1-3.1.3.3 चरण निष्पादित करें ।
    3. 200 µ l के साथ माइक्रोचिप्स कुल्ला पानी के कमरे के तापमान पर एक बार में ।
    4. कमरे के तापमान पर 200 µ एल निरपेक्ष इथेनॉल 2 बार के साथ माइक्रोचिप्स कुल्ला ।
    5. 200 µ l 75% इथेनॉल के साथ माइक्रोचिप्स कुल्ला कमरे के तापमान पर एक बार ।
    6. एक अच्छी तरह से में 75% इथेनॉल के 250 µ एल जोड़ें और कमरे के तापमान पर सील फिल्म के साथ इलेक्ट्रॉनिक प्लेट सील ।
    7. 2 मिनट के लिए 114 x g पर स्पिन और इलेक्ट्रॉनिक प्लेट खाली । एक बाँझ धुंध या टिशू पेपर पर इलेक्ट्रॉनिक प्लेट पलटना कमरे के तापमान पर शेष पानी के लिए खिचड़ी भाषा ।
    8. दोहराएं चरण 3.2.5-3.2.7 एक बार ।
    9. पराबैंगनी कमरे के तापमान पर में एक साथ 1-2 एच के लिए पुनर्जीवित इलेक्ट्रॉनिक प्लेट निष्फल ।
      नोट: L8 इलेक्ट्रॉनिक प्लेटों को कुल्ला करते समय सभी समाधान की मात्रा दोगुनी करें ।

