Summary
이 프로토콜 높은 실행 비용 ofmicrochip 기반 분석에 절약 목적으로 레이블 없는 세포 분석기 장착 상업 기준점과 골드 microelectrodes를 다시 생성 하는 일반적인 전략을 설명 합니다. 재생성 프로세스 트립 신 소화, 에탄올과 물, 그리고 마이크로 칩의 반복된 사용을 가능 하 게 회전 단계와 rinsing 포함 되어 있습니다.
Abstract
레이블 없는 세포 기반 분석 결과 유리한 그것 때문에 생 화 확 적인 연구 실험 동물의 사용을 요구 하지 않습니다. 고아 한 생 화 확 적인 분석 실험 보다 생리 적 조건 하에서 세포에 대 한 보다 동적인 정보를 제공 하는 기능 때문이 라벨 무료 실시간 셀 분석 결과 전기 임피던스 원리에 따라 과거 동안 더 많은 관심 유치는 10 년입니다. 그러나, 그것의 실용적인 활용 비싼 소모품 일회용 골드 마이크로칩이 세포 분석기에 사용 되는 측정의 상대적으로 비싼 비용으로 인해 제한 된 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 상업 레이블 없는 세포 분석기 장착 기준점과 골드 microelectrodes를 다시 생성 하는 일반적인 전략을 개발 했습니다. 재생성 프로세스 트립 신 소화, 에탄올과 물, 그리고 회전 단계와 rinsing 포함 되어 있습니다. 제안 된 메서드는 테스트 되었고 세 번 이상 중생 및 상업적인 전자 번호판의 반복된 사용에 대 한 효과적인 것으로 표시 실시간 세포 분석 실험의 높은 운영 비용에 저장 연구를 도움이 될 것입니다.
Introduction
레이블 없는 셀 기반 기술 proteomics1,2의 측면에서와 같은 분석으로 검사 목적을 위해 지난 10 년간 급속 한 성장을 목격 했다 때문에 그것의 효율적인 갈수록 많은 실험 과정, , 마약 배달3, 등4,5 비교 셀 분석, 프로토 이전 Giaever 및 동료에 의해 개발 된6 라벨 무료 실시간 세포 분석 실험 목적으로 전통적인 생 화 확 적인 방법으로 정량 방식으로 세포 성장 또는 마이그레이션의 연속 측정을 허용 하는 셀에 연결 된 마이크로 칩의 표면에 전기 신호 변화를 기록 하는 원칙에 기반. 이 전략에 따라 실시간 셀 전기 임피던스 기반 탐지 원리를 사용 하 여 (RT-CES) 시스템은 도입된7,8 그리고 더 최근의 상업 실시간 세포 분석기 (RTCA) 감지 전자 출범 실험실 연구9에 대 한.
상업 실시간 세포 분석기 주로 incubated 세포 등 세포 증식, 마이그레이션, 생존, 형태학, 준수에의 생리 적 변화에서 결과 전기 임피던스의 evoked 신호에 세포 읽는다 고 마이크로 칩10,11의 표면. 이러한 전기 신호는 더 셀 상태를 평가 하기 위해 셀 인덱스 (CI) 라는 크기가 없는 매개 변수 변환 분석기. 마이크로 칩의 임피던스의 변화는 주로 전극/솔루션 인터페이스에 대상된 셀의 로컬 이온 환경을 반영합니다. 따라서, 세포 분석기의 분석 성능 핵심 감지 장치, 일회용 마이크로 (즉, 소위 전자 판, 예를 들어, 96/16/8-잘), 기준점과 골드 microelectrodes로 만들어진에 크게 의존 있고 외피 우물의 바닥에 인쇄. 금 microelectrodes 원에 선 형식 (그림 1)에서 조립 및 연결 된 셀3,12,13의 역동적이 고 민감한 탐지를 허용 하는 인큐베이션 우물의 표면적의 대부분을 커버 ,14. CI의 셀 칩, 더 많은 표면 적용의 경우 증가 하 고 세포 apoptosis의 결과로 toxicant에 노출 되 면 감소. 일회용 전자 격판덮개는 물가가 가장 비싼는 비록 실시간 세포 분석기 자주 사용 세포 독성11 neurotoxicity15 결정 클래식 끝점 방법 보다 더 많은 운동 정보를 제공 하 소모품입니다.