4. पुनर्जनन प्रभाव का मूल्यांकन

  1. पुनर्जीवित इलेक्ट्रॉनिक प्लेट सतह के ऑप्टिकल विशेषताओं
    1. एक इस्पात चंमच का उपयोग करने के लिए ध्यान से ताजा और पुनर्जीवित इलेक्ट्रॉनिक प्लेट की अच्छी तरह से मशीन के नीचे भाग जुदा है कि सरणी सोने microelectrodes शामिल हैं । एक प्लास्टिक दस्ताने पहने हुए, ध्यान से बाहर इलेक्ट्रॉनिक थाली से माइक्रोचिप युक्त भाग पोंछ स्टील चंमच का उपयोग ।
    2. कांच माइक्रोस्कोप स्लाइड के केंद्र में दोनों भागों प्लेस और रमन स्पेक्ट्रा एक सीसीडी डिटेक्टर के साथ सुसज्जित रमण माइक्रोस्कोप द्वारा इकट्ठा21.
      नोट: स्पेक्ट्रोमीटर एक 633 एनएम लेजर के साथ सुसज्जित किया गया था और स्पेक्ट्रा 30 एस लेजर जोखिम के एक अंतराल पर 500-3500 cm-1की श्रेणी में एक तरंग दैर्ध्य में दर्ज किया गया था । ऑप्टिकल छवियों एक रमन माइक्रोस्कोप द्वारा प्राप्त किया गया एक 10x नेत्र लेंस और 50x उद्देश्य का उपयोग कर । चित्र 1a और चित्रा 1C भी स्थापित रमन माइक्रोस्कोप तंत्र का उपयोग कर प्राप्त किया गया ।
    3. के बाद संलग्न कोशिकाओं की व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए विरोधी कैंसर दवा ताजा और पुनर्जीवित इलेक्ट्रॉनिक प्लेटों पर ले, एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए DOX A549 द्वारा अवशोषित अणुओं की सहज प्रतिदीप्ति की निगरानी ।
      1. कोशिकाओं द्वारा अवशोषित DOX के सहज प्रतिदीप्ति रिकॉर्ड करने के लिए (A549 कोशिकाओं के साथ ताजा और पुनर्जीवित इलेक्ट्रॉनिक प्लेट्स), उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के रूप में एक 63X तेल उद्देश्य और 485 एनएम का उपयोग करें ।
  2. पुनर्जीवित इलेक्ट्रोड के विद्युत व्यवहार
    नोट: के रूप में एक वाणिज्यिक इलेक्ट्रॉनिक प्लेट के मैनुअल dissembling मुश्किल और जांच के रूप में सतह बिजली की स्थिति के आकलन के लिए आदर्श नहीं है, प्रोटोकॉल के उत्थान दक्षता सामान्य सोने का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था/ग्लास कार्बन इलेक्ट्रोड (GCE) एक परीक्षण के रूप में मंच है, जिस पर विद्युत प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी (EIS) प्रदर्शन किया गया. Au इलेक्ट्रोड और GCE के व्यास दोनों 3 मिमी है । विद्युत डेटा एक तीन इलेक्ट्रोड प्रणाली के साथ एक विद्युत विश्लेषक द्वारा प्राप्त किए गए थे और प्रतिबाधा माप एक बारी वर्तमान (एसी) 10 एमवी आयाम के संकेत का उपयोग कर बाहर किए गए थे 100 kHz करने के लिए 0.01 हर्ट्ज के वाइड आवृत्ति रेंज ।
    1. माप से पहले, Au इलेक्ट्रोड और GCE एक दर्पण की तरह सतह के लिए एक चमकाने कपड़े पर एक एल्यूमिना घोल के साथ पॉलिश, पानी में sonication के बाद किसी भी कणों को दूर करने के लिए ।
    2. 4तो 0.5 एम एच2में Au इलेक्ट्रोड को सक्रिय करें । EIS डेटा प्राप्त करें नंगे Au इलेक्ट्रोड और GCE में 10 मिमी KCl इलेक्ट्रोलाइट समाधान 1mM K3[Fe (CN)6] के रूप में वर्णित के रूप में22.
    3. 2.1.2 और 2.1.3 के अनुसार स्टॉक A549 सेल सॉल्यूशन तैयार करें । ड्रॉप 10 Au इलेक्ट्रोड और GCE की सतह पर µ एल सेल निलंबन । मशीन au इलेक्ट्रोड और GCE 3 एच के लिए एक 37 ओसी मशीन में कोशिकाओं के साथ संशोधित au इलेक्ट्रोड और GCE 10 मिमी KCl इलेक्ट्रोलाइट समाधान में कोशिकाओं के साथ संशोधित 1mM K3[Fe (CN)6युक्त EIS डेटा प्राप्त] ।
    4. प्रोटोकॉल और माप EIS का उपयोग कर इलेक्ट्रोड जनरेट करें ।
      1. au इलेक्ट्रोड विसर्जित और GCE 0.5-2 के लिए 0.25% trypsin में कोशिकाओं के साथ संशोधित h. au इलेक्ट्रोड और GCE पानी के साथ नरम 4 बार कुल्ला । 4 बार निरपेक्ष इथेनॉल के साथ धीरे कुल्ला इलेक्ट्रोड । विलय Au इलेक्ट्रोड और GCE के लिए 75% इथेनॉल में ~ 5 min. चिप्स धीरे से 75% इथेनॉल 4 बार के साथ कुल्ला ।
      2. 1mM K3[Fe (CN)6] युक्त 10 मिमी KCl इलेक्ट्रोलाइट समाधान में पुनर्जीवित Au इलेक्ट्रोड और GCE के EIS डेटा प्राप्त करें ।

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Representative Results

सोने माइक्रोचिप्स की सतह गुण: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त पुनर्जनन प्रक्रियाओं चित्रा 1में उल्लिखित किया गया । चित्रा 2 ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप द्वारा ताजा और पुनर्जीवित इलेक्ट्रॉनिक प्लेटों की सूक्ष्म सतह चित्रों से पता चलता है. जैसा कि चित्र 2a और चित्र 2cमें दिखाया गया है, सूक्ष्म टिप्पणियों ने संकेत दिया कि ताजा और इलाज इलेक्ट्रॉनिक प्लेटों के बीच माइक्रोचिप सतह के ऑप्टिकल गुणों में लगभग कोई अंतर नहीं था. कोशिका स्थिति के आकलन के लिए सुविधाजनक कोशिकाओं में शामिल डॉक्सोरूबिसिन अणुओं के सहज प्रतिदीप्ति का उपयोग करना, हम पुनर्जनन के बाद सोने माइक्रोचिप्स पर संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं की एक समान एकरूपता मनाया (चित्र 2 बी और चित्रा 2d ). इसके अतिरिक्त, मशीनी कैंसर कोशिकाओं को इलेक्ट्रॉनिक प्लेट में एक अच्छी तरह से परिभाषित सेलुलर आकृति विज्ञान चिप्स के प्रयोज्य का प्रदर्शन प्रदर्शित किया । चित्रा 3 ताजा और पुनर्जीवित इलेक्ट्रॉनिक प्लेटों के रमन स्पेक्ट्रा से पता चलता है. ताजा और इलाज इलेक्ट्रॉनिक प्लेटों के बीच लगभग समान रमन पीक वितरण सोने की माइक्रोचिप सतह के एक सफल पुनर्जनन प्रक्रिया का संकेत दिया । A549 कोशिकाओं के साथ कवर इलेक्ट्रॉनिक प्लेटों के रमन संकेतों को कुछ हद तक विकृत कर दिया गया, शायद A549 कोशिकाओं के सहज प्रतिदीप्ति से हस्तक्षेप के कारण.