지금까지, 아니 사용할 수 있는 메서드는 아마도 사실은 피 솔루션 또는 초 산 등의 가혹한 재생 조건 관련된16,17, 는 전자 판의 재생을 위한 되었습니다. 18, 하 금 마이크로 칩의 전기 상태를 변경할 수 있습니다. 따라서, 골드 칩의 표면에서 부착 세포와 다른 물질을 제거 하는 온화 하 고 효율적인 방법 전자 판 재생 프로세스에 대 한 바람직한 것입니다. 우리는 최근 일회용 전자 번호판 비 부식성 시 약을 사용 하 여 재생 하기 위한 프로토콜을 개발 하 고 재생성된 칩 광학 뿐만 아니라 전기 화학 방법19특징 이었다. 트립 신, 에탄올 등 쉽게 구할 수 있고 온건 실험실 시 약을 사용해 서, 우리는 두 가지 주요 유형 생성에 성공적으로 적용 되는 불리 한 효과 없이 상업적인 전자 접시를 다시 생성 하는 일반적인 방법 설립 전자 판의 RTCA (16, L8) 사용.
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Protocol
주: 일반적으로, 재생성 프로세스 포함 한다 트립 신 소화와 에탄올과 물으로 헹 구는 단계. 소화 시간이 사용 하는 셀의 수에 따라 변경 하 고 사용 하는 셀의 수는 실험 목적에 따라 다를 수 있습니다. 광학 및 전기 화학적 방법을 사용 하 여 재생 조건 최적화 재생성 된 마이크로 칩을 확인 하는 것이 좋습니다. 실험 기간 동안 가용성과 불용 성 화학 물질 관련 되어있을 수 있습니다, 그리고 여기 재생 절차의 두 가지 일반적인 경우가 자세히 나와 있습니다.
1입니다. 재생 솔루션의 준비
참고: 준비 하 고 무 균 조건 하에서 모든 솔루션을 처리.
- 신선한 0.25% (g/v) trypsin 솔루션을 준비 합니다. 트립 신 구입 하거나 갓 다음과 같이 준비 될 수 있습니다.
- 트립 신 pH 7.4 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 100 ml의 0.25 g을 분해.
- 트립 신 완전히 어떤 거품 형성을 방지 하도록 낮은 속도로 솔루션 4 oC. 볶음에 해산 될 때까지 솔루션을 저 어.
- Biosafety 두건에서 0.22 μ m 필터 솔루션을 필터링 합니다.
- 절대 에타 놀을 사용 하 여 75% 에탄올을 준비 합니다. 절대 에탄올 75 mL 부피 플라스 크에 부 어 하 고 볼륨 100 mL에 도달할 때까지 이온된 수를 추가 합니다. 필요한 경우 더 살 균을 수행 합니다.
2. 부 화 및 전자 번호판에 A549 세포의 확산
참고: 전자 판 16 형식과 L8는 모두 만든 기준점과 골드 microelectrodes 외피 우물의 바닥에 있고 인쇄의. 전자 판 L8 8 웰 스는 전자 판 16 16 웰 스는. 16 전자 판의 우물이 라운드 동안 전자 판의 L8 우물이 둥근된 사각형. 8 각 전자 판의 볼륨 잘 약 830 µ L 이며 각 전자 판 16 잘 약 270 µ L입니다.
- A549 세포 배양
- 로스웰 파크 기념 연구소-1640 매체 (RPMI-1640) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 보충에 문화 A549 세포 세포 배양에서 페니실린 스 요리.
- 셀 밀도 ~ 75%에 도달 하면 세포를 통과 다음 1 × PBS 부착 셀 레이어를 세척 하 고 세포를 트립 신을 제거 하 5 분에 대 한 179 × g에서 0.25 %trypsin 솔루션 37 oC. 원심 분리기에서 1 분 동안 trypsinize. 10 mL 매체 더 문화에 대 한 셀 이나 다른 실험 resuspend.
참고: 셀 중간에 resuspended의 솔루션은 여기 셀 서 스 펜 션 버퍼로 지정 됩니다. - 10 µ L에 밖으로가 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산. RPMI-1640 매체를 사용 하 여 셀 서 스 펜 션 버퍼 30000-80000 셀/mL 셀 서 스 펜 션 버퍼는 실험에 대 한 준비를 더 희석.
-
확산/세포 독성 실험 및 데이터 수집
- 전자 판 16 및 두고는 biosafety에 30 분 동안 평형에 대 한 후드의 각 화를 50 µ L (150 µ L 전자 접시 L8) 셀 매체를 추가 합니다. 수동으로 실시간 세포 분석기 37 oc.에 CO2 배양 기에서 16 전자 플레이트를 삽입
- 컴퓨터에서 실시간 세포 분석기 프로그램을 시작 합니다. 그것의 기본에 실험 패턴 설정 페이지 "모델 실험" 선택 하 고 이름을 실행 분석 결과.
- 레이아웃 페이지에 해당 우물 실험에 포함 된 편집 상자에 셀 유형, 수 및 마약 이름 같은 정보를 입력을 선택 합니다. 일정 페이지에서 실험 단계 추가 다음 각 단계 및 실시간 데이터 수집 간격의 실행 시간 (예를 들어,: 12, 24 또는 48 h)를 선택 합니다.
참고: 여기, 단계 1과 2의 간격은 1 분 및 15 분 후. - 파일을 저장 하 고;의 셀 인덱스 페이지에 미디어의 배경 임피던스를 측정 하기 위해 "시작" 버튼을 클릭 결과 데이터는 자동으로 공제 됩니다. 그래프 잘 페이지에 모든 잘 곡선을 방문 수 있습니다. 음모 페이지에 추가 우물과 시간 셀 인덱스의 그래프를 보여주는 것입니다.
- 셀 확산 실험을 위해 첫째로 프로그램을 일시 중지 하려면 "일시 정지" 버튼을 클릭 합니다. 그리고 전자 접시 꺼내 실 온에서 잘 당 100 µ L A549 세포 현 탁 액 버퍼를 추가 합니다. 셀 부 화 우물의 바닥에 정착 하도록 biosafety 두건에서 30 분 동안 접시를 남겨 주세요.
- 실시간 세포 분석기 역에서 전자 접시를 수동으로 삽입 합니다. 실험을 계속 "시작" 버튼을 클릭 합니다.
참고: 음모 페이지 분석기 지속적으로 기록 셀 인덱스 값 또는 실험을 통해 곡선. - 실험 완료 되 면 음모 페이지를 입력 하 고 실험 파일을 엽니다. 모든 테스트 인큐베이션 우물과 평균 수 또는 의약품 추가 또는 분석 실험 사이 변이 줄이기 위해 매체를 변경 하기 전에 마지막으로 정규화 결과 셀 인덱스 커브를 선택 합니다. 데이터 분석 페이지에 EC50 또는 IC50는 산출 될 수 있다
3입니다. 전자 번호판의 재생
참고: 각 헹 구는 단계에 대 한 전자 판에 솔루션 혼합 철저 하 게 (5-10 배)를 피 펫을 사용 하 여.
-
사례 1: 대 한 세포 독성 평가 안티 -암 약물
- 2 절에서 설명한 대로 전자 판에 씨앗 A549 세포.