cytotoxicity परख RTCA का उपयोग कर के लिए पुनर्जीवित माइक्रोचिप्स: हमने सेल प्रसार और सामग्री cytotoxicity मूल्यांकन (चित्र 4) के परीक्षण के लिए पुनर्जनन प्रोटोकॉल भी लागू किया है । इष्टतम घनत्व के A549 कोशिकाओं पुनर्जीवित इलेक्ट्रॉनिक प्लेट 16 और वृद्धि काइनेटिक घटता पर वरीयता प्राप्त थे वास्तविक समय सेल विश्लेषक द्वारा दर्ज किया गया । के रूप में चित्रा 4aमें दिखाया गया है, सभी समानांतर प्रयोगात्मक कुओं के परिणामस्वरूप वृद्धि curves पर्याप्त निरंतरता है, जो संकेत दिया है कि इलेक्ट्रॉनिक प्लेट 16 के सतह बिजली की स्थिति बहुत उत्थान के बाद बनाए रखा है दिखाया । पुनर्जीवित इलेक्ट्रॉनिक प्लेट L8 भी mesoporous सिलिका सामग्री का उपयोग cytotoxicity के लिए परीक्षण किया गया था, के रूप में चित्रा 4Bमें दिखाया गया. नियंत्रण प्रयोग के साथ तुलना में, mesoporous सामग्री के CI-इलाज के नमूनों में कुछ हद तक कमी आई, सामग्री का एक मामूली cytotoxicity का संकेत है । इसके अलावा encapsulation और विरोधी के रिलीज mesoporous सामग्री द्वारा Dox के कैंसर की दवा A549 के विकास की अवस्था की एक नाटकीय कमी हुई । इन प्रयोगात्मक परिणाम ताजा इलेक्ट्रॉनिक प्लेट का उपयोग कर के साथ निरंतरता दिखाया और पहले से काम19की सूचना दी है, जो इस प्रस्तावित पुनर्जनन प्रोटोकॉल की दक्षता सत्यापित के साथ.

विद्युत विधियों द्वारा मूल्यांकन दक्षता पुनर्जनन: वाणिज्यिक Au इलेक्ट्रोड और कांची कार्बन इलेक्ट्रोड पुनर्जनन दक्षता के मूल्यांकन के लिए परीक्षण प्लेटफार्मों के रूप में इस्तेमाल किया गया । चित्रा 5 Au इलेक्ट्रोड और GCE कि कैंसर की कोशिकाओं के साथ संशोधित किया गया था की EIS से पता चलता है । यह दिखाया गया है कि इलेक्ट्रोड पर A549 कोशिकाओं की गर्मी के बाद, इलेक्ट्रॉन स्थानांतरण प्रतिरोध की एक स्पष्ट वृद्धि (रेत) नंगे इलेक्ट्रोड के साथ तुलना में मनाया गया था. रेत काफी कम हो गया था के बाद Au इलेक्ट्रोड और GCE चित्रा 5में प्रोटोकॉल के अनुसार इलाज किया गया । दोनों Au इलेक्ट्रोड और GCE की रेत के समान परिवर्तन उनके सतह बिजली के गुणों के बारे में माइक्रोचिप्स के एक प्रभावी और सार्वभौमिक पुनर्जनन प्रक्रिया का संकेत दिया ।