- 먼저 셀 중간에 항 암 약물 독 소 루비 염 (DOX) 해산. 천천히 (DOX의 최종 농도 30 µ g/mL)는 세포에 DOX를 추가 피 펫을 사용 하 여. 2 절에 설명 된 대로 CI를 기록 합니다.
참고: 사용 하는 전자 판 실험 완료 후 즉시 생성 했다. 이 경우에, DOX는 녹는 화학 프로토콜에 따라 전자 판의 재생은 상대적으로 쉽게 처리 하 고 아무 추가 단계는 필요. -
재생
- 실시간 세포 분석기 역에서 세포를 포함 하는 전자 접시를 꺼내. 실내 온도에서 살 균 biosafety 두건에서 사용된 전자 접시를 놓고 문화 매체를 피 펫을 사용 하 여 철저 하 게 혼합 합니다. 모든 매체에 밖으로 플라스틱.
- 실 온에서 3 번 전자 번호판 200 µ L 이온된 물으로 린스.
- 1-2 h 37 oc.에 인큐베이터에 (200 µ L/물론)에 대 한 신선한 0.25 %trypsin 전자 판에 남아 있는 세포를 소화 소화 완료 되 면 5-10 시간 사용 하 여 피 펫 및 모든 솔루션을 피펫으로 실 온에서 biosafety 두건에서 부 화 솔루션을 혼합.
- 각각, 다음과 같이 200 µ L 에탄올 및 200 µ L 물, 전자 플레이트 린스: 이온된 수 2 회, 100% 에탄올 2 회; 75% 에탄올 2 번; 저온 2 번. 멸 균 거 즈 또는 실내 온도에 나머지 물을 가만히 따르다 휴지에 전자 접시 반전.
- 자외선 소독 biosafety 후드 실 온에서 1-2 h에 대 한 재생된 전자 판.
참고: L8 전자 판의 재생에 대 한 모든 솔루션의 볼륨을 두 번.
-
사례 2: 마약 배달 mesoporous 소재를 사용 하 여입니다.
- 5.6의 평균 기 공 크기 막대 같은 mesoporous 실리 카 재료를 사용 하 여 이전에 보고 된20마약 배달 매트릭스로 nm.
참고: 여기, 전자 판 세포에 약물 방출 효과 모니터링 하는 데 고용 되었다.- 전자 판 각의 부 화 솔루션으로 mesoporous 자료를 추가 합니다. 실리 카 재료 가용성과 전자 판에서 촉진 되지 않는, 접시 같이 씻어.
- 사례 1에 설명 된 대로 단계 3.1.3.1-3.1.3.3를 수행 합니다.
- 실 온에서 biosafety 두건에서 200 µ L 이온된 물으로 마이크로 칩을 한 번 린스.
- 실 온에서 200 µ L 절대 에탄올과 마이크로 2 번을 씻어.
- 실 온에서 200 µ L 75% 에탄올과 마이크로 칩을 한 번 씻어.
- 각 잘에서 75% 에탄올의 250 µ L을 추가 하 고 실 온에서 씰링 필름 전자 접시를 봉인.
- 2 분 동안 114 x g에서 회전 시키십시오 그리고 전자 판 빈. 멸 균 거 즈 또는 실내 온도에 나머지 물을 가만히 따르다 휴지에 전자 접시 반전.
- 한 번 3.2.5-3.2.7 단계를 반복 합니다.
- 자외선 소독 biosafety 후드 실 온에서 1-2 h에 대 한 재생된 전자 판.
참고: L8 전자 번호판을 rinsing 때 모든 솔루션의 볼륨을 두 번.
- 5.6의 평균 기 공 크기 막대 같은 mesoporous 실리 카 재료를 사용 하 여 이전에 보고 된20마약 배달 매트릭스로 nm.
4입니다. 재생 효과의 평가
-
재생성 된 전자 플레이트 표면의 광학 특성
- 사용 강철 신선한의 외피의 하단 부분을 신중 하 게 분해 숟가락과 전자 플레이트 포함 된 재생성 짓고 금 microelectrodes. 플라스틱 장갑을 착용, 신중 하 게 강철 스푼을 사용 하 여 전자 판에서 마이크로 칩이 포함 된 부분을 닦으십시오.
- 유리 현미경 슬라이드의 가운데에 두 부분을 놓고21CCD 검출기 장착 하는 라만 현미경으로 결과 라만 스펙트럼을 수집 합니다.
참고:는 분석기 633 nm 레이저 장착 했다 고 스펙트럼 파장 500-3500 c m-1의 범위에서 30 s 레이저 노출의 간격에 기록 되었다. 광학 이미지 라만 현미경으로 10 배 눈 렌즈 50 x 목표를 사용 하 여 얻은 했다. 그림 1A 와 그림 1C 또한 설치 된 라만 현미경 장치를 사용 하 여 얻은 했다. - 신선 하 고 재생성에 항 암 약물 이해 후 연결 된 세포의 생존 능력을 평가 하 전자 번호판, 사용 confocal 레이저 스캐닝 현미경 DOX 분자 A549 흡수의 자발적인 형광을 모니터링 하.
- 셀 (신선 하 고 재생성 전자 번호판 A549 세포)를 사용 하 여 흡수 DOX의 자발적인 형광을 기록 하는 63 X 객관적이 고 485 nm 여기 파장으로 오일.
-
재생성 된 전극의 전기 화학 행동
참고: 상업 전자 판의 수동 숨기는 어렵고 확인 표면 전기 상태의 평가 대 한 좋지 않은, 프로토콜의 재생 효율은 평가 테스트로 일반 골드/유리 탄소 전극 (GCE)를 사용 하 여 플랫폼, 전기 화학 임피던스 분광학 (EIS) 수행 되었다. Au 전극 및 GCE의 직경 3 m m. 전기 데이터 3 전극 시스템으로 전기 화학 분석기에 의해 가져온는 임피던스 측정에서 10 mV 진폭의 교류 전류 (AC) 신호를 사용 하 여 실시 했다는 넓은 주파수 0.01 hz에서 100 kHz의 범위.- 측정 전에 모든 입자를 제거 하는 물에서 쥡니다 뒤 닦는 피복에는 알 루미나 슬러리와 거울 같은 표면에 Au 전극과 GCE 폴란드어.
- 그래서 0.5 M H2에서 Au 전극 활성화4. 설명된22로 10 m m 1 m K m3[Fe(CN)6] 포함 된 KCl 전해질 솔루션 맨 Au 전극과 GCE의 EIS 데이터를 가져옵니다.
- 2.1.2 및 2.1.3 재고 A549 세포 솔루션을 준비 합니다. Au 전극과 GCE의 표면에 10 µ L 세포 현 탁 액을 드롭. Au 전극 및 GCE 3 h. Au 전극의 얻을 EIS 데이터에 대 한 37 oC 인큐베이터에서 셀 수정 GCE에 10mm KCl 전해질 솔루션 1 m m K3[Fe(CN)6]를 포함 하는 셀으로 품 어.
-
전극을 측정 EIS 및 프로토콜을 사용 하 여 다시 생성 합니다.
- Au 전극 담가 그리고 GCE 셀 수정 0.5-2 0.25 %trypsin h. Au 전극과 GCE 부드럽게 물으로 씻어 4 번. 린스 부드럽게 절대 에탄올과 전극 4 번. Au 전극 immerge와 ~ 5 분에 대 한 75% 에탄올에 GCE 린스 75% 에탄올과 부드럽게 칩 4 번.
- 10mm KCl 전해질 솔루션 1 m K m3[Fe(CN)6] 포함 된 재생성 Au 전극과 GCE의 EIS 데이터를 가져옵니다.