Figure 1
चित्र 1: इलेक्ट्रॉनिक प्लेट्स के उत्थान की प्रक्रिया. एक ठेठ पुनर्जनन चलाने में, चार मुख्य कदम गर्मी कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से धोने, कताई, और पराबैंगनी नसबंदी कदम के बाद इलेक्ट्रॉनिक प्लेटों की सतह पर उनकी टुकड़ी सहित शामिल थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: इलेक्ट्रॉनिक प्लेट्स की सतह गुण. (क) नई इलेक्ट्रॉनिक प्लेटें (ख) A549 कोशिकाओं पर चढ़ाया गया. (ग) पुनः पुनर्जीवित इलेक्ट्रॉनिक प्लेटें (डी) A549 कोशिकाओं सी पर चढ़ाया गया. सोने के माइक्रोचिप्स पर जुड़ी कोशिकाओं के मामले में DOX का इस्तेमाल किया गया । चित्रा 2a और चित्रा 2c Xu, जेड एट अल से संशोधित किया गया है । 19 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: रमन स्पेक्ट्रा अलग इलाज इलेक्ट्रॉनिक प्लेट्स की । (क) नई इलेक्ट्रॉनिक प्लेट । (ख) नई इलेक्ट्रॉनिक प्लेट A549 कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त । (ग) पुनर्जीवित इलेक्ट्रॉनिक प्लेट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: तीन बार पुनर्जीवित इलेक्ट्रॉनिक प्लेटों पर A549 सेल वृद्धि curves. (क) कोशिकाओं के समानांतर विकास घटता इलेक्ट्रॉनिक प्लेट 16 पर वरीयता प्राप्त । (ख) त्रुटि सलाखों के साथ इलेक्ट्रॉनिक प्लेट L8 पर mesoporous सिलिका सामग्री का Cytotoxicity परीक्षण (मानक विचलन, एसटीडी) के प्रत्येक मशीन अच्छी तरह से दर्ज की गई curves की । चित्र 4a Xu, जेड एट अल से संशोधित किया गया है । 19 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: विद्युत प्रतिबाधा स्पेक्ट्रा के विभिन्न संशोधित सोने इलेक्ट्रोड और कांची कार्बन इलेक्ट्रोड (GCE) में 10 मिमी KCl इलेक्ट्रोलाइट समाधान जिसमें 1 mm K3[Fe (CN)6]. (क) अलग इलाज Au इलेक्ट्रोड । (ख) विभिन्न स्वास्थ्यकर्मी GCE. चित्र 5 ए fromXu, जेड एट अल संशोधित किया गया है । 19 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चिप आवेदन उत्थान बफर पुनर्जनन रणनीति
सतह plasmon अनुनाद (SPR) पिरांहा समाधान (केंद्रित एच2तो4/30% एच2ओ2 = 3:1, वी/ पट्टी दोनों analyte और जांच मजबूत ऑक्सीकरण के आधार पर
Piezoelectric Microcantilever सेंसर्स (PEMS) Glycine-एचसीएल मिक्सचर23,24 लक्ष्य-जांच परिसर को अलग कर देना और analyte को दूर करें
उच्च नमक सांद्रता समाधान (2 एम MgCl + 1.5 M Tris)25
सोने की फिल्म 50mM कोह + 25% ज2ओ226 ऑक्सीकरण ऑर्गेनिक्स

तालिका 1: रिपोर्ट पुनर्जनन रणनीति का एक संक्षिप्त सारांश ।

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Discussion

हम कई उपलब्ध विधियों संक्षेप17,23,24,25,26 के लिए तालिका 1में माइक्रोचिप्स reचूकने के लिए । मूलतः, इन तरीकों में शामिल अपेक्षाकृत कठोर प्रयोगात्मक शर्तों क्योंकि मजबूत अणु की उपस्थिति के चिप्स के पूर्ण पुनर्जनन-अणु बातचीत जैसे प्रतिरक्षा SPR चिप्स के लिए इस्तेमाल किया परिसर के रूप में प्राप्त करने के लिए । हालांकि, इन कठोर प्रयोगात्मक शर्तों सरणी सोने RTCA में इस्तेमाल माइक्रोचिप्स की सतह संपत्तियों के लिए अत्यंत हानिकारक हो सकता है । इसलिए, एक हल्के और कुशल विधि प्रस्तुत पुनर्जनन रणनीति के विकास में प्रमुख विचार थे । अंय कारकों है कि समान रूप से महत्वपूर्ण है पर्यावरणीय चिंताओं हैं, क्योंकि इन डिस्पोजेबल माइक्रोचिप्स अक्सर लक्षित कैंसर कोशिकाओं के साथ एक साथ प्रयोग किया जाता है ।