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Representative Results
골드 마이크로 칩의 표면 특성:이 프로토콜에 사용 되는 재생 절차는 그림 1에 설명 했다. 그림 2 는 미세한 표면 신선한의 사진 및 광학 현미경에 의해 전자 번호판을 다시 생성. 같이 그림 2A 에 그림 2C, 현미경 관찰 표시 했음을 사실상 마이크로 칩의 광학 속성에 차이가 신선한 사이 표면 하 고 전자 번호판을 취급. 셀 상태의 평가 대 한 편리한 셀에 포함 된 독 소 루비 분자의 자발적인 형광을 사용 하 여, 우리 (그림 2B 와 그림 2D 재생성 후 골드 마이크로 칩에 배양된 세포의 유사한 동질성을 관찰 ). 또한, incubated 암 세포 칩의 재사용을 보여주는 전자 판에 잘 정의 된 세포 형태를 표시 합니다. 그림 3 은 라 신선 하 고 재생성 전자 번호판의 스펙트럼을 보여준다. 신선 하 고 대우 전자 번호판 사이 거의 동일 라만 피크 배포판 골드 칩 표면의 성공적인 재생 과정을 가리킨다. 전자 번호판 A549 세포로 덮여의 라만 신호 A549 세포의 자발적인 형광에서 간섭 때문에 아마 어느 정도 왜곡 됐다.
RTCA를 사용 하 여 세포 독성 분석 결과 대 한 마이크로 칩을 재생성: 우리는 또한 세포 확산 및 소재 세포 독성 평가 (그림 4)의 테스트에 대 한 재생 프로토콜을 적용. 최적의 밀도의 A549 세포 재생성된 전자 판 16에 시드 했다 그리고 성장 운동 곡선 실시간 세포 분석기에 의해 기록 되었다. 에 표시 된 그림 4A, 병렬 실험 우물 보여 적절 한 일관성의 모든 결과 성장 곡선으로는 표면 전기 상태의 전자 판 16는 재생성 후 유지 크게 표시. 재생성 된 전자 판 L8 또한 그림 4B와 같이 mesoporous 실리 카 재료를 사용 하 여 세포 독성에 대 한 테스트를 했다. 제어 실험과 비교해, mesoporous 자료 처리 샘플의 CI 감소 어느 정도까지, 자료의 약간의 세포 독성을 나타내는. 더 캡슐화 및 mesoporous 물자에 의해 Dox의 항 암 약물의 릴리스 A549의 성장 곡선의 극적인 감소를 발생합니다. 이러한 실험 결과 일관성과 신선한 전자 번호판을 사용 하 여 작업을 이전에 보고 된19이 제안 된 재생 프로토콜의 효율성을 확인 했다.
재생 효율 전기 화학적 방법에 의해 평가: 상업적인 Au 전극 및 유리 탄소 전극의 재생 효율 평가 위한 테스트 플랫폼으로 사용 되었다. 그림 5 는 EIS의 Au 전극 및 암 세포와 수정 된 GCE를 보여준다. 그것은 전극에 A549 세포의 부 화 후는 표시 했다, 전자 이동 저항 (Ret) 분명 증가 맨 전극의 비교 관찰 되었다. Au 전극와 GCE 그림5에서 프로토콜에 따라 치료 후는 Ret는 크게 감소 했다. 모두 Au 전극의 Ret 및 GCE의 유사한 변화는 그들의 표면 전기 속성에 대 한 마이크로 칩의 효과적이 고 보편적인 재생 과정 표시.