इस प्रोटोकॉल में, हम वाणिज्यिक सरणी सोने RTCA के लिए इस्तेमाल माइक्रोचिप्स फिर से उत्पंन करने के लिए एक सामांय तरीका परिचय । हमारे प्रोटोकॉल trypsin-पाचन और इथेनॉल और पानी के साथ धोने के आधार पर विकसित किया गया था । अतिरिक्त कताई कदम पुनर्जनन प्रक्रिया के लिए परख के लिए इस्तेमाल किया अघुलनशील कणों को दूर करने में प्रभावी माना जाता है । पहले रिपोर्ट तरीकों में इस्तेमाल किया एजेंट के साथ तुलना में, reचूकने retrypsin और इथेनॉल दैनिक प्रयोगशाला उपयोग के लिए आसानी से उपलब्ध है और इन जैविक उत्पादों/रसायनों कम विषाक्तता के हैं, और इस प्रकार माना जाता है पर्यावरण के अनुकूल है, जो पुनर्जनन के प्रयोजनों के लिए वांछनीय है ।

इस प्रोटोकॉल में, महत्वपूर्ण कदम trypsin पाचन सोने माइक्रोचिप्स के पुनर्जनन प्रदर्शन को सुनिश्चित करने के लिए है । एकाग्रता और समय सहित trypsinization का अनुकूलन, उत्थान को प्राप्त करना पहली प्राथमिकता होनी चाहिए । पाचन समय है कि हमारे पिछले रिपोर्ट19, अनुकूलन प्रक्रिया के लिए एक अच्छा आकलन में तर्कसंगत है के अलावा सिर्फ एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सतह संपत्तियों की जांच करने के लिए है ।

एक अंय चिंता का विषय है reचूकने प्रक्रिया के दौरान माइक्रोचिप्स की हैंडलिंग । के रूप में एक पिपेट अक्सर प्रयोग में प्रयोग किया जाता है, ध्यान कर्मियों द्वारा भुगतान किया जाना चाहिए माइक्रोचिप्स की सतह पर टिप scratching से बचने के लिए । इसके अलावा, यह करने के लिए पूर्व सुझावों, धुंध निष्फल, और पुनर्जनन दक्षता सुनिश्चित करने के लिए चंमच फायदेमंद है । पिछले नहीं बल्कि कम से कम, पुनर्जनन प्रक्रिया एक सुरक्षा डाकू में आयोजित किया जाना चाहिए किसी भी संक्रमण से बचने के लिए ।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पुनर्जनन प्रोटोकॉल में शामिल कुल्ला प्रक्रियाओं मैंयुअल रूप से आयोजित की जाती हैं, जो अनिवार्य रूप से अलग कर्मियों के कारण पूर्वाग्रह का कारण होगा । इस सीमा को दूर करने के लिए, स्वचालित या अर्द्ध स्वचालित उपकरणों धोने प्रयोजनों के लिए कस्टम डिजाइन, मॉड्यूलर इलेक्ट्रॉनिक इस्तेमाल किया प्लेटों पर विचार किया जा सकता है । इसके अलावा, पुनर्जनन प्रोटोकॉल के लिए सेल आधारित परख के लिए प्रभावी होना परीक्षण किया गया है । हालांकि, मजबूत आणविक बातचीत की उपस्थिति में, जैसे चिप्स के इंटरफेस पर एंटीबॉडी-प्रतिजन गठन, प्रस्तावित पुनर्जनन शर्तों काफी हद तक सीमित हो सकता है और अपेक्षाकृत मजबूत बफर स्थितियों पर विचार किया जाना चाहिए ।