그림 1: 전자 번호판의 재생성 과정. 일반적인 재생 실행에서 4 개의 주요 단계 셀 rinsing, 회전, 및 자외선 살 균 단계 전자 번호판의 표면에 그들의 초연 잠복기 등 참여 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 전자 번호판의 표면 특성. (A) (B) A549 세포 A. (C) 재생성 전자에 도금 했다 새로운 전자 번호판 플레이트 (D) A549 세포 c 도금 했다 골드 마이크로 칩에 연결 된 셀의 경우 DOX 사용 되었다. 그림 2A 와 그림 2C 쑤, Z. 외 에서 수정 된 19 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 다른의 라만 스펙트럼 처리 전자 판. (A) 새로운 전자 플레이트입니다. (B) 새로운 전자 플레이트 A549 세포와 시드. (C) 전자 판 생성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: A549 세포 성장 곡선 3 시간 재생된 전자 번호판에. ((A)) 병렬 전자 접시 16에 시드 셀의 성장 곡선. (B) 전자 판 L8 잘 각 외피의 기록 된 곡선의 오차 막대 (표준 편차, 표준)에 mesoporous 실리 카 물질의 세포 독성 테스트 합니다. 그림 4A 쑤, Z. 외 에서 수정 되었습니다. 19 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 전기 화학 임피던스 스펙트럼의 다른 수정 골드 전극 및 유리 탄소 전극 (GCE) 10mm KCl 전해질 솔루션 1 m K m3[Fe(CN)6] 포함 된. (A) 다른 Au 전극 처리. (B) 다른 GCE 취급. 그림 5A 되었습니다 수정된 fromXu, Z. 외. 19 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
칩 응용 프로그램 | 재생 버퍼 | 재생 전략 |
표면 플라스몬 공명 (SPR) | 피 라 솔루션 (H2이렇게 집중430% H2O2 = 3:1, v/v)17 | 분석 및 프로브 강한 산화에 따라 스트립 |
Microcantilever 압 전 센서 (PEMS) | 글리신-HCl 혼합물23,24 | 대상-프로브 복잡 한 해리와 실정이 제거 |
높은 소금 농도 솔루션 (2 M MgCl2 + 1.5 M Tris)25 | ||
금 영화 | 50mm 코 + 25% H2O226 | 산화 된 유기 물 |
표 1: 보고 재생 전략의 간략 한 요약.
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Discussion
우리는 몇 가지 가능한 방법17,23,24,25,26 표 1에 마이크로 칩을 다시 생성에 대 한 요약. 기본적으로, 이러한 방법은 상대적으로 가혹한 실험 조건 면역 단지 SPR 칩에 사용 되는 등 강한 분자-분자 상호 작용의 존재 때문에 칩의 완전 한 재생을 달성에 참여. 그러나, 이러한 가혹한 실험 조건 RTCA에 사용 되는 기준점과 골드 마이크로 칩의 표면 특성에 대 한 매우 해로울 수 있습니다. 따라서, 온화 하 고 효율적인 방법을 제시 재생 전략의 개발에 주요 고려 했다. 동등 하 게 중요 한 다른 요소는 이러한 일회용 마이크로 표적된 암 세포와 함께 자주 사용 되는 때문에 환경 문제입니다.
이 프로토콜에서 RTCA 사용 상업 기준점과 골드 마이크로 칩을 다시 생성 하는 일반적인 방법을 소개 합니다. 우리의 프로토콜 트립 신 소화와 에탄올과 물으로 rinsing에 따라 개발 되었다. 추가 회전 단계 재생 프로세스에 대 한 분석 결과 대 한 사용 하는 불용 성 입자를 제거에 효과적인 것으로 간주 됩니다. 이전에 보고 된 방법에 사용 되는 시 약에 비해, 재생 시 약 trypsin 및 에탄올 매일 실험실 사용을 위해 쉽게 사용할 수 있으며 이러한 생물 제품/화학 물질 낮은 독성의 고 따라서 간주 됩니다. 환경 친화적인 재생의 목적을 위해 바람직하지입니다.
이 프로토콜에서 중요 한 단계는 골드 마이크로 칩의 재생 성능을 보장 하기 위해 트립 신 소화입니다. Trypsinization, 농도, 시간, 등의 최적화 재생 달성을 최우선 해야 합니다. 소화 시간을 우리의 이전 보고서19에 합리화 외 최적화 과정에 대 한 좋은 평가 광학 현미경을 사용 하 여 표면 특성을 확인 하기 단순히 이다.
또 다른 관심사는 재생 과정에서 마이크로 칩의 처리 이다. 로 피 펫은 실험에 사용, 주의 팁 마이크로 칩의 표면에 긁힘 방지 하기 직원에 의해 지불 되어야 합니다. 또한, 팁, 거 즈, 그리고 재생 효율을 보장 하기 위해 숟가락을 미리 소독 유리 하다. 마지막으로, 어떤 오염 든 지 피하기 위하여 biosafety 두건에서 재생성 프로세스를 수행 해야 합니다.
그것을 rinsing 프로세스 재생 프로토콜에 관련 된 실시 하는 수동으로, 필연적으로 발생 하지 바이어스 때문에 서로 다른 직원을 주목 한다. 이 제한을 극복 하기 위해 목적을 rinsing에 대 한 자동 또는 반자동 장비 수 사용자 지정 설계, 모듈형 전자 번호판 사용을 고려. 또한, 재생 프로토콜 세포 기반 분석에 대 한 효과적인 것으로 테스트 되었습니다. 그러나, 칩, 인터페이스에서 항 체-항 원 형성 등 강한 분자 상호 작용의 제안된 재생 조건 좋은 정도로 제한 될 수 있습니다 고 상대적으로 강한 버퍼 조건을 고려해 야 합니다.
전반적으로, 현재 재생 프로토콜 상업 골드 마이크로 칩으로 누구나 같은 다른 지휘 전극 및 유리 탄소 전극의 반복된 사용을 허용 하도록 테스트 되었습니다. 우리는이 프로토콜의 응용 프로그램 실시간 칩 기반 세포 분석 실험의 높은 운영 비용에 저장할 것 이라는 점을 기대 한다. 긴 안목으로 보면, 마이크로 칩 기반 분석 휴대 및 proteomic 분석에 더 자주 사용 되 고는 및 수 rinsing에 대 한이 연구에서 제안 된 프로토콜을 자동 또는 반자동 장비에서 재생을 위한 옵션을 제공할 수 있습니다. 축적 된 일회용 칩의 설계에 적용 된 경우.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
일 국가 자연 과학 재단의 중국 (U1703118), 프로젝트 우선 순위 학술 프로그램 개발의 장쑤 등 교육 기관 (PAPD), 강 소 Shuangchuang 프로그램, 주 키의 오픈 펀드 자금에 의해 지원 되었다 화학/바이오 센 싱 및 Chemometrics (2016015)와 Biomacromolecules (2017kf05)의 국가 연구소 및 Jiangsu Specially-Appointed 교수 프로젝트, 중국의 실험실
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
Stock reagents | reconstitution | Concentration used | Storage |
Apo-transferrin | 10 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
N-acetyl cysteine | 5 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
Sodium selenite | 2.5 mg/mL in H2O | 1:25,000 | -20°C |
Collagen IV | 200 μg/mL in PBS | 1:100 | -80°C |
TGF-b2 | 20 μg/mL in PBS | 1:10,000 | -20°C |
IL-34 | 100 μg/mL in PBS | 1:1,000 | -80°C |
Ovine wool cholesterol | 1.5 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
Heparan sulfate | 1 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
Oleic acid/Gondoic acid | Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
Heparin | 50 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
Solutions | Recipe | Comments | |
Perfusion Buffer | 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) | Use when ice-cold | |
Douncing Buffer | 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ | Use when ice-cold | |
Panning Buffer | 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
Microglia Growth Medium (MGM) | DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite | Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. | |
Collagen IV Coating | MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
Myelin Seperation Buffer | 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 | Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 | |
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid | Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
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