कुल मिलाकर, वर्तमान पुनर्जनन प्रोटोकॉल जैसे Au और कांची कार्बन इलेक्ट्रोड के रूप में वाणिज्यिक सोने माइक्रोचिप्स, के रूप में अच्छी तरह से अंय आयोजित इलेक्ट्रोड के दोहराया उपयोग की अनुमति का परीक्षण किया गया है । हमें उंमीद है कि इस प्रोटोकॉल के आवेदन वास्तविक समय चिप आधारित सेल परख की उच्च चल रही लागत पर बचाने के लिए होगा । लंबे समय में, माइक्रोचिप आधारित परख और अक्सर proteomic और सेलुलर विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है और इस अध्ययन में प्रस्तावित प्रोटोकॉल पुनर्जनन के लिए एक विकल्प की पेशकश कर सकते हैं, जिसमें स्वचालित या धोने के लिए अर्द्ध स्वचालित उपकरण हो सकता है डिजाइन और संचित डिस्पोजेबल चिप्स के मामलों में लागू किया ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य को राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन ऑफ चाइना (U1703118) द्वारा समर्थित किया गया था, जो कि Jiangsu उच्चतर शिक्षा संस्थानों (PAPD), Jiangsu Shuangchuang प्रोग्राम, राज्य कुंजी की खुली निधियों के प्राथमिकता वाले अकादमिक कार्यक्रम विकास द्वारा वित्तपोषित परियोजना Chemo/संवेदन और Chemometrics (२०१६०१५) और Biomacromolecules (2017kf05) और Jiangsu विशेष रूप से नियुक्त प्रोफेसर परियोजना, चीन की राष्ट्रीय प्रयोगशाला के लिए प्रयोगशाला ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat: Sprague-Dawley Charles River Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) Bio-Rad Cat# MCA275R Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1  Abcam Cat# AB5076 Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67  Abcam  Cat# AB15580 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 Invitrogen Cat# 11055 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 Invitrogen Cat# A-21203 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 Invitrogen Cat# A-31573 Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining) Thermo Fisher Cat# 28313
Heparan sulfate Galen Laboratory Supplies Cat# GAG-HS01
Heparin Sigma  Cat# M3149
Peptone from milk solids Sigma Cat# P6838
TGF-β2 Peprotech Cat# 100-35B
Murine IL-34 R&D Systems Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol Avanti Polar Lipids Cat# 700000P
Collagen IV Corning  Cat# 354233
Oleic acid Cayman Chemicals  Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid Cayman Chemicals  Cat# 20606
Calcein AM dye Invitrogen Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1 Invitrogen Cat# E1169
DNaseI Worthington Cat# DPRFS
Percoll PLUS GE Healthcare Cat# 17-5445-02
Trypsin  Sigma Cat# T9935
DMEM/F12 Gibco Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin Gibco Cat# 15140-122
Glutamine Gibco Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine  Sigma Cat# A9165
Insulin Sigma Cat# 16634
Apo-transferrin  Sigma Cat# T1147
Sodium selenite Sigma Cat# S-5261
DMEM (high glucose) Gibco Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G Southern Biotech Cat# 0100-20 
Poly-D-Lysine  Sigma Cat# A-003-E
Primaria Plates  VWR Cat# 62406-456
Stock reagents  reconstitution  Concentration used Storage
Apo-transferrin 10 mg/mL in PBS  1:100 -20°C
N-acetyl cysteine 5 mg/mL in H2O  1:1,000 -20°C
Sodium selenite 2.5 mg/mL in H2O  1:25,000 -20°C
Collagen IV 200 μg/mL in PBS  1:100 -80°C
TGF-b2 20 μg/mL in PBS  1:10,000 -20°C
IL-34 100 μg/mL in PBS  1:1,000 -80°C
Ovine wool cholesterol 1.5 mg/mL in 100% ethanol  1:1,000 -20°C
Heparan sulfate 1 mg/mL in H2O 1:1,000 -20°C
Oleic acid/Gondoic acid Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol  1:1,000 -20°C
Heparin 50 mg/mL in PBS  1:100 -20°C
Solutions  Recipe  Comments
Perfusion Buffer 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Use when ice-cold
Douncing Buffer 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Use when ice-cold
Panning Buffer 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM) DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)  MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. 

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References

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जैव रसायन 133 अंक लेबल मुक्त सेल आधारित परख पुनर्जनन सरणी गोल्ड microelectrodes वास्तविक समय सेल विश्लेषक trypsin
सरणी गोल्ड Microelectrodes के पुनर्जनन एक वास्तविक समय सेल विश्लेषक के लिए सुसज्जित
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Xu, Z., Song, Y., Jiang, H., Kong,… More

Xu, Z., Song, Y., Jiang, H., Kong, Y., Li, X., Chen, J., Wu, Y. Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer. J. Vis. Exp. (133), e56250, doi:10.3791/56250 (2018).

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